专利名称：从血块制备超氧化物歧化酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种从血块制备超氧化物歧化酶的方法，属于生化制品的制造方法。
超氧化物歧化酶(简称SOD)是近年来国内外进行广泛研究的一种新的抗氧剂，它能特异性清除体内的超氧离子，具有抗幅射、消炎和抗衰老等许多生理功能。目前我国已将SOD开发成许多产品，如大宝-SOD系列化妆品，九头鸟SOD高级营养口服液等。今后SOD将在食品、水果保鲜和医药等领域中发挥越来越大的作用。目前，从血液制备SOD已有许多报导，但所有这些方法均以红细胞为起始材料。将新鲜血液加抗凝剂，经多次离心分离和洗涤获得纯净的红细胞，然后溶血使SOD释放出来，再利用有机溶剂处理除去血红蛋白或通过热处理、离子交换式亲和层析等方法分离和纯化SOD。这种制备方法的缺点是，分离和纯化红细胞主要靠大容量冷冻离心机，需消耗大量的能量，处理周期比较长。而每次处理量只有数立升。此外，反复离心处理会使部分红细胞破裂，影响SOD的收率。这种红细胞的分离和纯化过程是目前影响SOD大规模生产的主要限制因素。
本发明的目的是针对上述现有技术所存在缺点，而提供一种以血块或全血为起始材料分离和纯化SOD的方法。
本发明的目的是这样实现的，其工艺过程为(1)热变性处理取充分凝固的动物血块，倾去血清，每千克血块加18-120克的一价金属盐，一起粉碎过筛(用万能粉碎机，80目)，再加入1-4倍的无离子水，充分搅匀，边搅拌边滴加1摩尔的保护剂铜盐1-20%(体积比)。在强力搅拌下于50-70℃热处理15-60分钟，在加热过程中溶液粘度和颜色匀发生变化。用离心甩干或过滤除去沉淀，得澄清透明的呈浅绿色滤液，经此步处理的SOD几乎全部转到滤液中，而绝大部分杂蛋白变性析出。
(2)超滤将上述滤液经中孔纤维超滤器(截留分子量6000-2万)超滤和浓缩后得浓缩液。
(3)层析柱处理将上述浓缩液通过一金属螯合层析柱，除去游离的铜离子和部分杂蛋白，即得液体状超氧化物野化酶。
上述的一价金属盐可选择下列中的一种钠盐、钾盐、锂盐。上述的铜盐可选择下列中的一种硫酸铜、氯化铜、硝酸铜、醋酸铜。一价金属盐的作用是解离作用，把SOD从血块中解离出来。铜盐起保护作用。
本发明所制备的SOD借助于常规生化方法(如离子交换等)可以很容易的达到电泳纯。
本发明的第一步，即变性处理，使SOD几乎全部转入滤液中，而使绝大部分杂蛋白变性析出。滤液中SOD活力可达300-500单位/毫升(根据经典的连苯三酚法测定)。蛋白质浓度为0.1-0.3毫克/毫升(根据考马斯亮兰法测定)。经中孔纤维超滤器和金属螯合层析柱处理可使SOD比活达3000-5000单位/毫克蛋白。完全符合目前国内市售的口服或化妆品用SOD的纯度要求。
本发明完全适用于从全血制备SOD的工艺过程。
本发明与现有技术相比，具有制备工艺简单，生产成本低，适合大规模生产等优点。
下面是本发明的几个实施例实施例1取1kg血块加30g NaCl，粉碎过筛(80目)，再加2kg的无离子水，充分搅匀。边搅拌边加10%的1M CuSO4溶液。在水浴中边搅拌边升温到60℃，在此温度下保持30分钟(继续搅拌)，过滤得到2立升滤液。酶活3000单位/毫升，蛋白质浓度0.12毫克/毫升。将该滤液经中孔纤维超滤器过滤(截留分子量6000)得190ml浓缩液。将此浓缩液通过一金属螯合柱，流出液比活可达4000单位/毫升蛋白。
实施例2取1kg血块加18g KCl，粉碎过筛(80目)，再加2kg的无离子水，充分搅匀。边搅拌边加1%的1M CuCl2溶液。在水浴中边搅拌边升温到60℃，在此温度下继续搅拌30分钟。过滤得滤液1.9立升，酶活4000单位/毫升，蛋白质浓度0.3毫克/毫升。超滤浓缩至150毫升，再流经金属螯合柱，流出液比活大于3000单位/毫克蛋白。
权利要求
1.一种从血块制备超氧化物歧化酶的方法，其特征在于其工艺过程为(1)热变性处理取充分凝固的动物血块，倾去血清，每千克血块加18-120克的一价金属盐，一起粉碎过筛(80目)，再加入1-4倍的无离子水，充分搅匀，边搅拌边滴加1摩尔的保护剂铜盐1-20%(体积比)，在强力搅拌下于50-70℃热处理15-60分钟，用离心甩干或过滤除去沉淀，得澄清透明的呈浅绿色滤液，(2)超滤将上述滤液经中孔纤维超滤器(截留分子量6000-2万)超滤和浓缩后得浓缩液，(3)吸附处理将上述浓缩液通过一金属螯合层析柱，除去游离的铜离子和部分杂蛋白，即得液体状超氧化物歧化酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的一价金属盐可选择下列中的一种钠盐、钾盐、锂盐。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述铜盐可选择下列中的一种硫酸铜、氯化铜、硝酸铜、醋酸铜。
全文摘要
本发明涉及一种从血块制备超氧化物歧化酶(简称SOD)的方法，它是以血块为起始材料，加一定量的一价金属盐后粉碎，再加一定量的无离子水和保护剂，在强力搅拌下经热变性处理，过滤除去沉淀，滤液中SOD活力达300—500单位/毫升，比活可达1000—3000单位/毫克蛋白。再经超滤和层析柱处理，可使SOD比活达3000—5000单位/毫克蛋白，完全符合食品或化妆品用SOD的纯度要求。本发明的优点是工艺简单，生产成本低，适合大规模生产。
文档编号C12N9/02GK1081713SQ9210514
公开日1994年2月9日 申请日期1992年7月30日 优先权日1992年7月30日
发明者静天玉 申请人:静天玉