专利名称：制备手性α叔羧酸酯的酶促方法
背景技术：
目前市售的许多农业化学品和药品是外消旋或非对映体混合物，许多情况下，只有一种对映体/非对映体具有需要的生理作用，而另一种对映体/非对映体无活性甚至有害或有抑制作用。分离对映体的化学或酶技术正成为生产高对映体纯度化学品的越来越重要地工具。
U.S.4,898,822中描述，用具有立体选择性酯酶活性的酶或微生物水解相应外消旋酯，制备有光学活性的二氢吲哚-2-羧酸。该专利公开的底物是具有如下通式的化合物
其中手性中心用星号标出，是α仲碳原子。
U.S.5,202,260和Yee等人，有机化学杂志(J.Org.Chem.)(1992)573525-3527公开了用得自解脂假丝酵母的酶部分水解α叔羧酸酯制备有光学活性的酸及其相应的酯。所用的酶完全来自一种酵母，只是将外消旋混合物的S-酯转化成相应S-酸而不转化R-酯。
Feichter等人在J.Chem.Soc.Perkin Trans(1991)1653-654中，公开了通过特别是α-糜蛋白酶的作用，立体专一性水解外消旋苯基乳酸甲酯，形成相应的R-酸和S-酯。
Peters等人在应用微生物学生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)(1992)38334-340中描述了立体专一性还原酮酸或酮酯生产其相应的手性羟基酸或酯。特别地，这些作者显示近平滑假丝酵母和嗜红红球菌(Rhodococcus erythropolis)有立体专一性酮酯还原酶活性，可将外消旋无环的β-酮酸酯立体专一性地转化成其相应的手性羟基酸酯。
发明概述
本发明提供一种用含有完整细胞或部分或高度纯化的酶制剂的生物催化剂接触α叔羧酸酯对映体混合物，从中富集相应酸或酯对映体的方法。对映体酯化合物可用作制备药物和农业活性化合物的中间体。例如WO92/11249公开了以5-氯-2，3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯用于制备某些杀节肢动物的苯胺基甲酰。
本发明特别提供一种制备对映体富集的羧酸酯的方法，该方法包括将具有式I的酯对映体化合物与一种生物催化剂接触，
其中R1和R2独立地选自苯基和C1-C6烷基，它们任选地被卤素、C1-C3
烷氧基和苯氧基中最多3个取代；条件是R1与R2不同；或
R1，R2和它们所连的碳一起形成如下基团
其中
X选自C＝O，O，S和NH；
R3选自OH和NH2；
R4是C1-C6烷基；和
R5选自卤素和C1-C3氟烷氧基，
其中手性碳由星号标出；
所述生物催化剂选自IM60酯酶(Lipozyme)；手性酶(chirazyme)L-2脂酶；手性酶L-5脂酶；手性酶L-7脂酶；SP524脂酶；SP526脂酶；SP539蛋白酶；酯酶脂酶(Lipolase Lipase)；CR脂酶；霍克氏棒状杆菌ATCC7005；黄杆菌属ATCC27551；食油假单胞菌NRRL-B-3429；恶臭假单胞菌ATCC23973；假单胞菌属NRRL-B-11330；马红球菌(Rhodococcus equi)ATCC14887；嗜红红球菌ATCC4277；嗜粪红球菌NRRL-B-16536；rhodnii红球菌NRRL-B-16535；玫瑰色红球菌ATCC55602；红球菌属NRRL-B-16531；红球菌属NRRL-B-16534；灰色链霉菌ATCC6855；田野黄单胞菌ATCC21818；季也蒙氏假丝酵母ATCC6260；乳酒假丝酵母ATCC4135；热带假丝酵母ATCC46491；深红酵母ATCC4557；Yarowia lipolytica ATCC9773；洋葱曲霉ATCC10060；蚕白僵菌ATCC26037；蚕白僵菌ATCC74292；蚕白僵菌ATCC26851；蚕白僵菌ATCC38657；niyea白僵菌ATCC74294；刺孢小克银汉霉ATCC8688；Lophotrichus martinii ATCC11221；马昆德氏拟青霉ATCC10525；小孢盘多毛孢ATCC11816；米根霉ATCC10404；米根霉ATCC22580；掷孢酵母属ATCC20290；同心发癣菌ATCC74293；蜡状芽孢杆菌NRRL-B-14591；诺卡氏菌属NRRL-B-5646；恶臭假单胞菌ATCC17453；酿酒酵母NRRL-Y-2034；八孢裂殖糖酵母NRRL-Y-854；洋葱曲霉NRRL-315；产黄青霉ATCC10002；点青霉ATCC36740；Amycolatopsis rugosa NRRL-B-2295；马红球菌ATCC13556；内涂链霉菌NRRL-B-2339；白色曲霉ATCC20022；和微孢藻真菌ATCC89821。
