提高了l-抗坏血酸的生物量及其生产方法

文档序号:543516阅读:340来源:国知局
专利名称:提高了l-抗坏血酸的生物量及其生产方法
技术领域
本发明涉及含有细胞内高抗坏血酸水平的微藻生物量,其制备方法及其作为动物饲料的用途。尤其是,本发明涉及用抗坏血酸生物量强化的动物饲料组合物及其制备方法和其作为鱼饲料的用途。
L-抗坏血酸,或维生素C,是一种广泛分布于植物和动物界中的水溶性维生素。它在营养、良好健康的维持、和食品工业中是极为重要的。几乎所有种类的动物都合成L-抗坏血酸而且在他们的食物中不需要它。然而,人类、其它灵长目、豚鼠、食果蝙蝠、某些鸟和鱼如Coho大麻哈鱼、彩虹真鳟鱼(rainbow trout)、鲤鱼,因他们缺乏一种肝酶而不能合成此维生素。如果剥夺饮食来源的L-抗坏血酸,这些动物逐步出现坏血病。要克服不利于良好健康和正常生长(特别是在养鱼业上)的少量的或大量的不足,必须使此类动物得到充分供应的维生素C。
用于从植物、动物组织和食物分离维生素C的方法是公知的,它包括提取,提取物的纯化和溶液中维生素的分析或分离。某些从其中已分离出抗坏血酸的自然资源包括红辣椒、唐菖蒲叶、蔷薇果、柿和柑橘。该维生素也可用L-木糖、L-半乳糖或更优选地是从低价、易得的D-葡萄开始来合成。
另一种能用来产生L-抗坏血酸的方法是使用微生物。而已知野生型微生物仅产生少量的L-抗坏血酸,最近公开的US5,001,059证实,使用小球藻属藻可使产量提高。
在L-Ascorbic AcidMetabolism,Biosynthesis,Function,The Biochemistry of Plants,Vol.3,Academic Press,Inc.,PP,77-99,1980中,Locwus,F.A.提出一种L-抗坏血酸的来源和生物合成的观点。有关藻类产生抗坏血酸的描述可在下列文献中找到Vaidya等,Science and Culture(1971)37383-384;Subbulakshmi等,Nutrition Reports International(1976)14581-591;Aaronson等,Arch.Microbiol.(1977)11257-59;Shigeoka等,J.Nutr.Sci.Vitaminal(1979)2929-307;Shigeok等,Agric.Biol.chem.(1979)432053-2058;Bayaniva和Trubachev,Brikladnaya BiokhimiyaMikrobioligyia(1981)17400-407(UDC 588.26577.16);和Ciferri,Microbiolgical Reviews(1983)47551-578。
微藻用于食物的生产是已知的。包括小球藻类的各种藻含有维生素(包括维生素C)也是已知的。例如,Aaronson等,Arch Microbiol.112,57-59(1977)公开了光生长的小球藻每mg重的干细胞含有高达15μg的维生素C,即占重量的1.5%。
Renstrom,Plant Sci.Letters,28299-305(1982/1983)说明了小球藻中L-抗坏血酸含量被报告是6-82μmol/g光生长细胞干重,即占重量的0.11到1.44%;Chlorella Pyrenoidosa Chick,培养(UTEX)号343,在添加葡萄糖的培养基上暗生长0.5到6天,也产生每g干重约3μmol的L-抗坏血酸(0.06wt%)并且在供给光线12小时时产量为该量的4倍(0.24wt%),结果类似于那些早期研究所报告的。
现有技术的异养方法和微生物用于商业是不完全令人满意的所产生的生物量在L-抗坏血酸方面过于不足,这是由于所使用的微生物不太有效,在所用方法的条件下碳源的利用很少。
在富含L-抗坏血酸的生物量的生产中,需要改进产生L-抗坏血酸的微生物和改进利用他们的方法。
