专利名称：提高重组牛凝乳酶原的表达与复性的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程，用大肠杆菌表达牛凝乳酶原基因，产物经溶解、复性、活化生产重组凝乳酶，属于酶的技术领域。
牛凝乳酶是生产干酪不可缺少的制剂，具有重要的商业价值，其产值占整个酶制剂总产值的15％。现有技术主要是从未断奶的小牛胃中提取，全世界每年需宰杀5000万头小牛仍供不应求。六十年代日本科学家曾提出用微生物来源的酸性蛋白酶取代，终因制得的干酪风味欠佳而仅作辅助用途。
八十年代基因工程兴起，十多个国家有关实验室相继开展牛凝乳酶原基因工程的研究。九十年代美国食品药品管理局(FDA)和丹麦、荷兰政府分别批准Pfizer，Ch.Hansen，Gist-Brocades等公司用大肠杆菌、黑曲霉、克氏酵母(Kluyveromycers lactis)生产重组凝乳酶。这是首次用基因工程方法生产食品添加制剂，它将逐步取代传统的提取牛凝乳酶的方法。利用黑曲霉或克氏酵母生产重组凝乳酶有两个缺点一是生长周期比用大肠杆菌长。据Genencor公司报道，摇瓶培养黑曲霉需7-10天时间[见文献①Bio/Technology，9，976-981(1991)]。Gist-Brocades公司培养克氏酵母也需要64小时[见文献②Bio/Technology，8，135-139(1990))]，而培养大肠杆菌只需要6-7小时；二是表达产物分泌在成份复杂体积又大的培养液中，其后提取工艺将发生困难。利用大肠杆菌生产牛凝乳酶的现有技术虽然有许多优点，但其主要障碍是表达产物以包含体形式存在，必须经过溶解、再折迭才能得到有活性的产物。按现有的复性方法，复性率仅在20％左右[参见文献③European Patent Application，pub.NO.0137710 A2，1984.8.31.，④Protein Engineering，2，563-569(1989)，⑤Protein Expression and Purification，4，59-63(1993)]，而大部分产物因不能正确折迭而损失。牛凝乳酶原基因在大肠杆菌中表达水平一般为20-30％[参见文献⑥EMBO Journal，4，775-780(1985)，⑦Scad.J.Clin.Lab.Investigation，52，Supplement210，51-58(1992)]，尚需进一步提高。
本发明的目的就是要克服上述问题，其任务在于充分利用大肠杆菌表达系统的优点，通过系统研究重组凝乳酶原表达与再折迭的规律，构建高效表达质粒，制定高复性率的后加工工艺以提高产率。
本发明的内容与方案表达如下1、提高外源基因在大肠杆菌中的表达可在转录和翻译两个层次上进行。已有技术多强调SD序列和起始密码子之间的距离决定翻译的效率，本发明的技术方案则表明，在适当的距离内起决定性作用的并不是简单的碱基数，而是mRNA的核糖体结合部位形成二级结构的趋势。不容易形成二级结构的序列，这有利于提高表达水平。在此基础上构建了两种高效表达质粒(1)pBC4启动子…A A G C A T T G G T T A A A A AT T A A G G A G G A A T T A A A A A A T G—牛凝乳酶原基因(2)pBC6启动子…A A G C A T T A A C T T T A A AA A T T A A G G A G G A A T T A A A A A A T G—牛凝乳酶原基因上述新的技术方案同样适用其他蛋白质表达质粒的构建。其关键是要根据该蛋白质的5′端密码子及其上游序列的结构特征，确定适当长度的核糖体结合部位，这样才能比较准确地预测其二级结构，实现高效表达质粒的构建。
2、提高重组凝乳酶原复性率的关键是要创造条件有利于天然二硫键的配对，其具体内容(1)在碱性、含有尿素的条件下溶解包含体，这样不仅可以破坏其中交联的二硫键从而使包含体完全溶解，而且可以使溶解的凝乳酶原分子处于更加伸展、还原性更强的状态，也就是处于更容易正确折迭的状态；(2)在含GSH和GSSG系统及低温条件下再折迭。上述在碱性条件下溶解，不经过还原，直接在含GSH与GSSG低温条件下复性的工艺路线也适用于其他含二硫键的蛋白。
本发明与已有技术相比具有如下优点和积极效果1、用黑曲霉表达牛凝乳酶原在摇瓶中培养需7-10天，用克氏酵母需64小时，而本发明用大肠杆菌仅需6-7小时，生长周期缩短了8-33倍。
2、用大肠杆菌生产重组凝乳酶原的已有技术，一般表达水平为20-30％，本发明则有明显提高，达到30-40％。
3、从包含体中回收凝乳酶原的已有技术，一般其复性率为20％左右，本发明则达50％左右，提高一倍以上。
综合上述优点和效果，采用本技术方案生产重组凝乳酶可大大降低成本。