申请人发现某些本发明优选生物催化剂可用于富集两种特别优选的酯对映体混合物的(+)或(-)对映体α-羟基-α-甲基-4-苯氧基苯乙酸乙酯
和5-氯-2，3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯
本发明对映体专一性生物转化的假想机理包括对映体特异性水解α叔酯混合物的一种对映体，产生相应羧酸，在酮酸酯对映体混合物情况下，对映体专一性还原酮基，形成相应的α叔羟基酸酯。
发明详述
本发明涉及一种从含有α-叔羧酸酯的对映体混合物的起始底物中对映体富集α叔羧酸酯的制备方法。
起始化合物是具有α叔碳的如式I所示的酯对映体的混合物，
其中
R1和R2独立地选自苯基和C1-C6烷基，它们任选地被卤素、C1-C3烷氧基和苯氧基中最多3个取代；条件是R1与R2不同；或
R1，R2与它们所连的碳一起形成如下基团
其中
X是C＝O，O，S和NH；
R3选自OH和NH2；
R4是C1-C6烷基；和
R5选自卤素和C1-C3氟烷氧基，
其中手性碳由星号标出。
优选底物是式I的化合物，其中
R1是任选地被苯氧基取代的苯基；
R2是C1-C3烷基；或
R1，R2和它们所连的碳一起形成基团
其中
X是C(=O)
R3是OH；
R4是C1-C3烷基；和
R5是卤素。
特别优选的底物是
α-羟基-α-甲基-4-苯氧基苯乙酸乙酯；和
5-氯-2，3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯。
本发明底物可由本领域专业人员熟知的技术方便地制备。例如α-羟基-α-甲基-4-苯氧基苯乙酸乙酯可如下制备一个250ml烧瓶配置(fit with)磁力搅拌器、水冷凝器、125ml滴液漏斗、温度计和氮气进气口，加2.7(110mmol)金属镁，加强力氮气清洗(strong nitrogenpurge)下用热枪干燥。冷却后向漏斗中加17.5ml(24.9g，100mmol)4-溴二苯醚与67ml无水THF，10ml流入烧瓶。搅拌后立即发生Grignard(格林那)反应，余下的溴溶液15分钟内加完，保持内部温度67-68℃，加液完毕，温度保持68℃ 5分钟，再开始降温，45分钟后到30℃。同时将烘干的250ml烧瓶，磁力搅拌子和125ml滴液漏斗在氮气下趁热组装然后冷却。然后加入低温温度计，烧瓶加11.5ml(12.2g，105mmol)丙酮酸乙酯溶液的66ml无水THF，将格林那试剂溶液用注射器转移到滴液漏斗中。丙酮酸酯溶液冷冻至-10℃，边充分搅拌边在15分钟内加入格林那试剂溶液，冷却保持内部温度-5至-10℃。将得到的溶液搅拌，加50ml水再加50ml饱和氯化铵水溶液，得到澄清的两相。分离两相，将上层相循环蒸发除去大部分THF。加入50ml水和二氯甲烷，得澄清两相。分离两相，水相用另外25ml二氯甲烷洗，复合的有机相用水和盐水洗，用硫酸镁干燥，蒸发剩下23.8g橙黄色油。140℃/0.1-0.2mM Kugelrohr蒸馏60分钟除去挥发性杂质，剩下17.1g(60％)澄清的橙色油产物。
类似地，5-氯-2，3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯可按下述方法制备氢化钠(24g 60％油溶液，0.6mol)用己烷洗去油，得到的NaH悬浮于200ml DMF，用50g(0.3ml)5-氯-1-二氢茚酮和150ml NMF的溶液处理，保持反应温度低于35℃。得到的混合物搅拌30分钟，再用38ml(0.45mol)二甲基碳酸酯处理15分钟，得到的混合物室温下搅拌1.5小时，静置过夜。将反应混合物小心地倒入100ml浓缩HCl和约1000ml冰的混合物中。然后加入500ml醚，用醚两次萃取水相。复合有机层用3份水冲洗，干燥(MgSO4)浓缩，得64.6g褐色油。5.0g(0.022mol)上述产物和70mL二氯甲烷的溶液在室温下用10g(约0.032mol)的50-60％间氯过苯甲酸(Aldrich)处理。1小时后，反应冷却至0℃，小心加入饱和碳酸钠水溶液骤冷。该层用饱和碳酸钠水溶液洗两次，用饱和亚硫酸氢钠洗一次，干燥(MgSO4)浓缩，得到4.0g黄色固体。
在本发明的一个实施方案中，所公开的酶和生物材料的生物催化作用将不需要的对映体转化成产物并方便地与未受影响的对映体分离。在本发明公开中，通过对1)回收度2)所需产物的对映体纯度定量化，来测定本制备方法的效率。回收度是生物催化处理后剩下的起始底物百分比。所需产物的对映体纯度通过计算生物催化处理后回收的底物中所需对映体比不需要的对映体多的量来确定，用下列方程之一从每种对映体浓度计算该对映体过量(％e.e.)