一种富含L-抗坏血酸的生物量包含具有细胞内L-抗坏血酸(L-AA)含量高于干细胞重1.5%的绿色微藻细胞,优选至少约2%及更优选至少约3%。
其它实施方案包括下面鉴定的新的产生高L-AA的被诱变处理的Chlorella pyrenoidosa微藻;微藻的产生高L-AA含量生物量的异养方法;含有富含L-AA生物量的动物饲料组合物及其作为动物饲料的用途,包括能至少供给动物每日所需维生素C的主要部分的水产养殖鱼饲料。
倘若它们异养性地产生L-AA,则微生物可广泛地变化,优选的是产生L-AA的绿色微藻,特别是其所谓的高产者。表现出有作为潜在高产者希望的生物能够,伴随L-AA产生的用于细胞生长的标准发酵过程来鉴定。优选使用物理或化学诱变方法来诱变他们,如紫外(U.V)光,X-光,N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍、硫酸二甲酯或本领域公知的类似试剂。由此处理产生的诱变L-AA超量产生者能用氧化还原染料来确定。而且,可通过使用抗坏血酸代谢中间体的类似物或抗坏血酸合成的抑制剂,来选择能够在化学物干优物存在下保持或增加L-AA产生的微生物。
上述过程优选的子代是那些-提供改进的L-AA特异形成的微生物(用每克细胞(干重)中的L-AA毫克数测量)。然后将这些子代进一步分成单个克隆并且进一步进行上述过程最终获得提供更高L-AA特异形成的生物体。
优选的是小球藻属的绿色微藻,尤其是Pyrenoidosa种,包括例如源于野生株如C.PyrenoidosaUTDX1663和C.Pyrenoidosa UTEX1230、C.regularis UTEX1808、C.Sorokiniana a.t.c.c.22521、Aukistrodesmus braunii A.T.C.C.12744和Profotheca zopfii UTEX 1438的L-AA高产突变株,UTEX是在奥斯丁的得克萨斯洲大学的藻类培养物收集处。一种这样的源于UTEX1663的突变株是具有A.T.C.C.登记号53170的C.PyrenoidosaUV101-158。
其它有代表性的和优选的L-AA高产者及其亲代,他们本身的高产者和此处适用者,按诱变适用的方法列表显示如下DAP388-19源于DAP300-4,DAP300-4依次源于UV489-5,SUV359-2,SUV296-5,SUV213-4,UV212-11,SUV9-1,UV182-2576,NA5-3,UV137-253,UV101-158,UV29-132,UV18-374,UV12-15,UV3-482和Chlorella Ppyrenoidosa Utex 1663。
UV711-1和EMS156-1源于C115-1,C115-1依次源于DAP300-5,UV489-5,SUV359-2,SUV265-5,SUV97-1,UV213-4,UV212-11,SUV9-1,UV182-2576,NA-3,UV137-253,UV101-158,UV29-132,UV18-374,UV12-15,UV3-482和Chlorella PpyrenoidosaUtex1663。
C166-4源于SUV551-3,SUV551-3依次源于DAP389-23,DAP300-5,UV489-5,SUV359-2,SUV296-5,SUV97-1,UV213-4,UV212-11,SUV9-1,UV182-2576,NA5-3,UV137-253,UV101-158,UV29-132,UV18-374,UV12-15,UV3-482和Chlorella Ppyrenoidosa Utex1663。
NA678-1,UV869-3和C284-130源于C166-4。
