阻止异常剪接的反义寡核苷酸及其使用方法

文档序号:448207阅读:1116来源:国知局
专利名称:阻止异常剪接的反义寡核苷酸及其使用方法
技术领域
本发明是利用从国家卫生研究院(NIH)获得的政府资助完成的,基金号为GM32994,政府对本发明拥有一定权利。
本发明涉及阻止前mRNA分子异常剪接和用反义寡核苷酸正调节基因表达的方法,以及用于相同目的的反义寡核苷酸。
寡核苷酸作为基因表达调节剂的可能性是当前值得认真研究的。大多数尝试集中在抑制像癌基因或病毒基因这样的靶基因表达。寡核苷酸或是针对RNA的(反义寡核苷酸)(M.Ghosh and J.Cohen,Prog.Nucleic Acid Rev.Mol.Biol.42,79,(1992);L.Neckers etal,Crit Rev Oncog.3,175(1992))或是针对DNA的,它们形成三链体结构阻止了由RNA聚合酶II的转录(J.Hanrey et al.,Science258,1481(1992);W.Mcshan et al.J.Biol Chem.267,5712(1992);M.Grigorier et al.,J.Biol.Chem.267,3389(1992));G.Duval—Valentin et al.,Proc Natl.Acad.Sci.USA 89,504(1992))。为了获得预期的效果,寡核苷酸必须通过有效地阻止事先存在的,不合需要的蛋白质从头形成从而消除它。这种技术不能应用到目标为正调节天然蛋白质产生的领域。然而,假如因为突变,基因表达被负调节的话,那么通过反义技术正调节基因表达的手段将是非常有用的。
本发明提供了利用反义寡核苷酸正调节含有突变的DNA的表达,否则该突变将通过基因编码的前mRNA的异常剪接负调控该基因的表达。
因此,本发明第一方面就是阻止含有突变的前mRNA分子的异常剪接的方法。当前mRNA存在突变时,突变造成前mRNA不正确剪接并产生与前mRNA形成的mRNA不同的异常mRNA或mRNA片段。更具体地讲,前mRNA分子含有(i)确定天然内含子的第一组剪接元件,当不存在突变时通过剪接除去天然内含子,产生编码天然蛋白质的第一种mRNA分子,(ii)由突变造成的第二组剪接元件,该组剪接元件确定与天然内含子不同的异常内含子,当存在突变时通过剪接除去异常内含子产生与第一种mRNA分子不同的第二种异常mRNA分子。该方法包括反义寡核苷酸与前mRNA分子杂交。在允许剪接条件下产生双链体分子。反义寡核苷酸不激活RNA酶H,并且选择阻断第二组异常剪接元件中的一个成员,从而通过剪接除去天然内含子、产生编码天然蛋白质的第一种mRNA分子。
本发明第二个方面是正调节含有编码天然蛋白质的DNA的细胞中天然蛋白质表达的方法,该DNA还含有通过其异常剪接引起负调节天然蛋白质的突变。更具体地讲,DNA编码前mRNA,前mRNA具有前面所列的性质。本方法包括给细胞具有前面所述性质的寡核苷酸,以通过剪接除去天然内含子,细胞产生天然蛋白质。
本发明第三个方面是反义寡核苷酸,该反义寡核苷酸用于阻止含有突变的前mRNA分子的异常剪接,前—mRNA分子含有前面所述性质的第一组和第二组剪接元件。反义寡核苷酸包括的核苷酸(i)与前—mRNA杂交形成双链体分子;(ii)不激活RNA酶H;(iii)阻断第二异常剪接元件组的一个成员。
本发明前面和其它目标及方面在图中和下列说明中详细阐述。
附图的简要说明

图1显示了前mRNA的结构,盒子代表外显子,粗线代表内含子。与IVS1和IVS2核苷酸1相关的突变位置(110和705)分别在HB△6克隆上面显示,下面的数字表明外显子和内含子的核苷酸长度。反义寡核苷酸用带数字短线在β110和IVS705下面标出,剪接方式用破折线表示。
图2显示了用寡核苷酸1回复异常剪接,寡核苷酸1是针对β珠蛋白前mRNA内含子1的正常分支点。产物和中间体的结构在右边描述,它们的核苷酸大小在左边显示出来。星号表示含有套索的中间体的异常迁移。下面的图中使用同样的符号。泳道1显示对照HB△6前—mRNA的剪接;泳道2显示β110前—mRNA的剪接;泳道3—8显示在逐渐增加寡核苷酸1的量(在图上部表明)的情况下β110前—mRNA的剪接;泳道9显示存在寡核苷酸3时,β110前—mRNA的剪接,寡核苷酸3是针对β—珠蛋白前—mRNA内含子2的序列。
图3显示了寡核苷酸2的作用,它针对β110—前—mRNA内含子1中的异常3’剪接位点。泳道1显示了β110前—mRNA的剪接;泳道2—7显示在寡核苷酸2的量(如图的上部所示)逐渐增加时β110前—mRNA的剪接。
图4显示了用寡核苷酸3和寡核苷酸4回复IVS2705前—mRNA的异常剪接,寡核苷酸针对隐蔽3’剪接位点,寡核苷酸4针对IVS2705前—mRNA内含子2中异常5’剪接位点。泳道1显示原料RNA;泳道3和3显示对照转录物(在图上部表明)的剪接;泳道4—8和9—13显示分别存寡核苷酸3和寡核苷酸4时IVS2705前—mR-NA的剪接。反应中寡核苷酸的量在上部标明。左边的“?”表示明显的降解产物。
图5显示了LIPOFECTINTM转染试剂存在时,用针对3’隐蔽剪接位点的反义寡核苷酸2’—O—甲基—核糖寡核苷酸(17—mer)处理细胞的结果。泳道1、3和5,经逆转录聚合酶链反应(RF—PCR)的总纤维素RNA,逆转录聚合酶链反应用引物A进行(特异性检测前—mRNA的异常剪接),在2,4和6泳道中,用引物C进行RT—PCR(特异性检测前—mRNA正确剪接)。在凝脉泳道图下面图解了没有剪接的前—mRNA及其正确剪接和异常剪接的产物。泳道1和2显示了从LIPOFECTINTM转染试剂处理的细胞中获得的前—mRNA的剪接和从2’—O—甲基—寡核糖核苷酸处理的细胞中获得的3μM前mRNA的剪接,泳道3和4显示单独用LIPOFETCTINTM转染试剂处理的细胞中的剪接;泳道5和6显示未处理细胞的前mRNA的剪接。
