专利名称：新型高亲和性肿瘤杀伤细胞(t-ak细胞)制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用细胞工程和免疫技术制备肿瘤生物治疗-过继细胞免疫治疗(ACIT)的高亲和性肿瘤杀伤细胞制剂。
用自体或同种异体的肿瘤杀伤细胞(TKC)在体外培养扩大增殖后，回输给病人治疗肿瘤的疗法称为ACIT。ACIT是八十年代发展的肿瘤治疗新疗法，在临床上正在成为肿瘤的第四疗法。目前ACIT临床治疗中，白细胞介素-2(IL-2)激活的杀伤细胞(LAK)治疗多种晚期肿瘤，临床表现只对黑色素瘤，肾细胞癌效果较好，对其它肿瘤疗效差，总有效率为20％。肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)治疗黑色素瘤和卵巢癌已在临床试用，有效率尚待确定。成功的ACIT要求大量TKC(＞1010)，但LAK体外增殖弱，培养10天左右不能继续增殖，TIL在体外扩增到可用于治疗量，一般需要1-4个月，并且LAK和CTL在体外长期培养，其杀伤活性会下降或丢失。在TKC中，细胞毒T淋巴细胞(CTL)是抗肿瘤最主要的细胞，发展CTL的治疗是当今ACIT的战略性方向。传统方法诱导CTL产生是用自体肿瘤细胞和淋巴细胞(PBL)混合培养，经克隆选择产生特异CTL，但成功率低，特异CTL只杀伤带有它所识别的抗原的肿瘤细胞，而人肿瘤是带异质性抗原的细胞群体，至今特异CTL在临床治疗较少。另一方法，用抗CD3和IL-2活化的TKC，称CD3-AK，它具有非特异CTL功能，比LAK和TIL增殖快，但不提高杀伤力。国外报导CD3-AK输入体内，能到达肿瘤部位，但无杀伤力。由此可见，提高TKC体外扩增和杀伤力是解决目前ACIT缺点中的关键。
本发明的目的是针对现今ACIT存在的缺点，发展新方法，研制新的激活的TKC，达到TKC在体外迅速增殖，长期培养不丢失杀伤活性，输入体内有杀瘤效应，以提高临床治疗肿瘤有效率。
本发明的内容和要点1.根据免疫生物学和肿瘤免疫学理论，设计采用可溶性肿瘤相关抗原(STAA)和抗CD3单克隆抗体(以下简称抗CD3)共同刺激培养淋巴细胞的方法，替代传统采用完整肿瘤细胞和淋巴细胞混合培养诱导产生CTL的方法。STAA诱导识别肿瘤细胞各种抗原的前体CTL活化，产生多克隆CTL混合群，适合于人肿瘤细胞抗原异质性所需要的杀伤细胞。抗CD3选择性激活T细胞，使其表达高亲和力IL-2受体，可以在低量IL-2培养液中迅速扩增，制备出大量TKC供临床治疗用2.主要材料的制备(1)抗CD3的制备抗CD3单克隆抗体杂交瘤细胞接种Balb/c小鼠腹腔，产生腹水抗体，用硫酸胺沉淀和sephadex G-200柱层析法纯化抗体，通过SDS-PAGE电泳鉴定抗体纯度，用刺激淋巴细胞增殖法测定抗体活性和抗体促增殖作用最适浓度为50ng/ml。
(2)可溶性肿瘤相关抗原(STAA)的制备肿瘤细胞的分离手术切除的新鲜肿瘤组织剪成细小块，超声波打碎，加入RPMI-1640液，经60目钢筛过滤，肿瘤细胞通过钢筛，收集细胞，用0.15M磷酸缓冲液(PBS)pH7.2洗三次，检测活细胞数。
抗原提取按108细胞和1ml 3M KCl-PBS pH7.2比例，加入玻璃试管混合，放4℃连续震荡24小时，离心15000转/分，60分钟，4℃。吸出上清，内含细胞表面膜蛋白、细胞内蛋白及核酸，透析在PBS液(体积为上清的20倍)24小时，每8小时换PBS液一次，4℃下震荡，透析过的提取物离心15000转/分，30分钟，4℃，取出上清抗原。
抗原纯化上清抗原用同体积4M硫酸胺沉淀，放4℃，搅拌1小时，离心15000转/分，1小时，4℃。沉淀物溶解在5ml PBS，溶解液在PBS透析(200倍体积)，4℃下搅拌4小时。溶解液离心15000转/分20分钟，4℃下，取上清，用0.45μm孔膜过滤菌。滤过的溶解液即为STAA，经紫外分光光度计波长280nm测定蛋白浓度，保存-80℃备用。用SDS-PAGE和琼脂电泳测定STAA成分。