NA722-22源于C123-4,C123-4依次源于UV609-4,NA528-2,DAP300-6,UV489-5,SUV359-2,SUV296-5,SUV97-1,UV213-4,UV212-11,SUV9-1,UV182-2576,NA5-3,UV137-253,UV101-158,UV29-132,UV18-374,UV12-15,UV3-482和Chlorella Ppyrenoidosa Utex1663。
C325-2源于C123-2,C123-2依次源于UV609-4,NA528-2,DAP300-6,UV489-5,SUV359-2,SUV296-5,SUV97-1,UV213-4,UV212-11,SUV9-1,UV182-2576,NA5-3,UV137-253,UV101-158,UV29-132,UV18-374,UV12-15,UV3-482和Chlorella Ppyrenoidosa Utex1663。
UV872-26源于NA678-1。
DAPN1010-50源于DAP994-1,DAP994-1依次源于C360-70,C284-130,C284-130,C166-4,SUV551-3,DAP389-23,DAP300-5,UV489-5,SUV359-2,SUV296-5,SUV97-1,UV213-4,UV212-11,SUV9-1,UV182-2576,NA5-3,UV137-253,UV101-158,UV29-132,UV18-374,UV12-15,UV3-482和Chlorella Ppyrenoidosa Utex1663。
UV232-1依次源于NA28-4,NA19-3,UV165-239,UV137-253,UV101-158,UV29-132,UV18-374,UV12-15,UV3-482和Chlorella Ppyrenoidosa Utex1663。
变异株名称的词头是下列用于产生他们的诱变处理的缩写C=樟脑;DAP=2,6-二氨基嘌呤;EMS=甲磺酸乙酯;NA=一氧化二氮;DAPN=DAP和NA连接;SUV=短波长的紫外光;UV=宽波长紫外光。
在每种情况下,诱变的子代与其亲代比较是较高的L-AA产生者。而且,每个生物体在按下列所描述的本发明方法情况下比在常规情况下产生更高的L-AA的特异形成。
依赖于所使用的特定的微藻,该方法可以是一种常规异养发酵,其中该生物体在一种促生长培养基中,在有效温度、压力和PH下,在未限定的生长条件下生长,其中该培养基含有一种如葡萄糖的适当碳源和溶于其中的分子氧(O2),该碳源和分子氧的量对产生伴随细胞内L-AA产生的高细胞密度的细胞是足够的,并且保持生长直到该细胞含有适当高的重量成分数的细胞内L-AA。
优选地,该方法包括按以上在未限定生长条件下使细胞异养生长到高细胞密度,其密度实质上可以是或可以不是最大的,允许碳源变得基本上耗尽并且细胞生长基本上停止,然后以限定量恢复碳源的供应以便使L-AA的产生继续并导致L-AA产量的提高而在细胞密度上基本上没有增加,并在溶解O2的压力中限定量碳源下而继续限定生长阶段直到每单位重量的细胞生物量的L-AA浓度达到本发明目的的理想水平。
另一优选的方法包括按以上在未限定生长条件下使细胞异养生长,即,在足够碳源和溶解O2的存在下,在有效的温度、压力和PH下获得含有细胞内L-AA的高密度的细胞,然后降低溶解O2含量或允许它由正常细胞代谢降低到低浓度以便细胞生长基本停止而L-AA继续产生而在细胞密度上基本没有增加,并维持低O2的条件直到在生物量中获得理想细胞内L-AA浓度。
将会注意到,以上方法的实施方案都提供了为产生细胞内L-AA的提高的碳源利用。
在实施所述方法时,在无菌含水营养培养基中用所选择的微生物的活性生长培养物来无菌接种,其微生物的量足以导致在适当生长期(在正常生长指数期间)后产生比较高的细胞密度。典型起始细胞密度范围通常是每升细胞干重约0.5到0.4g。在方法的起始或进程中按照需要可加入少量消泡剂。
