专利名称：间性杂合的须霉属(phycomyces)的制作方法
技术领域：
本发明涉及类胡萝卜素的微生物生产。特别是利用间性杂合的须霉属菌株生产β-胡萝卜素。本发明还涉及利用这些菌株发酵所得β-胡萝卜素的提纯。
在五十年代末和六十年代初期，对毛霉目菌株，特别是三孢霉(Blakesleatrispora)南瓜笄霉(choanephoracucurbitarum)和三孢须霉(Phycomycesblakesleeanus)进行了研究，以便开启一种生产类胡萝卜素的发酵方法。这些真菌的野生型菌株能够积累类胡萝卜素，特别是β-胡萝卜素，然而，对于商业生产而言，能由纯培养物制得的数量是极微少的。
β-胡萝卜素是一种具有维生素原A的脂溶性黄色化学制品，据报导其有抗癌作用。它在食品、饲料、化妆品、化学品和医药行业的各种应用也已有报导。
增加β-胡萝卜素产量的几种方法，是基于相反交配型(+)或(-)菌株的共同培养。相反交配型菌丝体间的相互作用导致了三孢子酸(trisporicacid)的形成和β-胡萝卜素积累的增强。Hesseltine和Anderson(美国专利US2，865，814和US2，890，989)已经公开了在批量开发的生产中相反交配型三孢霉(Blakesleatrispora)菌株的共同培养方法。直到能达到中试规模，该方法才被视为有希望的β-胡萝卜素的生产方法。加入β-紫罗酮刺激两种菌株在发酵罐中产生β-胡萝卜素。在最近几年，这种工艺被几家工业公司作了进一步的完善，使用了多种其它添加剂以刺激β-胡萝卜素的积累。然而这些完善没有再继续下去，这是由于很明显在价格上这些方法不能与工业规模的生产β-胡萝卜素的化学方法相竞争。
当今，仅有前苏联的一家工厂在使用三孢霉(Bladesleatrispora)生产的胡萝卜素的方法，用农业废料作发酵的原料，所得的β-胡萝卜素用作饲料添加剂。
同时，学术研究集中在利用丝状真菌三孢须霉(phycomycesblakesleeanus)作为转换模式系统中的β-胡萝卜素生物合成的生物化学和其调节上。在须霉属菌丝体中β-胡萝卜素的合成是遵从于严格的新陈代谢调节。调节基因的变异可以克服这一严格的调节。经典的变异实验，可以得到β-胡萝卜素的产量大大增加的菌株，即使是在缺少刺激因子的情况下。野生型的须霉属菌株每克生物量干重包含有50微克的β-胡萝卜素。规则单一突变型可以含有6毫克β-胡萝卜素/克干重。双突变型可以包含超过10毫克β-胡萝卜素/克干重。
三孢须霉(phycomycesblakesleeanua)是具有菌丝的丝状真菌，它没有横细胞壁(隔膜)，因此整个菌丝体可被视为一个单一的集合细胞，或是具有数百万细胞核的多核细胞。不像其它的真菌，菌丝永远不会融合，因此融合只能通过人工的方式获得，如原生质体融合，显微外科或通过有性周期(SexualCycle)结构的移植法(T.Ootaki，Phycomyces，E.Cerda′-Olmedo和E.D.Lipson编著，1982年，CSH实验室出版，345-349页;T.Suarez等人的位于同册351-353页)。真菌可以通过包括接合孢子和生殖孢子(germspores)的有性周期来繁殖，或是通过无性繁殖(Phycomyces，E.Cerda′-Olmedo和E.D.Lipson编著，1987，CSH实验室出版，第二页)。
生殖孢子是两个相反交配型菌株的杂交过程的减数分裂产物，所得到的网状菌丝体通常是同核体所组成的，即所有的核在遗传上是一样的。然而，即使是正常的杂交也会自然形成少量的异核体生殖孢子。其结果是，一些生殖孢子产生了间性异核体，这种异核体带有(+)细胞核和(-)细胞核。
这种异核体与正常的菌丝体有着形态上的区别，菌丝体呈显明亮的颜色，是由于β-胡萝卜素积累的增加和形成了有特点的结构，即所谓的假柄(pseudophores)。