图6和上面图5相似,显示了在复制缺陷腺病毒颗粒存在时用5μM和20μM针对3’隐蔽剪接位点的反义寡核苷酸处理IVS2—654*细胞的结果。分别用与人β—珠蛋白基因中第二和第三个外显子杂交的引物进行RT—PCR。泳道1显示未处理细胞的前mRNA的剪接;泳道2和3显示腺病毒存在时分别用5μM和20μM寡核苷酸处理的细胞中前mRNA的剪接。
图7和上面图5相似,显示了用5μM或50μM针对异常5’剪接位点的反义寡核苷酸2’—O—甲基—核糖寡核苷酸处理的IVS2—654*细胞电穿孔结果。泳道1显示未处理细胞的前—mRNA的剪接。泳道2和3分别显示用5μM和50μM寡核苷酸处理的细胞前—mRNA的剪接。
内含子是真核生物DNA中位于两个编码区即外显子之间的部分。内含子和外显子转录出的RNA被称为“初级转录物,mRNA前体(或前mRNA)。”内含子必须从前mRNA中除去以便产生由外显子编码的天然蛋白质(这里天然蛋白质是指天然存在的、野生型、或功能性蛋白质)。在剪接过程中内含子从前mRNA中除去,外显子连接起来。
实际上剪接反应是在转录后翻译前由剪接因子介导的在RNA上进行的一系列反应。因此前mRNA是既含内含子又含外显子的RNA;mRNA是内含子被除去,外显子顺序连在一起,可被核糖体转录出蛋白质的RNA。
内含子是由一组“剪接元件”确定的,剪接元件是与进行剪接反应的各种剪接因子结合的相对短的、保守的RNA片段。因此每个内含子是由5’剪接位点,3’剪接位点和位于二者之间的分支点确定下来的。正如本文中所讨论的那样,当反义寡核苷酸全部或部分与剪接元件重叠,或者在非常靠近元件的位置与前mRNA结合从而破坏了介导元件上特定剪接反应的剪接因子的结合和功能时,这些剪接元件被“阻断”(例如在要阻断元件的3、6、9、12、15或18核苷酸处与前mRNA结合)。
天然DNA和前—mRNA中的突变可能是取代突变或者是缺失突变,这些突变形成新的异常剪接元件。异常剪接元件是形成异常内含子的异常剪接元件组中的一个成员。异常剪接元件组中剩余成员也可能是决定天然内含子的剪接元件组的成员。例如如果突变在天然3’剪接位点上游(即5’方向)和天然分支点下游(即3’方向)形成一个新的异常3’剪接位点,那么天然5’剪接位点和天然分支点既是天然剪接元件组成员也是异常剪接元件组成员。在其它情况下,突变可能激活处于正常休眠状态的或不起剪接元件作用的RNA的天然区域,并且起剪接元件的作用。这样的元件被称为“隐蔽”元件。例如,如果突变在天然3’剪接位点和天然分支点之间形成一个新的异常突变的3’剪接位点,那么可能激活位于异常突变3’剪接位点和天然分支点之间的隐蔽分支点。在其它情况下,突变可能在天然分支点和天然5’剪接位点之间造成另一个异常5’剪接位点,并且进一步顺序激活异常突变的5’剪接位点上游的隐蔽3’剪接位点和隐蔽分支点。在这利情况下,一个天然内含子被分成两个异常内含子。进一步说,在天然剪接元件(特别是分支点)也是异常剪接元件组成员的情况下,可能阻断天然元件,激活隐蔽元件(即隐蔽分支点),激活的隐蔽元件将补充天然剪接元件组中剩余成员,以强行正确剪接克服错误剪接。还值得注意的是,当隐蔽剪接元件被激活时,它可能位于内含子中或一个相邻的外显子中。这样,可以根据由特定突变引起的异常剪接元件组合成反义寡核苷酸,以阻断各种不同的剪接元件来实施本发明它可以阻断突变元件,隐蔽元件或天然元件;它可以阻断5’剪接位点,3’剪接位点或分支点。通常,它不阻断决定天然内含子的剪接元件,当然考虑到如上所述的阻断天然剪接元件激活隐蔽元件,激活的隐蔽元件作为天然剪接元件组成员参与正确剪接的情况。
反义寡核苷酸的长度(即它的核苷酸数目)并不是关键的,只要它能选择性地与预期的位置结合并能按常规方法测定。通常反义寡核苷酸的长度从8、10或12个核苷酸列20、30或50个核苷酸。
不激活RNA酶H的反义寡核苷酸可以按照已知的技术合成,见例如Pederson等的美国专利No.5,149,797(这里所引的所有专利文献都并入本文作为参考)。这样的反义寡核苷酸可能是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列,它含有一些结构修饰,这些结构修饰在空间上妨碍或防止RNA酶H与含有此寡核苷酸作为其一成员的双链体分子结合,而结构修饰基本不能妨碍或破坏双链体的形成。因为在双链体形成中涉及的寡核苷酸部分完全不同于那些RNA酶H结合部分,所以可得到许多不能激活RNA酶H的反义寡核苷酸。例如,这样的反义寡核苷酸可能是其中至少一个或全部核苷酸间桥连磷酸酯残基是被修饰的磷酸酯的寡核苷酸,像膦酸甲酯、硫代膦酸甲酯、吗啉—1—基磷酸酯(Phosphoromorpholidate)、哌嗪—1—基磷酸酯(phosphoropiperazidate)和氨基磷酸酯。例如,每隔一个核苷酸间桥连磷酸酯残基就可能如上所述被修饰。在另一个非限制实例中,这样的反义寡核苷酸是至少一个或全部核苷酸含有2’低级烷基的寡核苷酸(例如C1—C4线性的或分枝的、饱和的或不饱和的烷基,像甲基、乙基、乙烯基、丙基、1—丙烯基、2—丙烯基和异丙基)。例如每隔一个核苷酸就可能如上所述被修饰。也可以参见P.Furdon等.Nucleic Acids Res.17,9193—9204(1989);S.Agrawal等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA87,1401—1405(1990);C.Baker等,NucleicAcids Res.18,3537—3543(1990);B.Sproat等.Nucleic Acids Res.17,3373—3386(1983);R.Walder和J.Walder.Proc Natl.Natl.Acad.Sci.USA85,5011—5015(1988)。