(+)形式的％e.e.＝([(+)]－[(-)])/([(+)]＋[(-)])×100
(-)形式的％e.e.＝([(-)]－[(+)])/([(-)]＋[(+)])×100
其中[(+)]和[(-)]分别是(+)和(-)形式的浓度。尽管并非本方法必不可少的方面，若需要还是可以用本领域已知的几种方法从生物催化反应混合物中分离对映体富集的酯产物(定义为≥50％e.e.)。
对于本发明目的，所公开的方法中作为底物的对映体混合物是％e.e.小于50的对映体酯的混合物，这当然包括两种对映体等量存在的消旋混合物，以及其中一种对映体比其互补的对映体多，但对映体过量小于50％的光学活性混合物。每种情况下本发明方法的结果均是制备了对映体富集的羧酸酯，其中得到的所需对映体的％e.e.至少为50。
对于本发明公开，申请人所用术语的含义如下
术语“对映体富集的”指得到的所需对映体的％e.e.至少为50。
术语“生物催化剂”包括完整细菌，酵母或真菌细胞或细胞提取物或产物的酶活性，或来自细菌，酵母，真菌或哺乳动物细胞的纯化或部分纯化形式的酶活性，它酶促催化本发明的反应过程。
优选的生物催化剂得到的对映体过量大于50％(表示所需对映体是另一对映体的3倍过量)。更优选的是富集大于约90％，更为优选的是富集大于约95％，最优选的是富集大于约99％。
实验过程中，发明人评价了多于四百种潜在的生物催化剂源，令人吃惊的是，此处公开的生物催化剂源具有发明人需要的活性。因此本发明的特征在于能进行对映体专一性反应的生物催化剂(微生物或其突变株，或酶)。优选的生物催化剂选自下列微生物霍克氏棒状杆菌ATCC7005；黄杆菌属ATCC27551；食油假单胞菌NRRL-B-3429；恶臭假单胞菌ATCC23973；假单胞菌属NRRL-B-11330；马红球菌ATCC14887；嗜红红球菌ATCC4277；嗜粪红球菌NRRL-B-16536；rhodnii红球菌NRRL-B-16535；玫瑰色红球菌ATCC55602；红球菌属NRRL-B-16531；红球菌属NRRL-B-16534；灰色链霉菌ATCC6855；田野黄单胞菌ATCC21818；季也蒙氏假丝酵母ATCC6260；乳酒假丝酵母ATCC4135；热带假丝酵母ATCC46491；深红酵母ATCC4557；Yarowialipolytica ATCC9773；洋葱曲霉ATCC10060；蚕白僵菌ATCC26037；蚕白僵菌ATCC74292；蚕白僵菌ATCC26851；蚕白僵菌ATCC38657；nivea白僵菌ATCC74294；刺孢小克银汉霉ATCC8688；Lophotrichus martiniiATCC11221；马昆德氏拟青霉ATCC10525；小孢盘多毛孢ATCC11816；米根霉ATCC10404；米根霉ATCC22580；掷孢酵母属ATCC20290；同心发癣菌ATCC74293；蜡状芽孢杆菌NRRL-B-14591；诺卡氏菌属NRRL-B-5646；恶臭假单胞菌ATCC17453；酿酒酵母NRRL-Y-2034；八孢裂殖糖酵母NRRL-Y-854；洋葱曲霉NRRL-315；产黄青霉ATCC10002；点青霉ATCC36740；Amycolatopsis rugosa NRRL-B-2295；马红球菌ATCC13556；内涂链霉菌NRRL-B-2339；白色曲霉ATCC20022；和微孢藻真菌ATCC89821。生物材料包括能完成本发明方法的对映体专一性酶，它们可以被分离出来或生物合成并被使用，但通常直接应用合适的微生物更为便捷。
下列来源的水解酶纯化制剂也是优选的α-糜蛋白酶(牛胰制；Sigma化学品公司)；β-糜蛋白酶(牛胰制；Sigma化学品公司)；γ-糜蛋白酶(牛胰制；Sigma化学品公司)；δ-糜蛋白酶(牛胰制；Sigma化学品公司)；IM60酯酶(诺和诺德公司)；手性酶L-2脂酶(宝灵曼公司)；手性酶L-5脂酶〔宝灵曼公司)；手性酶L-7脂酶(宝灵曼公司)；SP524脂酶(诺和诺德公司)；SP526脂酶(诺和诺德公司)；SP539蛋白酶(诺和诺德公司)；酯酶脂酶(诺和诺德公司)；和CR脂酶(Altus Biologics公司)。