培养基包含碳源,各种盐且通常也包含痕量金属。
出于经济的原因,优选的碳源是葡萄糖源,包括葡萄糖,但可以是任何能原位转变成葡萄糖的糖类或多糖类,如,糖浆、玉米糖浆等。所使用葡萄糖源的总量能信赖于特定的生物体和所期望的结果广泛地变化。正常情况下,用如以上所描述的L-AA高产生物体,如不被代谢,使用的葡萄糖的总量应当提供约65到90,更常见的是约75到85,优选地为约80g/L的浓度。通常,开始约加入总葡萄糖量的15到30%,将葡萄糖一般在起始时和在发酵过程中连同下列所限定的添加物一同加入。在起始葡萄糖源加入和发酵期间,它是未限定细胞生长期,其中细胞生长到较高密度,如,约20到45g/L,更常见的是约30到40g/L,相应地为高细胞内L-AA含量的微藻在本发明方法的控制碳或控制氧的限定细胞生长步骤期间的高的总L-AA浓度提供了基础。
在发酵罐中葡萄糖源的量应当是一种非阻遏/非限制的量,那就是,它应当最令人满意地促进而不是抑制或过度地限制细胞生长。葡萄糖源的非阻遏最佳浓度可因生物体的不同而变化,并通过对任何特定生物体的试验来容易地确定。例如,对C.Pyrenoidosa藻株,葡萄糖源浓度通常通过及时地加入来维持15-30g/L范围,可见它足以促进细胞生长而同时避免葡萄糖对生长的抑制作用。在整个过程中碳源对生物体的可利用性可用已知的方法监测。例如葡萄糖能在上层清液中用葡萄糖氧化酶酶试验或色谱法(HPLC)来测定。当碳源浓度下降,它能被按需补充,但要保证总浓度保持低于生长阻遏水平,按葡萄糖当量计算法(glucose-equivalent basis),该浓度通常低于约30g/L。
理想情况下,起初,其它添加物连同葡萄糖源一起存在,这些添加剂有常见的磷、氮、镁、铁和痕量金属源,它们是本技术领域公知的,而且他们在营养培养基中的浓度也通过同样的添加物连同续加的葡萄糖源的随后加入来连续地或周期性地增加或补充。这些添加物的浓度与葡萄糖源的浓度之比在发酵过程中可以是相同的或不同的。
在美国专利第5,001,059中更充分地描述了一种典型的营养培养基,它的组合物和使用,在此一并作为参考。
优选的O2源是空气,但可以是未稀释的或用任意惰性的和不与发酵成分反应的气体稀释的分子O2。将O2源便利地喷入发酵团中,优选的将其搅动而使气体分布于培养基中而且促进其中O2的溶解。O2在培养基中的溶解性(直到饱和浓度(100%溶解的O2))主要是O2源流速、搅动速度、培养基组成、温度和压力的函数。对于给定的培养基在给定温度和压力下溶解O2对生物的可利用性易于通过搅动速度和O2气流速来控制。
搅动速度通常为约200到1000rpm,而充气气流速度范围一般在每分钟约0.1到0.6升(1pm),取决于在方法的任何特定阶段内所期望的溶解O2的量。在未限定细胞生长阶段内,溶解O2浓度一般约为饱和值的20%。优选为50%或更高。
在限定O2的方法的限定O2阶段内,以一个速度供给O2源以便浓度远低于饱和值的20%且最好保持刚好超过0%值以上,令人满意的是1%左右。不管什么绝对值,低O2浓度应当在所描述的最适PH时足以低到在碳源存在不导致细胞内L-AA含量的增加而基本上没有导致细胞生长。溶解O2浓度用氧探测电极来方便地检测。
温度和压力应当是便于促进细胞生长和L-AA产生而不杀死细胞。正常情况下,温度为20到40℃,优选约35℃。压力一般为大气压但可以是超过大气压的,压力越大空气(O2)在培养基中的溶解度越大。
PH能够依赖于生物生长、产生和保留细胞内L-AA(即阻止分泌进入含水培养基中)的能力而广泛变化。一般地,对于Chlordlla Pyrenoidosa及其各种株,PH范围一般在约6.5到8,更常规地是在约6.9到7.5,已经发现如此比较高的PH阻止L-AA由细胞通过培养基,即,细胞保留比他们分泌进入培养基更多的L-AA。