本发明的方法,寡核苷酸和制剂具有各种各样的用途。它们对任何如下的发酵过程是有用的,需要在某一时间之前对表达基因进行负调节,之后正调节基因表达(例如,在发酵的生长期期间是负调节,在发酵的生产期期间是正调节)。对于这样的用途来说,被表达的基团可以是要发酵产生的蛋白质的编码基因,只要基因含有天然内含子。该基因可用任何合适的方法突变,如位点特异性诱变(见T.Kunkel美国专利No.4,873,192),以故意造成异常的第二组剪接元件,它确定了一个负调节基因表达的异常内含子。利用标准的重组技术将基因插入到合适的表达载体中,将表达载体导入宿主细胞(例如,像酵母、昆虫或哺乳动物细胞(如人,大鼠)这样的真核细胞)中。宿主细胞用标准发酵技术培养生长。当期望正调节突变基因的表达时,将反义寡核苷酸加到培养基中,以便正调节基因表达,反义寡核苷酸以合适的配方加入,与异常第二剪接元件组中某个成员结合。
本发明的方法,寡核苷酸和制剂也是可用做检查人和动物基因剪接的体外或体内工具,这些基因是由发育和/或组织调节的。这些实验可以按下面讨论的方法或其改进方法进行,这些对本领域技术人员都是显而易见的。
本发明的方法,寡核苷酸和制剂也可用做治疗涉及异常剪接疾病的治疗剂。例如β—地中海贫血(寡核苷酸与特别是人的β—珠蛋白前mRNA结合);α—地中海贫血(寡核苷酸与α—珠蛋白前mRNA结合);泰萨氏综合症(寡核苷酸与β氨基己糖苷酶α亚基的前mR-NA结合);苯丙酮酸尿症(寡核苷酸与苯丙氨酸羟化酶前mRNA结合)和某些类型的囊性纤维化(寡核苷酸与囊性纤维化基因前mRNA结合),这些疾病中导致前mRNA异常剪接的突变已被证实(见,例如,S.Akli等,J.Biol.Chem.265,7324(1990);B.Dworniczak等,Genomics 11,242(1991);Tsui Trends in Genet.8,392(1992))。
本发明可以治疗包括β110、IVS15、IVS16、IVS2654、IVS2705和IVS2745突变种类的β—地中海贫血,但不局限于这些突变类型(β珠蛋白前mRNA带有上述的突变)。
“反义寡核苷酸”这—术语包括其生理和药物可接受的盐例如,保留母化合物的所需生物活性而不具有不想要的毒理效应的盐。这些盐的实例为(a)与阳离子如钠离子、钾离子、NH4+、镁离子、钙离子,多胺如精胺和亚精胺等形成的盐;(b)与无机酸,如盐酸、溴化氢、硫酸、磷酸、硝酸和同类的酸形成的酸加成盐;(c)与有机酸,如醋酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、单宁酸、棕榈酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等形成的盐;(d)与阴离子,如氯、溴、碘形成的盐。
本发明的制剂包括在生理和药物上可接受的载体,如水溶性载体中的反义寡核苷酸。这样,本发明所用的制剂包括那些适用于非肠道给药方式的制剂,包括皮下、真皮下、肌肉、静脉、动脉给药,同样也可以局部给药(例如,患囊肿纤维化的病人可经肺吸入微粒的雾剂给药),但不局限于上述给药方式。制剂可以用单位剂量方便地给药并且可在本领域中已知的方法制备。在任何特定的情况下,最合适的给药途径依赖于治疗对象、性质和严重程度、及选用的特定活性化合物。
如前面所述,本发明提供了具有前面所列性质的反义寡核苷酸在制备用于患如上所述的异常剪接疾病的病人体内正调节基因表达的药物中的用途。在制备本发明药物过程中,反义寡核苷酸一般与一种可接受的载体等混合。当然载体必须与制剂中任何其它成分匹配,而且对病人无害。载体可以是固体或液体。在本发明制剂中可以有一个或多个反义寡核苷酸。这种制剂可以用各利已知的制药技术制备,基本是将各成分混合,其中任选包括一种或多种辅助治疗成分。
本发明制剂包括活性化合物的无菌水和非水注射液,同时制剂最好与受体血液等渗而且无热原。制剂可含有抗氧化剂,缓冲液,抑菌剂和使制剂与预定受体血液等渗的溶质。水和非水无菌悬浮液含有悬浮剂和增稠剂。药物可以存在于单位剂量或多剂量的容器中如密封的安瓿和小玻璃瓶,在冻干条件下贮存,在临使用前只需加入盐水或注射用水等无菌液体载体。
制剂中的反义寡核苷酸可以包含在脂质颗粒或囊泡中,如脂质体和微晶体,这样适于肠外给药。颗粒可以是任何合适的结构,如单片状或多片状,只要反义寡核苷酸含在其中即可。带有正电荷的脂类如N—[1—(2,3—二油酰氧)丙基]—N,N,N—三甲铵硫酸甲酯盐即“DOTAP”特别优选作为这种颗粒和囊泡,这样的脂质颗粒制剂是众所周知的。见,如Janoff等的美国专利No.4,880,635;Kurono等4,906,477;Wallach4,911,928;Wallath4,917,951;Allen等4,920,016;Whentley等4,921,757;等等。
当受治疗者被给药时,反义寡核苷酸给药剂量要根据所用的特定方法、疾病、病人的健康状况、特定的配方、给药途径等来定。通常,希望细胞内寡核苷酸浓度为从0.05至50μM,从0.2至5μM更好。对于人这样的给药对象,所用剂量大约从0.01、0.1或1mg/kg至50、100或150mg/kg。
在下面非限定的实施例中非常详细地解释了本发明,这里所提到的核苷酸序列只是单链,方向5’到3’,从左到右。