间性异核体的维持和繁殖是困难的，因为核具有明显的分离趋势，从而导致仅具有一个交配型的核的菌丝体的部分，间性异核体菌株的结构是设计的目标，细胞核带有隐性致死突变基因，以减少细胞核分裂。据此，F.J.MurilloAraujo等人已成功的构建了超产菌株(美国专利US4，318，987)。这些菌株被称为脱调节(deregulated)突变体的稳定的间性异核体，可生成高达25毫克β-胡萝卜素/克干重。
然而，即使具有这些隐性致死突变，控制核的比率在一定的范围内，间性异核体菌株也不适于β-胡萝卜素的生产。这些间性异核体菌株的生长远比野生型菌株更糟，而且很少或根本就不形成孢子。
本发明公开了一种间性杂合的须霉属(Phycomyces)菌株。
本发明还公开了一种间性杂合的须霉属菌株，它表现出较高的稳定性，并且比以前使用的间性异核体生长的更好，而且与其它现有的稳定菌株相比，提高了β-胡萝卜素的生产率。
本发明还进一步提供了一种获得异宗接合的毛霉目(Mucorales)，特别是须霉属(Phycomyces)，更具体地说是三孢须霉(Phycomycesblakesleeanus)的间性杂合体的方法。
本发明还提供了一种不使用选择标记而转化须霉属的方法。
本发明进一步还提供了一个利用间性杂合的三孢须霉(Phycomycesbalkesleeanus)菌株生产β-胡萝卜素的方法。
本发明还提供了一种在杂合菌株生长后经提纯获得的β-胡萝卜素。
本发明公开了间性杂合的毛霉目菌株，特别是须霉属菌株，更具体地说是三孢须霉(Phycomycesblakesleeanum)菌株。
在本文中，间性杂合体这一名称适用于所有的须霉属菌株，从具有完整的二倍体基因组的菌株到仅具有交配型基因的二倍体菌株。由于所有的菌株都至少包括双亲的交配型基因这样一个事实，因此它们被称为间性杂合体。
本发明的间性杂合须霉属菌株比平衡致死的间性异核体具有更好的生长特性和孢子形成能力。这些菌株与野生型菌株和带有相同的脱调节(derdgulatory)突变但不是间性的菌株相比，还具有更高的β-胡萝卜素产率。
至今为止二倍体须霉属菌株还没有在有关的文献中描述过。试图通过异核体的核融合来获得二倍体的尝试至今都没有成功。Robinow将在某些须霉属菌株中发现的大细胞核猜测为二倍体(C.F.Robinow，Can.J.Microbiol.3(1957年)791-798)。E，Cerda′-Olmedo和E.D.Lipson就目前须霉属的知识提出了广泛而全面的概论。
本发明描述了间性杂合须霉属菌株的构建和用这些菌株生产β-胡萝卜素的方法。
间性杂合体可以通过几种方法建成，其中两种方法将在此进行略述。一种方法是融合由相反交配型菌种获得的完整的细胞核来形成一完整的二倍体细胞。在减数分裂时染色体Ⅰ不分裂，或者在二倍体有丝分裂增殖过程中其它染色体的随机丢失将会产生部分二倍体，所有这些均在本发明范围之内。另一种方法是将一种交配型位点的拷贝导入具有其它交配型菌株的核中。
下述方法可用来获得间性杂合菌株;
a)杂交选择的菌株，以得到低频率的二倍体，或者b)用一种交配型的基因转化另一种交配型的孢子囊。
通过这两种方法都获得了本发明的间性杂合的三孢须霉(Phycomycesblakesleeanus)菌株。
转化须霉属的方法已经公开(T.Suarez的博士论文(1985)，西班牙塞拉曼加大学;J.L.Reruelta和M.Jayaram，Proc.Nat.Acad.Sci.83(1986)，7344-7347;T.Suarez和A.P.Eslava，Mol.Gen.Genet.212(1988)、120-123;J.Arnau等人，Mol.Gen.Genet.212(1988)，375-377)。原生质体转化，用于将带有理想DNA的质粒导入受体菌株。由这些作者所获得的低转化频率，带有交配型的额外一套基因拷贝的转化细胞的转化，似乎是不可能的。
T.Ootaki等人(JapanJ.Genet.66(1991)，189-196)描述了一种方法，此方法大大提高了转化效率。使用显微注射法可使转化频率提高到10%，然而在上述情况下，要使用编码抗生素抗性的选择标记，它对于食品/饲料级生产菌株是不适当的。