PH能够按需通过加入氨气增加PH来控制。NH3也作为营养氮源供应。也可按需通过加入一种生理上相容的酸如磷酸、乙酸、乳酸、酒石酸或类似较低PH的酸来控制。另一种情况是,如果需要,由于它们固有地产生酸副产物,微生物能被允许降低代谢PH。
在本方法的高氧未限定生长阶段中(其中按上述所讨论的,该PH比较高)细胞内L-AA能够增加到细胞干重的1到4%。细胞内L-AA含是更进一步增加到至少1.5%优选至少约2%并且通过在以上描述的方法的低碳和低氧限定生长阶段仍然维持高PH,细胞内L-AA含量能再增加至少1.5%,优选的是至少约2%,直到高达5-6%。细胞内含量越高,生物量用作动物饲料就越好。
下列实施例用来说明本发明,而不构成对附加权利要求范围的限制。
实施例1培养基制备将0.27g一碱价磷酸钾和0.23g二碱价磷酸钠在600ml蒸馏水中的溶液在一个一升玻璃发酵罐中加热灭菌,该发酵罐中装配有搅动培养基和供应营养成分、氧源和其它以下所述试剂的装置。培养基冷却后,经0.2微米无菌滤器加入5ml的1.92g/L硫酸亚铁溶液(PH2.5)。
葡萄糖-盐的浓缩分别将下列含水营养成分灭菌,冷却后合并为最终104ml的体积80ml含56g葡萄糖的溶液;11ml含0.70g柠檬酸三钠、0.46g硫酸镁和0.70ml96%H2SO4的溶液;10ml含1.53g一碱价磷酸钾和1.53g二碱价磷酸钠的溶液;以及9.4ml痕量金属溶液,该组合物在在此一并作为参考的美国专利5,001,059中被描述。
营养培养基然后将20ml的葡萄糖一盐浓缩液加到磷酸盐培养基中。
细胞生长和L-AA产生将营养培养基加热到并维持在35℃,以450rpm转速开始搅动,以每分钟0.1升(1pm)的速度将空气喷入培养基中,用加到空气流中的无水NH3调节PH到6.9,将Chlorella PyrenoidosaDAPN1010-50株的活性生长培养物接种到培养基中得到约0.3的起始细胞密度,即0.2g/L。
在起初的10小时中,在培养基中溶解O2含量有几乎注意不到的下降并且细胞密度略有增加。在20小时时,细胞生长(g/L细胞密度)加快并且溶解O2下降到约70%。30小时后,细胞密度已增加到约5g/L并且O2含量已经剧减到略低于20%。反映出生长细胞增加的团对O2的强烈吸收。此时,将搅动速度增到近800rpm且气流速度增到0.21pm。这样导致溶解O2峰剧增到约85%,然后在此后的10小时期间减到约25%,再次反映出高细胞生长速度,细胞密度达到14g/L。
在此后的10小时期间,搅动和气流分别保持775rpm和0.2lpm,溶解O2降至接近百分之0,细胞密度增加的速度达到最大,细胞密度为28g/L,且基本上所有的细胞内L-AA的含量增到0.8g/L。在整个50小时生长期间,通过按需加入美国专利5,001,059中描述的葡萄糖一盐浓缩物来使葡萄糖浓度维持过量20-30g/L。至于PH,在24小时中,它已由6.9降到6.8,在此期间,PH已用加到空气流中的NH3维持在该水平。
简而言之,试验结束时,细胞内L-AA含量(生物量)为细胞干重为2.9%(0.8/28×100)。
实施例2-12基本上按实施例1所描述的一系列试验,而在每一试验中用不同的微藻来重复实施例1过程。微藻及所获得的结果列表显示如下,所有L-AA高产Chlorella Pyrenoidosa突变体描述在表1中。
前4个实施例(2-5)达到20g/L左右的细胞密度,后7个实施例为40g/L左右的细胞密度。在该试验所选择的细胞密度时,所产生生物量的细胞内L-AA含量在表1中给出。