实施例1前—mRNA的结构和组建各种人类β—珠蛋白前—mRNA分子的组建和结构如图1所示。盒子代表外显子,粗线代表内含子。在HB△6克隆上面显示了与IVS1和IVS2核苷酸1对应的突变位置(110和705)。下面的数字代表外显子和内含子核苷酸长度。在β110和IVS2705下面用带数字的短线代表反义寡核苷酸(下面将详细讨论的),剪接方式用破折线表示。用SP6 RNA聚合酶(M.konarska等all 38,371(1984))从亚克隆到SP64载体上的人类β—珠蛋白合适片段上转录出所有前mRNA。HB△6(A.Krainer et al.,Cell36,993(1984))含有全部人β—珠蛋白基因。从原始地中海贫血克隆中亚克隆的110结构含有外显子1和2(R.Spritz et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA78,2455(1981))。转录前,质粒在BamHI位点线性化。为了构建IVS2705质粒。含有HB△6完整第二个外显子,完整第二个内含子和第三个外显子主要部分的片段首先亚克隆到SP64中,然后按照已知的技术进行位点特异性诱变(T.Kunkel et al.,Methods Enzymol.154,367(1987)),在内含子705核苷酸处产生T变成G的突变,然后将质粒在PuvII位点线性化,进行转录。
实施例2
合成2’—O—甲基寡核糖核苷酸本实施例所用的2’—O—甲基寡核糖核苷酸是利用Glen Re-search(Sterling,VA)的试剂,按照已知的技术合成的,并且利用USBiochemicals公司的SUREPURETM纯化试剂盒按照已知的技术纯化。
生成的2’—O—甲基寡核糖核苷酸被称为oligo1至oligo5。
oligo1(GUCAGUGCCUAUCA)(SEQID NO1)与内含子1中82—95核苷酸互补,它针对正常分支点处;oligo2(AUAGACUAAUAGGC)(SEQ ID,NO2)与内含子1中103—116核苷酸互补,它针对由β—珠蛋白基因内含子1中β110突变造成的异常3’剪接位点;oligo3(CAUUAUUGCCCUGAAAG)(SEQ ID NO3)与内含子2中573—589核苷酸互补,它针对第二个内含子中579核苷酸隐蔽3’剪接位点;oligo4(CCUCUUACCUCAGUUAC)(SEQID NO4)与697—713核苷酸互补,它针对IVS2705前—mRNA中第二个内含子705核苷酸突变造成的异常5’剪接位点;olig5(GCUAU-UACCUUAACCCAG)(SEQ ID NO5)针对由IVS2654突变(内含子2中643—660核苷酸)造成的异常5’剪接位点;oligo6(GCCUGAC-CACCAAC)(SEQ ID NO6)针对珠蛋白前—mRNA外显子1(对应于内含子1中核苷酸1的—23至—10核苷酸)中隐蔽5’剪接位点。
实施例3针对人β—珠蛋白内含子1正常分支点的反义寡核苷酸回复异常剪接主要在希腊和塞浦路斯血统病人中发生的β110—地中海贫血,人β—珠蛋白的基因的第一个内含子中110核苷酸发生A变成G的突变,从而造成一个附加的异常3’剪接位点(R.Spritz et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA78,2455(1981))。虽然存在正常3’剪接位点,但剪接机器优先使用异常位点从而产生一个错误剪接的mRNA,该mRNA含有内含子的19个核苷酸(图1)。在用β110—珠蛋白等位基因转染细胞(M.Busslinger et al.,Cell27,289(1981),Y.Fukumakiet al,Cell28,585(1982))或在剪接核提取物转录物时(R.Reed andT.Maniatis,Cell41,95(1995)(也可见图2,通道2),正确剪接的mRNA大约只占剪接产物的10%,这一结果与从患有这种类型地中海贫血病中获得的明显低于正常血红蛋白水平的结果是一致的。在β110前mRNA中,异常3’剪接位点和正确3’剪接位点竞争与内含子中93核苷酸处的正常分支点结合,从而阻止正常剪接(R.Reedand T.Maniatis,Cell41,95(1985))。本工作的意义在于失活正常分支点的突变,激活在107核苷酸上的隐蔽分支点,导致在正确的3’剪接位点剪接(Y.Zhuang and A.Weiner,Genes and Dev.3,1545(1989))。因为隐蔽分支点和110位置的突变3’剪接点相近,所以异常剪接不能进行。
为了试验针对正常分支点序列的反义寡核苷酸是否强迫剪接机器选择隐蔽分支点并形成正确剪接的mRNA,一个长度为14个核苷酸的2’—O—甲基—寡核苷酸(寡核苷酸1(SEQ、ID NO.1))针对着β—珠蛋白前mRNA内含子1的分支点序列处。选择2’—O—甲基寡核苷酸做这个和以后实验是因为它对核酸酶有抗性并且和RNA形成不被RNA酶H降解的稳定杂合体(H.Inoue et al.,NucleicAcids Res.15,6131(1987);H.Inoue et al.,FEBS Lctt.215,327(1987);B.Sproat et al.,Nucleic Aoids Res.17,3373(1989))。当使用反义寡脱氧核苷酸或它们的硫代磷酸酯衍生物时,被RNA酶H降解,破坏底物前—mRNA并且阻止任何剪接。
图2显示了针对β—珠蛋白前—mRNA内含子1中正常分支点的寡核苷酸1回复异常剪接。用Hela细胞核提取物在体外进行P32标记的β110前—mRNA(每个反应大约105cpm,25fmoles)剪接,反应2小时,除了反应体积倍增到50μl外基本按已描述过的方法进行(A.Krainer et al.,Cell,36,993(1984);Z.Dominski and R.Kole,Mol.Cell.Biol.12,2108(1992))。反应产物在8%聚丙烯酰胺测序凝胶上分析并且放射自显影显色。右边显示了产物和中间体的结构,左边显示了它的核苷酸大小,星号代表含有套索中间体的异常迁移。泳道1,对照HB△6前mRNA的剪接;泳道2,β110前—mRNA的剪接;泳道3—8,存在寡核苷酸1的量(在图上部标明)逐渐增多的情况下,β110前—mRNA的剪接;泳道9,存在寡核苷酸3时β110前—mRNA的剪接,寡核苷酸3的目标为β—珠蛋白前—mRNA内含子2中的序列。