根据上述新的技术方案，提供以下两个较佳的实施例实施例1重组牛凝乳酶原的高效表达将高效表达质粒pBC4或pBC6转化大肠杆菌。质粒pBC4与pBC6均含有(1)PRPL启动子，(2)经过优化的RBS(核糖体结合部位)序列，(3)牛凝乳酶原基因。将上述经过转化的大肠杆菌接种于含LB培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母粉，0.5％NaCl，50—75μg/ml氨苄青霉素，pH7.5)或2YT培养基(1.6％蛋白胨，1％酵母粉，0.5％NaCl，50-75μg/ml氨苄青霉素，pH7.0)的摇瓶中，30℃培养，达到对数生长期时，将温度升至42℃，再经过2-4小时，8000×g离心10分钟收集菌体。经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，菌体中凝乳酶原含量占细胞总蛋白的30-40％。
实施例2重组凝乳酶原的高效复性1、培养将带有pBC4的大肠杆菌培养于2.5升发酵缶中，培养基成份为1.6％蛋白胨，1％酵母粉，0.5％NaCl，50μg/ml氨苄青霉素，pH7.0。起始生长温度为30℃，诱导温度为42℃，培养时间共为6-7小时，8000×g离心10分钟，收获菌体。
2、包含体的回收与溶解将菌体悬浮于20倍体积的STET缓冲液(8％蔗糖，50mmol/L Tris，pH8.0，20mmol/L EDTA，5％Triton X—100)，超声波破碎细胞，10.000×g离心10分钟，沉淀中主要成份为含凝乳酶原的包含体。将此包含体悬浮于20倍体积的蒸馏水中，10.000×g离心10分钟，收集沉淀并溶于含8mol/L尿素的缓冲液A(50mmol/L KH2PO6，1mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl用NaOH调pH至11)中，室温放置2小时，10.000×g离心10分钟，保留上清液。
3、复性将上述上清液用含CSH与GSSG的缓冲液A稀释10倍，低温中放置，然后用HCl调pH至8低温放置1小时，对缓冲液(20mmol/L Tris pH8.0，50mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA)透析，4℃过夜，即得到复性后的凝乳酶原溶液。
4、活化将凝乳酶原溶液用HCl调至pH2，室温放置2小时后，用NaOH调pH至6.3，放置1小时，测定凝乳活性。
5、凝乳活性的测定将100μl20％脱脂奶粉-20mmol/LCaCl2注入微孔板中，再加入100μl不同稀释度的经过活化处理的酶液，37℃中保温20分钟，观察凝乳效果，与纯牛凝乳酶活性进行比较。在上述条件下引起凝乳的最低纯凝乳酶量为20ng，以此计算活化后溶液中的凝乳酶量。复性率按下述公式计算 按上述工艺流程1升醪液得到2.29g包含体蛋白，其中凝乳酶原为1.45g，有活性的凝乳酶为0.78g，复性率为54％。
权利要求
1.一种以大肠杆菌为表达体系表达牛凝乳酶原基因，经过包含体的溶解、复性、活化一系列后加工工艺生产重组凝乳酶的方法，其特征包括(1)将编码牛凝乳酶原的基因重组到含有经过优化的核糖体结合部位的高效表达质粒中，转化大肠杆菌，进行诱导表达；(2)凝乳酶原的表达产物以包含体形式存在，用凝乳酶原高效复性的工艺进行溶解，再折选，再经过活化得到有凝乳活性的产物；(3)设计优化核糖体结合部位序列的方法也适用于其他蛋白质。
2.根据权利要求1所述的重组凝乳酶的生产方法，其特征在于其中(1)的高效表达质粒是指核糖体结合部位的序列经过优化，不易形成二级结构，这类高效表达质粒共有两种(1)pBC 4启动子…A A G C A T TG G T T A A A A AT T A A G G A G G A A T T A A A A A A T G—牛凝乳酶原基因；(2)pBC6启动子…A A G C A T T A A C T T T A A AA A T T A A G G A G G A A T T A A A A A A T G—牛凝乳酶原基因。
3.根据权利要求1所述的重组凝乳酶的生产方法，其特征在于其中(2)的凝乳酶原高效复性工艺中的“溶解”是指包含体溶于pH11含8mol/L尿素的溶液中。
4.根据权利要求1所述的重组凝乳酶的生产方法，其特征在于其中(2)的凝乳酶原高效变性工艺中的“再折迭”是指在pH11含GSH与GSSG体系、低温下进行。
5.根据权利要求1，3，4所述的重组凝乳酶的生产方法，其特征在于在碱性条件下溶解后不经过还原，直接在含GSH与GSSG体系、低温条件下复性的工艺路线，同样适用于含其他二硫键蛋白质的复性。
6.根据权利要求1所述的重组凝乳酶的生产方法，其特征在于其中(3)设计优化核糖体结合部位序列的方法用于其他蛋白质时要根据该蛋白质的5′端密码子及其上游序列的结构特征确定适当长度的核糖体结合部位，这样才能准确地预测其二级结构，实现高效表达质粒的构建。
全文摘要
牛凝乳酶原的高效表达与复性方法属于微生物和酶的技术领域。为提高重组凝乳酶生产中基因表达水平及复性率，本发明采用高效表达质粒可使牛凝乳酶原在大肠杆菌中表达量占细胞总蛋白的30-40％，采用优化的溶解包含体及再折叠的工艺可使复性率达到50％左右。
文档编号C12N15/59GK1116239SQ9510533
公开日1996年2月7日 申请日期1995年5月25日 优先权日1995年5月25日
发明者杨开宇, 刘年娟, 张渝英 申请人:中国科学院微生物所