本发明公布了一种新的转化方法，它使用显微注射在没有选择标记情况下操作。该方法可以生产间性杂合的须霉属菌株。该方法包括以下步骤-提取具有(+)或(-)交配型的须霉属菌株的DNA;
-将上述DNA克隆在不带选择标记的适当载体上;
-通过显微注射将所得载体导入相反交配型的须霉属菌株中;
-筛选间性杂合菌株。
间性杂合菌株的筛选，可用肉眼观察进行，或者是基于间性的形态进行，间性杂合菌株还具有对(+)和(-)测试菌株无性反应的特点。
另一种获得转化子的可能是使用任一种交配型的非克隆的DNA。其优点是未导入外源DNA。
为了获得交配型位点杂合菌株，可将具有(+)或(-)交配型的菌株用作受体菌株。低β-胡萝卜素产出的菌株可用作初始菌株，或者使用能产生大量β-胡萝卜素的受体菌株。
适宜的(+)受体菌株的例子是一种野生型菌株，例如NRRL1554，一种carF突变体，例如S563或者是带有carS和carF二种突变的突变体，例如S566。作为供体DNA，可以使用相反交配型(-)菌株的DNA，如野生型NRRL1555;carF-S561或S562;carScarFS568或S569。
利用肉眼来选择高产的转化子是有困难的，尤其是当高产菌株被用作受体时更是如此，在这种情况下，β-胡萝卜素生物合成专一抑制剂，如二苯胺或其类似物可用于抑制色素的产生，从而能选择高产转化子。通过在ColA背景中选择交配型连锁的ColA标记的并发转化，可以方便地检测理想的转化子。具有获得的ColA+表现型的转化子，在ColA+菌株中会表现出较强的过生长，它具有限制性的克隆形态。
在培养皿中生长6天以后得到的间性杂合的须霉属菌株，包含有高于10毫克/克干重的β-胡萝卜素。含量高于20毫克/克干重较好，含量高于25毫克/克干重更好。生长条件为在暗处的培养皿内，其中含有固体基本培养基，温度22℃生产率的进一步提高可以通过添加β-胡萝卜素合成激活剂来实现，如添加维生素A，β-紫罗酮或本领域已知的类似化合物。
实验间性杂合须霉属菌株培养和β-胡萝卜素生产的葡萄糖-天门冬酰胺琼脂基本培养基的制备如下葡萄糖-天门冬酰胺琼脂培养基溶液A2.0克L-天门冬酰胺，5.0克KH2PO4，20毫升浓缩物，480毫升蒸馏水。
溶液B20克葡萄糖、20克琼脂、500毫升蒸馏水。
分别消毒后混合。
浓缩物(50X)向800毫升蒸馏水中依次加入以下各种化学药品，在加入一种之前充分溶解好25克MgSO4·7H2O，100毫克硫胺HCl，5毫升微量元素母液，10毫升钙母液。用蒸馏水将体积加至1升，再加入2-3毫升氯仿，存放于室温条件下。
微量元素母液向100毫升的蒸馏水中依次加入下列化学药品，在下一种加入之前要充分溶解2克柠檬酸、1.5克Fe(NO3)3·9H2O，1克ZnSO4·7H2O，0.3克MnSO4·HO，0.05克CuSO4·5H2O，0.05克Na2M0O4·2H2O。加入1-2毫升氯仿，存放于室温下。
钙母液
28克CaCl2·2H2O，172毫升蒸馏水。加入1-2毫升氯仿，并放置于室温下。
培养在塑料培养皿(直径8.5cm)中放入25毫升的上述生长和生产培养基，接种一片1-25m m2的营养菌丝体或大约10，000个热激活孢子。
通过把孢子在蒸馏水中的悬浮液升温至48℃，10分钟热激活这些孢子。接种后把培养皿于黑暗中在22℃培养5-8天。
菌丝体的收获用于提取β-胡萝卜素的菌丝体可由以下方法收获将琼脂菌丝体饼从盘中取出，倒置于铝箔上，然后用盘盖或软膏刀将琼脂刮去，并用滤纸轻压菌丝体，这些操作在正常室内光线下进行，但菌丝体尽量由铝箔包裹保存，而提取是在小房间内弱光下进行。
β-胡萝卜素的提取。
菌丝体在-20℃冷冻1-2小时，并冷冻干燥16-20小时。然后称干重，并且用研棒将丝体在一个干净的研钵中与海砂匀浆，直至其成为很细的粉末。利用40-60℃的石油醚反复萃取回收β-胡萝卜素，直至粉末颜色褪尽。萃取物被收集在一个置于冰桶中的玻璃管内，并以低速进行离心分离。干净的β-胡萝卜素萃取物在BuchiRE-111旋转蒸发器内，45℃温度下蒸发，并且再溶解在10毫升的n-己烷中。如需要可以进行稀释，并且记录下250～550nm的吸收光谱。β-胡萝卜素的含量通过峰值消光系数来计算，该系数假定为E(1cm，1%)＝2500(波长为450nm)。