这些数据的分析表明在没有寡核苷酸的对照反应中(图2,泳道2),错误剪接产物和正确剪接产物的比率大约为9∶1。每个反应加入寡核苷酸1的浓度从0.01到1.0μg(0.05—5μM)引起依赖剂量的抑制底物异常剪接和诱导正确剪接(图2,泳道3—6)。寡核苷酸为1.0μg时,剪接产物比率回复到1∶5。寡核苷酸的作用是序列特异性的,因为加入1μg并对β—珠蛋白基因第二个内含子中隐蔽3’剪接位点的寡核苷酸(寡核苷酸3,(SEQ ID NO3),也见下面)不影响剪接产物的原来比率(图2,泳道9)。寡核苷酸1为2.0和4.0μg时,两个剪接位点的剪接都被抑制,形成一个243—mer RNA片段(图2,泳道7—8)。这种片段只在剪接条件下积累,例如在ATP和其它剪接混合物成份存在时,很可能代表在寡核苷酸接合位点被依赖于ATP的核酸酶降解的产物。
β110突变产生的异常3’剪接位点似乎也是异常剪接位点被反义寡核苷酸回复的靶位。强迫剪接机器使用内含子末端原有的3’剪接位点的最简单方法是阻断这个序列。然而针对异常剪接位点的14—mer寡核苷酸(oligo2(SEQ ID NO2))是无效的;当寡核苷酸浓度增加时两种剪接产物的积累都被抑制,正确产物更有效地被抑制(图3泳道2—5)。在关于图2所述的同样条件下进行剪接。令人感兴趣的是,在5’剪接位点裂解并形成套索—外显子中间体这一第一步剪接反应受oligo2的影响似乎比最后形成剪接产物要小。当剪接反应中加入1或2μg寡核苷酸时仍存在中间体,显示出这种作用(图3,泳道5—6)。当加入4μg时,在5’剪接位点的裂解反应被抑制(图3,泳道7)。
寡核苷酸1和2的不同作用反映了寡核苷酸、众多的剪接因子和序列元件之间相互作用的复杂性,序列元件是指位于正常分支点和正确3’剪接位点之间的37个核苷酸序列。很清楚与这一区域5’末端的正常分支点杂交的寡核苷酸1阻止了剪接因子与这一序列的结合,从而强迫剪接因子选择下游的隐蔽分支点,这样就抑制了β110前—mRNA异常剪接并诱导了正确剪接。而寡核苷酸2与位于这一区域中的靶序列杂交,阻止了在这一区域装配的大量剪接因子的结合和任何剪接。同时也注意到这个寡核苷酸阻断一个重要的多嘧啶序列,这个序列对异常和正确3’剪接位点的剪接都是必需的。这就是为什么这个寡核苷酸不能恢复正常剪接的另一种解释。
实施例4
用针对人β—珠蛋白内含子2中5’和3’剪接位点的反义寡核苷酸回复异常剪接异常3’剪接位点能否仍用作同复不正常剪接的靶子还要在人β—珠蛋白基因第二个内含子的705位带有T变G突变的前mRNA上进一步试验。在地中海地区的地中海贫血病人中发现的这种突变(IVS2705,在正常3’剪接位点上游145个核苷酸处造成一个附加的异常5’剪接位点(C.Dobkin and A.Bank,J.Biod.Chem26016332,(1985))。在剪接期间,内含子579位置的3’隐蔽剪接位点被激活,从而切除作为独立内含子的1—578和706—850核苷酸,剩余内含子部分合并到剪接产物中(图1)。在这种RNA中每一个剪接序列元件之间的距离超过100个核苷酸,对于寡核苷酸来说没有空间障碍效应。
图4显示了用寡核苷酸3(SEQ ID NO.3)和寡核苷酸4(SEQ IDNO.4)回复IVS2705前mRNA异常剪接的结果,寡核苷酸3针对隐蔽3’剪接位点处,寡核苷酸4针对于IVS2705前—mRNA内含子2中异常5’剪接位点处。除了RNA转录物使用前用6%测序凝胶电泳纯化外,剪接反应条件与前面关于图2所述的相同。泳道1,原料RNA;泳道2和3,对照转录物的剪接(在图上部标明);泳道4—8和9—13为分别存在寡核苷酸3和寡核苷酸4时IVS2705前—mRNA的剪接,反应中寡核苷酸的量在上部标出,左边的“?”代表明显降解产物。
含有正常β—珠蛋白前—mRNA第二个内含子的对照转录物被有效地剪接(图4,泳道2),形成所期望的中间体(5’外显子和大套索)和451个核苷酸长的正确剪接产物。IVS2705前—mRNA的剪接也可有效进行,产生一个577个核苷酸长的附加剪接产物和预计约348—mer的中间体,这是由突变造成的异常剪接方式形成的(图4,泳道3),RNA正确剪接和不正确剪接的比率为1∶2,与以前在体内获得的结果相似。作用于579核苷酸处被激活的隐蔽3’剪接位点的寡核苷酸3活性很高,诱导向正确剪接方式的剂量依赖性回复剪接(图4,泳道6—8)。每个反应加入0.1和0.4μg寡核苷酸可基本上完全回复。相似浓度的寡核苷酸4也可以获得正确剪接,寡核苷酸4定位于由第二个内含子中705核苷酸突变造成的异常5’剪接位点(图4,泳道9—13)。两者中任何一个寡核苷酸为1和2μg时都没有别的效果,每个反应4μg(20μM)时所有的剪接都被抑制(没有显示)。包括图中用“?”标出的强条带在内的附加条带很可能是由核酸酶降解长的前mRNA(1301个核苷酸)造成的。
这些结果表明隐蔽3’剪接位点和突变5’剪接位点一样为异常剪接的特定回复提供了适当靶子。寡核苷酸3和4的相似作用表明它们与靶剪接位点的结合没有太大的差别。这两个寡核苷酸的效果比图2所示实验中用的寡核苷酸1大约高10倍。这种高性能可能是由于几个因素造成的,寡核苷酸3和4比寡核苷酸1长3个核苷酸,从而与RNA形成更稳定的杂交,它们阻断异常剪接位点,允许剪接机器使用正确剪接位点和(假设)正确分支点。而β110前—mRNA中寡核苷酸1强迫剪接机器利用次最适的隐蔽分支点,这样造成形成正确剪接mRNA的效力较低。在图4所示的实验中,反应2小时后长的原料前—mRNA几乎检测不列,说明它是不稳定的。因此,尽管寡核苷酸的摩尔浓度与以前实验基本相同,但对底物前—mRNA的过量更大。