表1实施例2-12;提高L-AA的生物量实施例号 藻株 L-AA C、D L-AAmg/l g/l% 生物量2 DAP388-19(a) 355 19 1.93 DAP388-19(b) 371 19 1.94 EMS156-1 370 18 2.05 211-1 446 18 2.06 C166-4(c) 834 34 2.47 NA678-(d) 999 38 2.68 NA722-22(d) 852 36 2.49 C225-2 1150 37 3.110 UV869-3 593 36 1.611 UV872-26(c) 769 38 2.012 C284-136 792 36 2.2(a)4次试验的平均值(b)在14升的发酵罐中实施,其它都在1升的罐中(c)2次试验的平均值(d)3次试验的平均值实施例130.6L蒸馏水、0.23g二碱价磷酸钠和0.27g一碱价磷酸钾在1升发酵罐中灭菌。然后将11.2mg在5ml蒸馏水中的硫酸亚铁(heptahydrate)和20ml无菌的按下列制备的被单独灭菌并冷却后合并的营养组的葡萄糖一盐浓缩物无菌地加到磷酸盐溶液中组1由56g葡萄糖,食品级单水合物(无水基准)在80ml水中组成;组2由0.7g柠檬酸三钠二水合物、0.47g无水硫酸镁和1ml硫酸在10ml水中组成;组3由0.65g一碱价磷酸钠、1.3g一碱价磷酸钾和0.6g二碱价磷酸钠在10ml水中组成;组4由9.4ml美国专利5,001,059的痕量金属溶液组成。
将温度升高到35℃并以约200rpm的转速开始搅动。以每分钟0.2升的速度(Lpm)使空气通过培养基并以约0.3g细胞/L的浓度加入50ml的Chlorella Pyrenoidosa菌株UV 101-158(A.T.C.C.登记号52170)。5小时后,搅拌速度增加到550rpm,空气流增加到0.6lpm。按表3所标注的,此后将搅拌速度增到700然后800rpm,而在试验的剩余阶段将空气流速保持在0.6lpm。
下列图表描述发酵的条件和分析的结果。
表2抗环血酸在时间 细胞密度 抗坏血酸PH 注释 生物量中的含(小时) g/L mg/L**量(%)(千重)0 6.9 - 400rpm;
5 6.6 0.7 空气0.4 未检测1pm550rpm;
16 6.9 3.8 空气0.6 未检测1pm700rpm;
21 7.0 9.5 加20ml*未检测800rpm;
24 6.9 14.2 加ml*未检测葡萄糖耗尽 未检测
40 7.1 38.6 538 加4ml+ 1.445 7.2 38.6 654 1.748 加4ml+51 7.6 38.1 775 加2ml+ 2.065 7.7 37.8 966 2.668 7.8 1050 加4ml+92 7.6 37.2 1292 3.5101 7.3 36.1 1459 4.0*葡萄糖/盐浓缩物+20%葡萄糖。在发酵过程中按所显示的,定期重复加入。
**细胞内。
实施例14(最佳方式)除下列变化以外,仿效实施例13的过程(a)在起始0.6L蒸馏水装料中用5.6mg硫酸亚铁取代11.2mg硫酸亚铁;(b)营养液的组成28g葡萄糖在40ml蒸馏水中;0.53g柠檬酸三钠二水合物和0.2g硫酸镁在20ml蒸馏水中;20ml各0.65g的磷酸二氢钾和磷酸氢二钠;和15ml的4.7ml痕量金属溶液加1ml硫酸;以及(c)C.Pyrenoidosa的活性生长培养物是藻株UV232-1。
将温度升高到35℃,以350rpm的转速开始搅拌,以0.2升/分钟(lpm)的速度使空气通过培养基,用加到空气流中的无水氨(NH3)将PH调节6.9,并且将藻株UV232-1加到培养基中。NH3作为营养氮源和PH控制剂始终供应。6.2小时后,空气流速增加到0.4lpm,搅拌速度增到400rpm。11.8小时时,空气流速提高到0.6lpm,并在试验的剩余阶段保持此流速。并使搅拌速度提高到650rpm。12.4小时后,将40多毫升含有葡萄糖的营养液加到发酵罐中,24.4小时时再加20多ml并在26.3小时时再加15ml多。同时,在22.8小时时将搅拌速度提高到750rpm,然后在34.8小时时调到800rpm并在试验的剩余阶段保持该速度。
