专利名称：一种从双胸蚓中提取胶原酶的方法
技术领域：
本发明属生物化学酶学领域，具体涉及一种从双胸蚓中提取胶原酶的方法。
提取胶原酶的方法已有不少报道，多为从细菌培养液中提取，如GK 85103913提供的一种胶原酶制备工艺，将组织梭菌经改进的培养基、发酵液静止发酵得到低毒性的胶原酶，将发酵液经过无菌过滤，硫酸铵沉淀、脱盐、冻干获得胶原酶粗品，再经DEAE柱层析及Sephadex G-25脱盐，冻干可得精品。由于其萃取工艺复杂、成本高，又有受细菌感染的威胁，而限制了胶原酶的生产与应用。
本发明的目的是提供一种原材料易得，提取方法简单、成本低，又不受细菌感染威胁的提取胶原酶方法。
为达到上述目的，本发明利用双胸蚓为原料，先将双胸蚓冷冻制成匀浆，用水或PH值为5-8的缓冲液抽提，抽提液经(NH4)2SO4盐析，沉淀对PH值为5-8的缓冲溶液透析进行脱盐，或沉淀用少量的PH值为5-8的缓冲溶液溶解后，进行凝胶过滤或超滤脱盐;收集物中加入核酸酶及透明质酸酶进一步消化，再经胶原-聚丙烯酰胺凝胶亲和层析或用DEAE-纤维素离子交换剂交换后，经超滤或凝胶过滤纯化产品。
本发明的进一步改进是水或PH值为5-8的缓冲溶液中加入钙、镁、钡或锰盐，盐浓度为0.05-1.5M(采用磷酸盐缓冲溶液时，不加上述盐)。
具体方法如下A冷冻制匀浆首先将双胸蚓洗净、完全排除其消化道内容物，冷冻后绞碎制成匀浆。
B抽提在上述匀浆中加入水或PH值为5-8的缓冲溶液，抽提18-66小时。缓冲溶液可为Tris-HCl缓冲溶液，浓度为0.005-0.15M;乙酸缓冲溶液，浓度为0.005-0.1M;磷酸盐缓冲溶液，浓度为0.005-0.2M。或用含0.005-1.5M的钙、镁、钡或锰盐的水或PH值为5-8的缓冲溶液抽提18-66小时。缓冲溶液可为Tris-HCl缓冲溶液，浓度为0.005-0.15M，乙酸缓冲溶液，浓度为0.005-0.1M。然后，将其于转速为10000-14000rpm/min的冷冻高速离心机上离心10-20分钟，去沉淀、得粗酶溶液。
C盐析在所得的粗酶溶液中加入(NH4)2SO4，至饱和度为30-60%，在4℃静置20-50分钟，离心分离得沉淀。
D脱盐将上述所得到的沉淀，对PH值为5-8的缓冲溶液透析，或在上述所得的沉淀中加入少量PH值为5-8的缓冲溶液，溶解后进行凝胶过滤或超滤。
E纯化在上述脱盐后的产品中，加入核酸酶及透明质酸酶进一步消化，去除其中的核酸和杂多糖，得胶原酶半成品。再将其加入用PH值为5-8的缓冲溶液平衡一夜的胶原-聚丙烯酰凝胶层析柱内，先用缓冲溶液洗脱去杂蛋白，然后增高缓冲溶液中盐浓度，洗脱含胶原酶活性蛋白部分，洗脱温度为0-4℃。经浓缩、冷冻干燥后得纯品。或采用下述方法;将胶原酶半成品加入装有DEAE-纤维素的离子交换剂的器皿中吸附2-4小时或过夜，温度为0-4℃。用PH值为5-8的缓冲溶液洗至没有杂蛋白为止，增高缓冲溶液中盐浓度，浸泡吸附胶原酶的交换剂4-6小时、洗脱与离子交换剂结合的胶原酶活性蛋白部分。再经超滤或凝胶过滤，进一步纯化胶原酶产品，浓缩、冷冻干燥即纯得品。
这样，由于本发明采用双胸蚓作原料，具有广泛的材料来源，同时又避免采用细菌提取胶原酶过程中的细菌感染的威胁。本发明胶原酶提取纯化技术简单易行，只经过制浆、抽提、盐析、脱盐和纯化几步工艺，且不必要求严格的工艺条件和特殊设备，加之采用的药品都为普通的化学试剂，不仅提取方法简单、成本也低。此外，由于本发明采用能提高胶原酶活性的盐(钙、镁、钡或锰盐)和PH值为5-8的缓冲溶液作抽提液、洗脱液，亦可大大提高本发明提取胶原酶的收率。
实施例一、将排尽消化道内容物的双胸蚓于-20℃冷冻绞碎制成匀浆，在4℃加入0.01M Tris-HCl缓冲溶液抽提30小时，于转速为12000rpm/mim的冷冻高速离心机上离心10分钟，取上层清液用(NH4)2SO4盐析至饱和度为60%。在4℃静量30-40分钟，再离心20分钟，取沉淀对Tris-HCl缓冲溶液透析，脱盐。再加入核酸酶及透明质酸酶进一步消化，去除其中的核酸和杂多糖。然后经胶原-聚丙烯酰胺凝胶亲和层析、收集含有胶原酶活性蛋白部分。浓缩、冷冻干燥得纯品。