在前面的实验中,剪接反应中同时加入寡核苷酸和其他组分。寡核苷酸与前mRNA预杂交不能增加它们的效果,反应开始15分钟后即形成剪接复合物后(B.Ruskin and M.Green,Cell43,131(1985))加入寡核苷酸具有同样效果(数据未列出)。这些结果说明含有2’—O—甲基的寡核苷酸能够有效地与剪接因子竞争他们的靶序列。这些化合物的高活性很可能是由于其与RNA的强杂交。
实施例5用阻断IVS1—5和IVS1—6中隐蔽3’剪接位点的反义寡核苷酸回复异常剪接除了地中海贫血突变是IVS1—5和IVS2—6突变外,这个实验基本按上面所述的方法进行,在IVS1—5和IVS1—6突变中IVS1的真正5’剪接位点发生突变。引起地中海贫血的异常剪接明显是由于IVS1—5和IVS1—6突变削弱了5’剪接位点并且允许位于上游16个核苷酸的隐蔽剪接位点成功竞争剪接因子。因为剪接位点与在其他前—mRNA中表现出功能的突变剪接位点相似,所用本实验试验了一个隐蔽剪接位点的反义寡核苷酸是否能回复异常剪接返回突变的5’—剪接位点,并且不管突变而保持正确剪接。所用的寡核苷酸是oligo6(SEQ ID NO6),它是按前面实施例2所述方法产生的2—O—甲基核糖寡核苷酸。
实施例6用阻断IVS2654突变的异常5’剪接位点的反义寡核苷酸回复异常剪接除了所用的人β—珠蛋白前—mRNA含有IVS2654突变,所用的寡核苷酸为oligo5(SEQ ID NO5)外,实验基本按前面所述方法进行。
IVS2654突变经常在个别中国血统的地中海贫血病人中发现,它通过在内含子2中653核苷酸处增加一个5’剪接位点并且激活通用的隐蔽3’剪接位点来影响剪接。IVS2654前mRNA异常剪接效率高于IVS2705前—mRNA异常剪接,在体外剪接时,相对异常剪接产物来说,只检测到少量正确剪接产物。尽管异常剪接效率较高,但针对隐蔽3’剪接位点的oligo3和针对异常5’剪接位点的oligo5,以与前面所述的相似浓度有效地恢复正确剪接。两种寡核苷酸之一浓度为2μM时积累正确剪接产物,而基本检测不到异常剪接产物(数据未列出)。
实施例7用阻断人β—珠蛋白基因内含子1分支点的反义寡核苷酸回复异常剪接除了寡核苷酸与位于β—珠蛋白基因内含子1天然分支点序列近上游的序列(75—88核苷酸)结合外,本实验基本如前面所述的回复β—110前mRNA突变的正确剪接的方法进行。寡核苷酸的序列为CCCAAAGACUAUCC(SEQ ID NO7),恢复了正确剪接。
实施例8构建表达人地中海贫血β—珠蛋白前—mRNA的细胞系用克隆在巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子下的地中海贫血珠蛋白基因转染Hela细胞和CHO细胞,建立了一系列稳定的细胞系。这些基因包括IVS1—110,IVS2—654和IVS1—5突变。
按照标准技术获得了稳定的细胞系。见Current Protocols inMolecular Biology(P.Ausubel et al.编,1987)。简单地说,就是用带有巨细胞病毒启动子控制下的地中海贫血珠蛋白基因的质粒和带有作为选择标记的新霉素抗性基因的质粒(pSV2 neo)共转染细胞。转染可以用电穿孔法(Z.Dominski和R.Kole,Mol,cel.Biol.116075—6083(1991);Z.Dominski and R.Kole,Mol.Cell.Biol.122108—2114(1992)或者用磷酸钙法。细胞涂平板,24—48小时后用含有G418的选择培养基攻击。按下面方法扩增存活的克隆并分析地中海贫血珠蛋白mRNA的表达。
利用商品化的三试剂(Tri—Reagent)(分子研究中心,辛辛那提,俄亥俄州)根据厂商流程从大约105个细胞中分离总RNA,这种方法可供处理大量的小样品,并且获得高产量的高质量RNA。利用rT-th聚合酶,按厂商流程(Perkin Elmer)通过逆转录聚合酶链反应分析剪接模式。在检测瞬时转染的细胞中剪接的RNA时,仅需要1—5%分离的RNA,因此这种方法足够敏感以在稳定细胞系中易于检测。用与地中海贫血mRNA中异常序列杂交并且横跨剪接接合点的3’引物进行逆转录,这样保证传染的DNA和正常珠蛋白RNA不被检测并且不干扰分析。表达地中海贫血前—mRNA的克隆细胞系被用于如下所述的反义2’—O—甲基寡核苷酸处理。
实施例9在细胞培养中反义寡核苷酸的用法前面实施例8产生的细胞在24孔培养板上生长,每孔含有200μl培养基。每孔种入2×104个细胞,当吸附时用含有50μM反义寡核苷酸的200μl培养基处理。细胞在寡核苷酸存在下培养4天达到汇合生长。因为2’—O—甲基寡核苷酸在含有培养基的血清中非常稳定,所以每两天以上更换一次培养基。50μM(每孔40μg)寡核苷酸浓度超过在体外有效率恢复剪接所需浓度100倍。即使按这种浓度算,1μmol规模的一次寡核苷酸合成,产生1—1.6mg寡核苷酸,为25至40个样品提供了足够的原料。
在另一种方法中,根据已知的技术(C.Bennett et al.,Mol.Pharm.411023—1033(1992)),在加入寡核苷酸前用10μg/ml的Lipofec-tionTM试剂(DOTMA,BRL产)预处理细胞。
处理后,用前面方法分离总RNA,通过逆转录—聚合酶链反应验证正确剪接的mRNA的存在。在α—P32标记的ATP存在的情况下进行引物扩增,增加检测灵敏度,把循环次数降到15个。
前面的实施例是对本发明的解释,但不对其构成限制。本发明用下面的权利要求以及本文中所包括的权利要求的等同物来定义。