在31.7小时时培养基的葡萄糖含量变得耗尽,此时细胞密度(C、D)为19.5并且L-AA浓度为322mg/l。在41.7小时和从41.7到94.8小时中每3小时供给发酵罐葡萄糖,2ml的10%溶液。细胞密度和L-AA浓度随时间的变化如连同计算出的生物量的L-AA含量在内的下表所示表3时间 C、D L-AA L-AAPH 生物量注释(小时) g/l mg/l 重量%0 6.9 -6.2 6.912.4小时11.8 6.9 40ml葡萄糖24.4小时22.8 20ml26.3小时15ml31.7 6.9 葡萄糖耗尽34.8 7.0 19.5 322 1.7
46.9 7.7 18.7 439 2.353.6 7.8 52858.6 7.8 17.9 613 3.470.8 7.9 69477.7 7.9 17.3 819 4.782.8 7.8 91594.8 7.6 17.6 945 5.4*.在46.7小时和其后直到94.8小时的每3小时加的2ml10%葡萄糖。
基本上按描述的,重复4次以上的以上过程。一个试验包括Maltrin的加入,在47.3和71.2小时时加入作为葡萄糖等当量碳源的Maltrin,一种麦芽糖糊精(5g/20ml蒸馏水)。在5次试验中,%L-AA平均为生物量干重的5.2%。
用于测定L-抗坏血酸的方法由Grun和loewus,在Analytical Biochemistry(1983)130191-198中描述。该方法是离子交换过程,使用一种7.8×300mm有机酸分析柱,HPx-87(Bio-Rad Laboratories,Richmind,CA)。条件是流动相,0.013M硝酸,流速0.8ml/min,压力1500磅/平方英寸,检测UV245-254nm。在以上条件下,L-抗坏血酸和异抗坏血酸分开是可能的。按以上实施例的揭示,在所描述的方法条件下所有的抗坏血酸是细胞内的。
用如下方法测定细胞密度(每升细胞干重(g))将生物量样品(5ml)转移到一个称量盘中并将5ml的离心上清液转移到第二个称量盘中。该盘在对流炉中干燥(105℃,3小时)。在干燥器中冷却后,称量该盘含量。确定每升的细胞克数(样品重-上清液重)×200。
然而,该生物量可通过注意到了减少L-抗坏血酸成分的空气氧化或热降解的本领域公知的任何方法来干燥。
以上实施例表明本发明方法和新的L-AA高产微藻提供提高了其维生素C含量的生物量。维生素含量范围由大于1.5到高达5wt%或更大,远超过现有技术的结果。因此,由于考虑到他们的其它公知营养性价值,他们单独用作富含维生素C的动物饲料组合物或用于与其它合适饲料组合物混合是令人满意的。这种饲料组合物的混合物每吨一般可含有从约60到2,000克的L-抗坏血酸(视被饲养动物而定),更常见地约为320g/吨。
基于所描述和列举的本发明一定程度的特殊性,应当意识到,下列权利要求将不应是太受限制的而将是与权利要求及其等同物各个要素所表达的范围相适应的。
权利要求
1.一种生物量,包含具有细胞内L-抗坏血酸含量大于细胞干重1.5%的绿色微藻细胞。
2.权利要求1的生物量,其中抗坏血酸含量至少约为细胞干重的2%。
3.权利要求1的生物量,其中抗坏血酸含量至少约为细胞重的3%。
4.权利要求1的生物量,其中微藻是小球藻属。
5.权利要求4的生物量,其中微藻是Pyrenoidosa种。
6.权利要求5的生物量,其中微藻是一种具有A.T.C.C登记号53170的所说C.Pyrenoidosa的突变株。
7.权利要求5的生物量,其中微藻是至少一种被指定为UV187-1319,UV232-1,DAP388-19,UV711-1,EMS156-1,C166-4,NA678-1,NA722-22,C225-2,UV869-3,UV872-26,或C284-130的突变Chlorella Pyrenoidosa株。