实施例二、将排尽消化道内容物的双胸蚓冷冻后绞碎制成匀浆，在4℃加入0.05M Tris-HCl缓冲溶液和0.005M的CaCl2溶液抽提20小时，于转速为10000rpm/min冷冻高速离心机上离心15分钟，取上层清液用(NH4)2SO4盐析至饱和度为30%，静置30-40分钟，离心20分钟，取沉淀用少量的缓冲溶液(Tris-HCl缓冲溶液)溶解后，进行凝胶过滤或超滤。收集物用核酸酶及透明质酸酶消化，去除其中的核酸及杂多糖，然后经胶原-聚丙烯酰胺凝胶亲和层析，收集含有胶原酶活性蛋白部分。浓缩，冷冻干燥后即得纯产品。
实施例三、将排尽消化道内容物的双胸蚓，冷冻后绞碎制成匀浆。在0℃加入水和浓度为0.1M的MgCl2溶液抽提45小时，于转速为13000rpm/min的冷冻高速离心机上离心15分钟。取上层清液用(NH4)2SO4盐析至饱和度为50%。静置40分钟后，离心10分钟，取沉淀对缓冲溶液透析(Tris-HCl缓冲溶液或乙酸缓冲溶液)，脱盐。加入核酸酶及透明质酸酶消化，去除其中的核酸和杂多糖。然后用DEAE-纤维素离子交换剂交换，用乙酸缓冲溶液洗脱杂蛋白部分，增高缓冲溶液盐浓度，浸泡交换剂5-6小时，洗脱与离子交换剂结合的胶原酶活性蛋白部分，再经超滤或凝胶过滤，进一步纯化胶原酶产品。浓缩、冷冻干燥后得纯品。
实施例四、将排尽消化道内容物的双胸蚓，冷冻后绞碎制成匀浆。在4℃加入浓度为0.04M的磷酸盐缓冲溶液抽提60小时后，于转速为14000rpm/min的冷冻高速离心机上离20分钟，取上层清液用(NH4)2SO4盐析至饱和度为45%。静置20分钟后，离心10分钟，取沉淀用少量的缓冲溶液(磷酸盐缓冲溶液)溶解后，进行凝胶过滤或超滤脱盐，再加入核酸酶及透明质酸酶进行消化，去除其中的核酸和杂多糖。然后经胶原-聚丙烯酰胺凝胶亲和层析，收集含有胶原酶活性蛋白部分，浓缩、干燥后得纯品。
权利要求
1.一种从双胸蚓中提取胶原酶的方法，包括冷冻制匀浆，抽提、盐析、脱盐和纯化工艺，其特征在于将排尽消化道内容物的双胸蚓冷冻后绞碎制成匀浆，用水或PH值为5-8的缓冲溶液抽提，用(NH4)2SO4盐析，沉淀对缓冲溶液透析或沉淀用少量的缓冲溶液解后进行凝胶过程或超滤脱盐，再加入核酸酶及透明质酸酶进一步消化，经胶原-聚丙烯酰胺凝胶亲和层析纯化产品或用DEAE-纤维素离子交换剂交换后，进行凝胶过滤或超滤纯化产品。
2.根据权利要求1所述的一种从双胸蚓中提取胶原酶的方法，其特征在于所述的PH值为5-8的缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶，浓度为0.005-0.15M，或乙酸缓冲溶液，浓度为0.005-0.1M或磷酸盐缓冲溶液，浓度为0.005-0.1M。
3.根据权利要求1或2所述的一种从双胸蚓中提取胶原酶的方法，其特征在于所述的水或PH值为5-8的缓冲溶液中含有浓度为0.005-1.5M的钙、镁、钡或锰盐。
4.根据权利要求1所述的一种从双胸蚓中提取胶原酶的方法，其特征在于用(NH4)2SO4盐析的饱和度为30-60%。
全文摘要
一种从双胸蚓中提取胶原酶的方法，包括冷冻制匀浆、抽提、盐析、脱盐和纯化工艺，其优点是该方法具有材料来源广、提取方法简单，并能避免以往从细菌培养液中提取胶原酶方法中易受细菌感染的威胁。此外，本发明由于利用能提高胶原酶活性的Ca
文档编号C12N9/64GK1064104SQ9210140
公开日1992年9月2日 申请日期1992年3月3日 优先权日1992年3月3日
发明者钟良玮, 单鸿仁, 张祖珣 申请人:山西医学院