实施例10脂质体转染被带有IVS2—654地中海贫血突变的人β—珠蛋白克隆稳定转染的Hela基础细胞系用来做下面的实验。IVS2—654细胞系的一个亚克隆表达大量异常剪接的β—珠蛋白mRNA和少量正确剪接的β—珠蛋白mRNA。被称为ISV2—654*的第二个亚克隆表达的异常和正常剪接的β—珠蛋白的mRNA的比率大约为1∶1。用3μM与3’隐蔽剪接位点反义的2’—O—甲基核糖寡核苷酸(oligo3,CAU-UAUUGCCCUGAAAG,SEQ ID NO3)(17—mer)处理大约105个IVS2—654单层细胞,根据厂商说明书在不含血清的OPTI—MEM培养基中用20μg/ml LIPOFECTINTM脂质体转染试剂处理5小时。培养后,去掉培养基,细胞重新回到正常生长培养基中(MEM+10%胎牛血清)。没有处理的细胞和只用Lipofection处理的细胞作为对照。生长过夜后,根据厂商说明用三试剂(Tri—Reagent)(分子研究中心,辛辛那提,俄亥俄州)分离所有细胞RNA,RNA用260nm吸光度定量。
用逆转录—聚合酶链反应(RT—PCR)分析剪接。每个样品的等量RNA用rTth RT—PCR试剂盒(Cetus—Perkin Elmer)分析。除了在RT—PCR反应中加入1μciα—P32标记的dATP外,按厂商说明进行。PCR产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上分析。与人β—珠蛋白基因第二个外显子杂交的寡核苷酸被用作通用引物。异常剪接的特定引物(引物A)横跨异常剪接接合点,而正常剪接引物(引物C)横跨正常剪接接合点(图5)。泳道1、3和5用引物A进行RT—PCR,泳道2、4和6用引物C进行RT—PCR。泳道1、3和5中PCR产物量是泳道2、4和6的1/5。泳道1和2显示3LIPOFECTINTM试剂和3μM 2’—O—甲基寡核糖核苷酸处理的细胞中前—mRNA的剪接;泳道3和4显示只用LIPOFECTINTM试剂处理的细胞中前—mR-NA的剪接;泳道5和6显示未处理细胞中前—mRNA的剪接。注意到在泳道2,用寡核苷酸和LIPOFECTINTM试剂处理的正常剪接明显增加。
实施例11腺病毒介导的转移在106个复制缺陷腺病毒颗粒存在的情况下(d1—312株,Uni-versity of North Cerolina at Chapell Hill Hu博士赠送),用5和20μM2’—O—甲基核糖寡核苷酸(17—mer)处理大约105个单层生长过夜的IVS2—654*细胞,该寡核苷酸与3’隐蔽剪接位点反义(SEQ IDNO3)。病毒和寡核苷酸在OPTI—MEM中预培养30分钟,然后加入到细胞增养物中,继续培养2小时,吸出培养基用正常生长培养基代替。培养过夜后,按前面所述方法分离总RNA。使用分别与人β—珠蛋白基因第二和第三个外显子杂交的引物,按前面所述方法进行RT—PCR反应,等量的PCR产物加样在凝胶上,按前面实施例10的方法分析产物,结果显示在图6中。泳道1显示未处理细胞的剪接;泳道2和3显示在腺病毒存在时,分别用5和20μM寡核苷酸处理的细胞的剪接。注意到对于5和20μM寡核苷酸处理的细胞来说,正常剪接明显增加,同时异常剪接相应减少(剂量依赖性)。
实施例12电穿孔法大约105个单层生成过夜的IVS2—654*细胞被胰蛋白酶消化并在0.5ml OPTI—MEM中转移至10mm电穿孔样品池中。将与5’剪接位点反义的5或50μM 2’—O—甲基核糖寡核苷酸(oligo4,(CCUCUUACCUCAGUUAC),SEQ ID NO4)加到每个样品中,混合物用1500V,0.75μF脉冲电穿孔,所用的电穿孔仪为威斯康辛大学电子实验室产品。电穿孔后,细胞重新悬浮在正常生长培养基中单层生长过夜。按前面所述方法分离总RNA,按前面实施例11所述方法进行RT—PCR分析。
结果显示在图7中。注意到异常剪接明显减小,同时正常剪接相应增加,特别是使用50μM寡核苷酸的情况下。
序列目录(1)一般资料(i)申请人(A)名称北卡罗来纳大学查珀尔希尔分校(B)街区大学4100信箱
(D)城市查珀尔希尔市(D)州北卡罗来纳州(E)国家美国(F)邮编(五位号码)27599—4100(ii)发明题目阻止异常剪接的反义寡核苷酸及其使用方法(iii)序列数7(iv)计算机阅读形式(A)媒介类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC—DOS/MS—DOS(D)软件Patent In Release#1.0,版本#1.25(EPO)(V)本申请数据申请号PCT/US94/05181(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度14个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型RNA(基因组的)(iii)反义是(xi)序列说明SEQ ID NO1GUCAGUGCCUAUCA(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征
(A)长度14个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型RNA(基因组的)(iii)反义是(xi)序列说明SEQ ID NO2AUAGACUAAUAGGC(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型RNA(基因组的)(iii)反义是(xi)序列说明SEQ ID NO3CAUUAUUGCCCUGAAAG(2)SEQ ID NO4的资料(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型RNA(基因组的)(iii)反义是