菌株下列菌株已保存在Baarn的CentraalBureauVoordeSchimmelcultures(TheNetherlands)处三孢须霉(Phycomycesblakesleeanus)S563，S571-S573，S596-S600，于1992年4月28日入藏，入藏号为S563，CBS225.92;S571，CBS226.92;S572，CBS277.92;S573，CBS228.92S596，CBS229.92;S597，CBS230.92;S598，CBS231.92;S599，CBS232.92;S600，CBS233.92。
例1间性杂合须霉属菌株的构建将带有carF突变和(+)交配型的三孢须霉深黄色β胡萝卜素超产菌株S563与(-)的携带有carA突变的白色菌株C2杂交，其方法为本领域已知技术(E.Cerda′-Olmedo和E.D.Lipson编著，Phycomyces，361 ff.Cold Spring Harbor laborcotory 1987)。在杂交的后代中，可将缺少一种交配型的均匀的深橙色菌落分离，它们的菌丝体具有假柄(pseadophores)，表示构成的性相互作用。让深橙色的菌落形成孢子，并且将其放在葡萄糖一天门冬酰胺琼脂上，以检查它的核稳定性。这些菌株是间性杂合体(S571-S573和S596-S598)。
这些间性杂合体生长十分正常，并很稳定，以致不会出现色斑分离，它们产生的孢子比普通野生型的少这是所有情况下的正常特征，包括性刺激。它们的生长和孢子形成远比超产间性异核体的要好(F.J.MurilloAraujo等人，Appl.Environ.Microbiol.36(1978)，639-642;F.J.MurilloAraujo等人的美国专利4，318，987(1982))。
性互作的一个良好标示是三孢子酸一毛霉目的性激素的产生。当三个间性杂合体在含有天门冬酰胺和以谷胺酸-钠为氮源(分别为0.2和2.0克/升)的基本培养基(一种性互作培养基，R.P.Sutter，Proc.Natl.Acad.Sci.USA72(1975)127-130)中生长8天后，其培养基中的三孢子酸的浓度为1-1.4μg/ml。这一数值相当于培养物中每克菌丝体干重含有200-300μg的三孢子酸。对三孢子酸用化学方法萃取，并由分光光度计测定(R.P.Sutter，Science168(1970)，1590-1592)。
选择其所产生的孢子能形成均一的深橙色菌丝体的生长良好的菌落用于生产目的。
表1表示新的间性杂合体与各种对照的β-胡萝卜素产率比较。
表1选择的须霉属菌株的β-胡萝卜素的产率水平5菌株菌株种类β-胡萝卜素(mg/g干重)C2car A(-)0-<0.00110S563car F(+)5.60C2*S563异核体0.10-0.65car A*car FS571间性杂合体15.8-18.815S572间性杂合体11.2S573间性杂合体15.620＊将培养物于22℃在葡萄糖-天门冬酰胺基本琼脂培养基上生长8天。
例2间性杂合须霉属菌株的构建在另一种方法中，利用将一种交配型基因转移到另一种相反交配型的受体菌株中的方式将两种交配型结合成一个单核。然后，按照Ootaki等人公开的方法(JapaneseJ.ofGenetics66，(1991)，189-195)，将来自供体菌株λ噬菌体基因库的300-400毫微克DNA注射到受体菌株的20个孢子囊中。作为受体菌株，使用具有(+)交配型的β-胡萝卜素生产菌株。这里我们使用了β-胡萝卜素生产菌株NRRL1554作为受体菌株，作为供体DNA，使用由λ噬菌体的基因库分离出来的DNA，该基因库含有具有相反交配型的NRRL1554菌株的DNA。为了构建λ噬菌体基因库，将NRRL1555DNA用Sau3A进行部分降解，并且按照本领域已知方法将12-20kb的DNA片段克隆到噬菌体λ2761的BamHI酶切位点上(Avalos，J.，L.M.Corrochano和S.Brenner，FEBSLett.286(1991)，176-180)。