8.权利要求7的生物量其中微藻至少是C166-4,NA678-1,NA722-22,C225-2,UV872-26,C284-130和UV232-1中的一种。
9.权利要求8的生物量,其中微藻是UV232-1。
10.一种产生权利要求1的生物量组合物的方法,包括选择一种能够在氧存在下在适当的碳源上异养生长并且能潜在地产生至少微藻干重的1.5%(重量比)的细胞内L-抗坏血酸的微藻,在促生长含水营养培养基中,在有效的温度和压力以及PH下,异养生长微藻细胞,在此条件下产生的抗坏血主要是细胞内的,所说培养基含有一种合适的碳源和一种溶解分子氧源,其量足以使细胞生长并产生抗坏血酸,维持所说细胞生长直到细胞内L-抗坏血酸含量相当于至少细胞干重的1.5%(重量比)的细胞团块被产生,并由培养基的含水上清液中分离出细胞团。
11.权利要求10的方法,其中继续生长细胞直到细胞内抗坏血酸含量至少为细胞重的2%。
12.权利要求10的方法,其中细胞生物量在基本上没有降低抗坏血酸的含量下被干燥。
13.权利要求10的方法,其中微藻的选择包括(a)用异养生长试验鉴别产生L-抗坏血酸微藻潜在的高产株;(b)诱变至少一种这样的潜在高产亲代株;(c)鉴别并分离至少一种比亲代产较高抗坏血酸的所说潜在高产亲代的突变株;(d)如需要,以至少一种步骤C的突变株重复步骤(b)直到获得一种能够产生至少微藻细胞干重1.5%的细胞内L-抗坏血酸的所说微藻的突变株。
14.权利要求10的方法,其中细胞生长继续到高细胞密度,允许碳源变得耗尽,将耗尽碳源状况保持到细胞生长基本停止并保持到恢复以控制量地供给碳源,使得细胞内接着产生L-抗坏血酸而细胞密度很少或基本上没有增加,从而按细胞干重计算的细胞内L-抗坏血酸含量更进一步增加。
15.权利要求10的方法,其中温度范围在生长持续期为约20到约40℃的范围,压力为足以保持促进生长量的溶在培养基中的分子氧的大气压或超大气压,PH为维持生长并足以高到在细胞内保持细胞内L-抗坏血酸高水平的PH。
16.权利要求15的方法,其中温度为30到40℃,压力至少为大气压并且PH约为6.5到8。
17.权利要求16的方法,其中温度为35-38℃,PH至少约为6.9。
18.权利要求10的方法,其中在产生的抗坏血酸主要是细胞内的PH下在浓度足以提供高密度生长的所说碳源和分子O2存在下将细胞生长持续到高细胞密度,降低O2的浓度或使其降低到细胞生长减慢并基本停止且细胞内L-抗坏血酸的产生继续和增加而细胞密度很少或没有增加的浓度,由此,细胞内L-抗坏血酸占细胞干重的比例进一步增加。
19.一种动物饲料组合物,该组合物含有权利要求1的组合物。
20.权利要求19的动物饲料组合物,与添加量的第二种动物饲料组合物混合,提供一个生理上可接受量的L-抗坏血酸。
21.权利要求20的组合物,其中每吨饲料混合物有60到2,000克的L-抗坏血酸。
22.权利要求19的组合物,其中的动物饲料组合物是一种水产养殖鱼饲料。
23.一种给需要维生素C的动物提供L-抗坏血酸的方法,包括在所说动物饮食中提供足够的权利要求1的生物量或权利要求19的动物饲料组合物,以至少供给所说动物每日所需维生素C的大部分。
24.权利要求23的方法,其中需要维生素C的动物是鱼。
全文摘要
通过生长一种诱变的产生L-抗坏血酸的微藻来生产含有细胞内高抗坏血酸水平的微藻生物量(大于细胞干重的1.5%)。此生物量可用作动物饲料和作为水产养殖鱼饲料或相应的添加剂。
文档编号C12N1/12GK1080955SQ9310465
公开日1994年1月19日 申请日期1993年3月18日 优先权日1992年3月18日
发明者詹姆斯·A·东琴科, 罗纳德·J·赫斯, 杰弗里·A·朗宁, 托马斯·J·斯卡特鲁德 申请人:生物技术资源L.P.
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