(xi)序列说明SEQ ID NO4CCUCUUACCUCAGUUAC(2)SEQ ID NO5的资料(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型RNA(基因组的)(iii)反义是(xi)序列说明SEQ ID NO5GCUAUUACCUUAACCCAG(2)SEQ ID NO6的资料(i)序列特征(A)长度14个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型RNA(基因组的)(iii)反义是(xi)序列说明SEQ ID NO6GCCUGACCACCAAC(2)SEQ ID NO7的资料(i)序列特征(A)长度14个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型RNA(基因组的)(iii)反义是(xi)序列说明SEQ ID NO7CCCAAAGACUAUCC
权利要求
1.阻止含有突变的前mRNA分子中异常剪接的方法,其中所述的前mRNA含有确定天然内含子的第一组剪接元件,该内含子在不存在所述突变时通过剪接被除去,产生编码天然蛋白质的第一种mRNA分子;其中所述前mRNA还含有由所述突变诱导的第二组剪接元件,这组剪接元件确定一个与所述天然内含子不同的异常内含子,当所述突变存在时通过剪接除去该异常内含子,产生与上述第一种mR-NA分子不同的第二种异常mRNA分子;所述方法包括反义寡核苷酸与所述前mRNA分子在允许剪接的条件下杂交,产生双链体分子,其中所述反义寡核苷酸不激活RNA酶H;其中所述寡核苷酸阻断所述第二组异常剪接元件的一个成员;以便通过剪接除去上述天然内含子,产生编码蛋白的所述第一种mRNA分子。
2.根据权利要求1的方法,其中所述反义寡核苷酸阻断一个突变的剪接元件。
3.根据权利要求1的方法,其中所述反义寡核苷酸阻断一个天然剪接元件。
4.根据权利要求1的方法,其中所述反义寡核苷酸阻断一个隐蔽剪接元件。
5.根据权利要求1的方法,其中所述反义寡核苷酸阻断一个5’剪接位点。
6.根据权利要求1的方法,其中所述反义寡核苷酸阻断一个3’剪接位点。
7.根据权利要求1的方法,其中所述反义寡核苷酸阻断一个分支点。
8.根据权利要求1的方法,其中所述杂交在细胞内进行,并且所述第一种mRNA在其中翻译成所述天然蛋白质。
9.根据权利要求1的方法,其中所述天然蛋白质是β—珠蛋白。
10.根据权利要求1的方法,其中所述天然蛋白质是人β—珠蛋白。
11.根据权利要求1的方法,其中所述反义寡核苷酸的长度为8至50个核苷酸。
12.根据权利要求1的方法,其中所述反义寡核苷酸含有修饰的核苷酸间桥连磷酸酯残基,这些磷酸酯残基选自膦酸甲酯,硫代膦酸甲酯、吗啉—1—基磷酸酯、哌嗪—1—基磷酸酯和氨基磷酸酯。
13.根据权利要求1的方法,其中所述反义寡核苷酸含有一个在其2’位置具有低级烷基取代基的核苷酸。
14.在含有编码天然蛋白质的DNA的细胞中正调节所述天然蛋白质表达的方法,所述DNA含有通过其异常剪接引起所述天然蛋白质的负调节的突变,其中所述DNA编码前mRNA;其中所述前mRNA含有确定天然内含子的第一组剪接元件,当上述突变不存在时通过剪接除去天然内含子,产生编码所述天然蛋白质的第一种mRNA;其中所述前mRNA还含有所述突变诱导的第二组剪接元件,这组剪接元件确定一个与所述天然内含子不同的异常内含子,当所述突变存在时通过剪接除去该异常内含子,产生与上述第一种mRNA不同的第二种异常mRNA;所述方法包括给予所述细胞反义寡核苷酸,反义寡核苷酸在允许剪接的条件下与所述前mRNA杂交,产生双链体,其中所述反义寡核苷酸不激活RNA酶H;其中所述反义寡核苷酸阻断上述第二组异常剪接元件的一个成员;以便通过剪接除去所述天然内含子,并产生上述天然蛋白质。
15.根据权利要求14的方法,其中所述细胞是选自由酵母、昆虫和哺乳动物细胞的真核细胞。
16.用于抑制含有突变的前—mRNA分子中的异常剪接的反义寡核苷酸,其中所述前—mRNA含有确定天然内含子的第一组剪接元件,在所述突变不存在时通过剪接除去天然内含子,产生编码天然蛋白质的第一种mRNA分子;其中所述前mRNA还含有由所述突变诱导的第二组剪接元件,这组剪接元件确定一个与所述天然内含子不同的异常内含子,当上述突变存在时通过剪接除去异常内含子,产生与所述第一种mRNA分子不同的第二种异常mRNA分子;所述反义寡核苷酸包括的寡核苷酸(i)与所述前—mRNA杂交,形成双链体分子;(ii)不激活RNA酶H;(iii)阻断所述第二组异常剪接元件的一个成员。
17.根据权利要求16的反义寡核苷酸,其中上述寡核苷酸长度为8到50个核苷酸。
18.根据权利要求16的反义寡核苷酸,其中所述寡核苷酸含有修饰的核苷酸间桥连磷酸酯残基,这些磷酸酯残基选自膦酸甲酯,硫代膦酸甲酯,吗啉—1—基磷酸酯,哌嗪—1—基磷酸酯和氨基磷酸酯。
19.根据权利要求16的反义寡核苷酸,其中所述反义寡核苷酸含有在其2’位置具有低级烷基取代基的核苷酸。
20.根据权利要求16的反义寡核苷酸,其在生理上可接受的水溶性载体溶液中。
21.根据权利要求16的反义寡核苷酸,其在脂泡囊中。
全文摘要
公开了含有突变的前-mRNA分子中阻止异常剪接的方法。当前-mRNA中存在突变时,突变引起前-mRNA不正确剪接并且产生异常mRNA或mRNA片段,这些异常mRNA或mRNA片段与由前-mRNA通常编码的mRNA不同。本方法包括反义寡核苷酸与前-mRNA在允许剪接条件下杂交,产生双链体分子。反义寡核苷酸不激活RNA酶H,并且选择阻断由突变造成的异常剪接元件组的成员,从而通过剪接除去天然内含子,产生编码天然蛋白质的第一种mRNA分子。还公开了本方法所用的寡核苷酸。
文档编号C12P21/02GK1123038SQ94192083
公开日1996年5月22日 申请日期1994年5月10日 优先权日1993年5月11日
发明者R·科尔, Z·多明斯基 申请人:北卡罗来纳大学查珀尔希尔分校
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