由于转化频率可达10%，带有两种交配型位点的菌落可以利用它们的变异形态和提高的β-胡萝卜素的含量直接筛选，无需选择标记。
产生的很多菌落(达1%)与背景菌株相比颜色较暗。经过纯化后的这种菌落产生的胡萝卜素比亲本多10倍。这些突变体稳定，能正常形成孢子。
表2表示选择的须霉属菌株的β-胡萝卜素产率水平表2选择的须霉属菌株的β-胡萝卜素产率水平菌株菌株种类β-胡萝卜素*(mg/g干重)NRRL1554(+)野生型0.04025NRRL1554(-)野生型0.046S599NRRL1554受体0.40NRRL1555供体S600NRRL1554受体0.10NRRL1555供体＊将培养物于22℃在葡萄糖-天门冬酰胺琼脂基本培养基上生长8天。
例3选择的须霉属菌株在浸没条件下的生长菌株S571与S572在如下所述的摇瓶培养物中生长。发酵培养基的制备如实验部分中所述，但应从溶液B中略去琼脂。于500ml Erle-nmeyer摇瓶中装入25ml或100ml培养基，按已知方法灭菌，然后接种热激活孢子，使浓度达到每ml培养基含0.5×102个孢子，或是接种从长满菌丝的培养皿上获得的一块10-25mm2的菌丝体块。
生长和β-胡萝卜素的产生在22℃暗处进行。
100ml培养物在旋转摇床上(250rpm)培养3天(A)，有时则在上述培养之后再进行4天无振荡培养(B)。
25ml培养物在无任何振荡条件下培养12-16天(C)。
所得结果如表3所示表3选择的须霉属菌株在浸没培养中β-胡萝卜素产率
30菌株β-胡萝卜素产率(mg/g干重)条件S5711.0A, 孢子35S5720.9A, 孢子S5711.2B, 孢子S5721.7B, 孢子S5712.9B, 菌丝体S5723.0B, 菌丝体40S5718.4C, 菌丝体S5726.0C, 菌丝体
权利要求
1.一种须霉属(Phycomyces)菌株，其特征在于它是间性杂合体。
2.如权利要求1所述的须霉属菌株，其特征在于当其在装有基本固体培养基的培养皿中生长6-8天后，所产生的β-胡萝卜素的量高于10mg/g干重。
3.如权利要求1或2所述的须霉属菌株，其特征在于它是三孢须霉(Phycomydes blakesleenus)菌株。
4.一种不采用选择标记而转化须霉属的方法，其特征在于包括以下步骤-提取具有(+)或(-)交配型的须霉属菌株的DNA;-将DNA克隆在不带选择标记的适当载体上;-通过显微注射将所获载体导入相反交配型的须霉属菌株中。
5.一种获得间性杂合的须霉属菌株的方法，包括-提取具有(+)或(-)交配型的须霉属菌株的DNA;-将DNA克隆在不带选择标记的适当载体上;-通过显微注射将所获载体导入相反交配型的须霉属菌株中;-筛选间性杂合菌株。
6.一种生产β-胡萝卜素的方法，包括采用间性杂合的须霉属菌株。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于间性杂合须霉属在浸没条件下生长，β-胡萝卜素是从菌丝体中提取。
全文摘要
本发明公开了间性杂合的须霉属菌株。与野生型和杂合须霉属菌株相比该菌株的β-胡萝卜素产率得到提高。本发明还公开了一种不采用选择标记而获得须霉属转化子的方法。另外，还提供了一种生产β-胡萝卜素的方法，包括采用浸没培养的间性杂合须霉属菌株。
文档编号C12N15/09GK1079001SQ93105199
公开日1993年12月1日 申请日期1993年4月3日 优先权日1992年4月3日
发明者E·塞达尔-奥米多, B·J·梅赫塔, P·W·M·范迪杰克, B·P·凯克曼 申请人:吉斯特·布罗卡迪斯公司