专利名称：一种肝细胞体外培养方法
技术领域：
本发明涉及一种生物组织体外培养方法，特别是一种肝细胞的体外培养方法。
肝脏是环境中多种有害因素作用的靶器官，用原代培养的肝细胞作外源性毒物、药物代谢研究，目前最有希望的是体外培养的哺乳动物肝细胞。现有的肝细胞体外培养均用体外肝灌流法，用昂贵的胶原酶消化制成肝细胞悬液，再用特定的培养基，在37℃ 5～10%的CO2培养箱中培养。由于方法复杂、混杂的纤维母细胞成分较多、且所需设备价格昂贵、来源困难，因而一般条件的实验室很难开展工作。
本发明的目的在于提供一种能使肝细胞在体外良好增殖，且能抑制成纤维细胞过度生长的简便易行、无需昂贵仪器、设备、试剂即可实施的肝细胞体外培养方法。
本发明的目的是通过采用边条参液合成培养基而实现的。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
边条参溶液合成培养基配方如下RPMI 1640 100ml青霉素 100U./ml链霉素 100mg/ml胰岛素 5mg/ml氢化可的松 10mg/ml10%边条参液 10mg/ml小牛血清占培养基总量的10%。
用5.6%NaHCO3调pH至7.2～7.4。
10%边条参液的制备方法称10g边条参剪成小片，加入双蒸水100ml，煮沸30分钟(补足其液量)，2000转/分离心15分钟，取上清，经无菌过滤，-20℃保存备用。
此培养基能为肝细胞在体外增殖提供良好的环境，且能抑制成纤维细胞的过度生长。
具体培养方法如下1.取新生1～5天的SD大鼠2～3只，用碘酊酒精消毒皮肤，放血致死，无菌取肝。
2.弃净肝包膜及髓质部分，用眼科镊子及剪刀作反复机械分离，小心分离肝组织。
3.用无菌Hank′s液清洗，直至乳白色。
4.用眼科剪刀轻轻剪碎，成为肝组织浆状，再用Hank′s液小心地清洗两次。
(以上每次用Hank′s液清洗过程中，不用离心机沉淀，而用自然沉淀)。
5.用0.25%胰蛋白酶，37℃水浴中消化30分钟，并不时摇动，使消化均匀。
6.弃胰酶，用边条参液合成培养基将细胞团块轻轻打碎。
7.用0.2%台酚兰计数死活细胞数，如活细胞数＞90%则接种于已涂有鼠尾胶(已干，使用前用Hank′s液冲洗一次)的20ml组织培养瓶中，每瓶3ml，3.0×105/ml细胞。
8.盖紧胶塞，37℃普通温箱培养。
9.待细胞贴壁后，24小时后换上新的合成培养液，并可用普通光学显微镜将细胞面倒置起来，观察细胞生长情况。
(代替倒置显微镜观察)10.肝细胞以小岛形式向四周扩展生长，约2～3周左右融合成单层。
本发明方法简便，所需条件要求不高，且培养出来的肝细胞活性良好，生物学特性正常，适合于一般条件的实验室推广应用。
权利要求
1.一种肝细胞体外培养方法，包括取肝、分离、清洗、沉淀、消化、培养、接种等步骤，其特征在于采用边条参液合成培养基培养肝细胞。
2.根据权利要求1所述的肝细胞体外培养方法，其特征在于每毫升培养基中含青霉素100U、链霉素100mg、胰岛素5mg、氢化可的松10mg、10%边条参液10mg，小牛血清占培养基总量的10%。
3.根据权利要求1或2所述的肝细胞体外培养方法，其特征在于培养基pH值为7.2～7.4。
全文摘要
本发明涉及一种肝细胞体外培养方法。通过采用边条参液合成培养基，使培养方法简便易行，所需条件要求不高，培养出来的肝细胞活性良好、生物特性正常，适合于一般条件的实验室推广应用。
文档编号C12N5/06GK1082109SQ9210889
公开日1994年2月16日 申请日期1992年7月27日 优先权日1992年7月27日
发明者潘姜萍 申请人:中山医科大学