3.STAA和抗CD3共同刺激培养(1)淋巴细胞(PBL)的分离新鲜血用肝素抗凝，用白细胞分离液梯度密度离心法，分离出PBL。
(2)共同刺激培养1×106PBL，2ugSTAA，抗CD3 50ng在1毫升含10％人AB血清的RPMI-1640完全培养液(CM)中，培养物在200毫升培养瓶，37℃，5％CO2孵箱刺激48小时，取出细胞离心，弃去上清，细胞放入新鲜CM含IL-2500u/ml扩大增殖培养，以后每3-4天计数细胞，细胞浓度调至1×106/ml在新鲜CM含IL-2500u/ml中，继续扩增培养。
4.细胞的增殖、杀伤和表型检测结果上述共同刺激培养激活的细胞于第三天开始数目增多，到第14天扩增殖26倍，持续生长21天，在同样IL-2浓度下增殖比CD3-AK高8倍，比LAK高15倍。激活的细胞对STAA来源的肿瘤细胞杀伤率95％以上，对NK敏感的K562细胞杀伤率为18％。激活的细胞中CD3+94％，CD4+20％，CD8+95％。检测结果表明STAA和抗CD3共同刺激PBL培养，诱导产生了CD8+为主的异质细胞毒T细胞群(CTL)，具有对STAA来源的肿瘤细胞高亲和性杀伤能力，在体外扩增快，能较长期增殖。我们称这种STAA和抗CD3共激活的TKC为T-AK细胞(肿瘤可溶性抗原激活的杀伤细胞)。
5.STAA和抗CD3共同刺激培养的重复性和T-AK细胞临床治疗初步结果从肾细胞癌、黑色素瘤、胃癌组织和卵巢癌细胞株提取的STAA和抗CD3共同刺激PBL培养共50批，制备这些肿瘤的T-AK细胞均获大量扩增。肾细胞癌的T-AK治疗晚期患者14例，有效率35.7％，高于国外报告LAK细胞治疗肾细胞癌有效率(32％)。
本发明优点和积极效果T-AK细胞在低浓度IL-2培养中能扩增，可节省IL-2用量，在相等IL-2浓度培养条件下，T-AK增殖高于CD3-AK和LAK细胞。本研究制备的STAA包含细胞表面膜蛋白、细胞内蛋白和核酸，作为刺激物，其免疫原强。STAA和抗CD3共同刺激PBL培养优于肿瘤细胞和PBL混合培养，前者无需等待肿瘤细胞死亡，培养10天左右，细胞大量增殖就可用于临床治疗，后者要等待肿瘤细胞完全死亡，约培养20多天，才能收集细胞用于治疗。T-AK细胞是多克隆CTL混合群，适合于人肿瘤抗原异质性所需要的杀伤细胞。T-AK细胞治疗晚期肾细胞癌患者的有效率高于国外报告LAK细胞治疗肾细胞癌的有效率。这些表明T-AK细胞是ACIT有效的杀癌细胞制剂，预期会产生较满意的社会效益和经济效益。
权利要求
1.一种新型高亲和性肿瘤杀伤细胞(T-AK细胞)制剂，其特征是用可溶性肿瘤相关抗原和抗CD3单克隆抗体共同刺激淋巴细胞，诱导细胞毒T-淋巴细胞CTL。
2.根据权利要求1所述的制剂，其特征是用15000转/分速度分离3MKCL溶解的肿瘤细胞，使细胞表面膜蛋白(主要组织相容性抗原)、细胞内蛋白和核酸留在上清，收集上清部分，即为可溶性肿瘤相关抗原。
3.根据权利要求1所述的制剂，其特征是可溶性肿瘤相关抗原和抗CD3单克隆抗体共同刺激淋巴细胞的培养条件为1×106PBL，2ug STAA，抗CD350ng在1毫升含10％人AB血清的RPMI-1640完全培养液(CM)中，培养物在孵箱刺激48小时，取出细胞离心，除弃上清，细胞放入新鲜CM含IL-2500u/ml，扩大增殖培养，以后每3-4天计数细胞，细胞浓度调至1×107ml在新鲜CM含IL-2500u/ml中，继续扩增培养，得到以CD8+为主的异质细胞毒T细胞群(CTLs)。
全文摘要
本发明是根据免疫生物学和肿瘤免疫学原理，设计采用可溶性肿瘤相关抗原和抗CD
文档编号C12N5/0783GK1116549SQ9410807
公开日1996年2月14日 申请日期1994年8月9日 优先权日1994年8月9日
发明者陈毓仙, 李艳芬, 石卫 申请人:中国医学科学院肿瘤研究所