最优选的生物催化剂来自下列微生物玫瑰色红球菌ATCC55602；同心发癣菌ATCC74293；蚕白僵菌ATCC74292；和nivea白僵菌ATCC74294。
在这个从α叔羧酸酯对映体混合物中富集(+)或(-)对映体的方法中，可方便地用适于生产对映体专一性酶的培养基中培养微生物，得到一种或多种对映体专一性酶，其作用即实现生物催化。选择性地加入这样得到的微生物，使其作用于(+)或(-)α叔羧酸酯，从而富集余下的(+)或(-)羧酸酯。用本领域专业人员已知的从酸中分离羧酸酯，从羟基酸酯中分离酮酸酯和分离每种对映体的方法，把所需产物(富集的羧酸酯)从不需要的产物((+)或(-)羧酸酯，或(+)或(-)羟基酸酯)中分离出来。显而易见地，发明人认识到本发明的方法也可同样好地被描述为通过选择性地生物催化α叔羧酸酯对映体混合物，对映体专一性富集(+)或(-)α叔羧酸酯或(+)或(-)羟基酸酯的过程。
本发明的生物催化剂包括来自或位于细菌酵母，真菌和哺乳动物细胞的生物材料。几种生物催化剂已按照布达佩斯协议要求保藏到ATCC(美国典型培养物保藏中心，12301，Parklawn Drive，洛克维尔，马里兰州20852)，保藏号如下
生物催化剂 保藏号
玫瑰色红球菌 ATCC55602
同心发癣菌ATCC74293
蚕白僵菌 ATCC74292
nivea白僵菌 ATCC74294
本文用到下列缩写
MCIC5-氯-2，3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯
EHPAα-羟基-α-甲基-4-苯氧基苯乙酸乙酯
HPLC高效液相色谱
DMF二甲基甲酰胺
ACN乙腈
e.e.对映体过量
SMSabouraud麦芽糖肉汤
SBG大豆甘油
NB营养肉汤
PD马铃薯右旋糖肉汤
为确定生物催化活性，用标准微生物学技术将一小份冰冻或冻干的受试生物体原种接种到25ml适当的生长培养基中。本发明公开的生物体生长培养基选自
SM(Sabouraud麦芽糖肉汤；BBL公司，Cockeysville，MD)
PD(马铃薯右旋糖肉汤；Difco实验室公司，底特律，密歇根州)
NB(营养肉汤；Difco实验室公司，底特律，密歇根州)
SBG(大豆甘油)(pH7.0) 克/升
甘油 20.0
酵母提取物 5.0
大豆粉 5.0
氯化钠 5.0
磷酸钾(二碱价) 5.0
每种公开的微生物的生长培养基由表1-6给出。种子培养物在28-30℃生长72小时，连续振荡(250rpm；I期生长)。该起始培养物的10-20％被转移入新鲜培养基(25ml)，继续温育24小时(II期生长)。收获细胞再悬浮于合适的缓冲液(pH4.5-8.5)中，生物催化剂终浓度为约10-250mg催化剂(干重)每mL缓冲液，底物终浓度为约2-200mM。继续温育25-50℃4-72小时连续振荡(250rpm)实现生物转化。反应物然后被酸化，用二氯甲烷提取。CH2Cl2挥发后，残余物再悬浮于ACN中。用反相HPLC确定ACN溶液中底物回收百分比，用手性HPLC确定对映体纯度。
分析方法
用反相HPLC测量α叔羧酸酯和水解产物。用紫外吸收检测。对MCIC用ZorbaxRX-C8柱(4.6×250mM)，流动相为40％乙腈和60％H2O+0.1％三乙胺(pH调至6.5)。对EHPA用ZorbaxC18柱(4.6×250mM)流动相为50％乙腈和50％用0.1％H3PO4酸化的水。通过与真正(authentic)标准比较来进行酯的色谱确定和定量。
用于分离对映体的手性HPLC用得自Chromatech(瑞典)的α酸性糖蛋白柱进行。分离酯对映体用的流动相总结如下
对映体 流动相
MCIC 98％0.01M磷酸缓冲液(pH4.8)2％乙醇
EHPA 91％H2O＋0.1％三乙胺(pH6.0)9％乙腈
分离对映体的手性HPLC用得自Chromatech(瑞典)的α-酸性糖蛋白柱进行。分离酯对映体用的流动相总结如下。
时映体流动相
MCIC 98％0.01μ磷酸缓冲液(pH4.8)2％乙醇
EHPA 91％H2O＋0.1％三乙基胺(pH6.0)9％乙腈
实施例10中分离EHPA对映体用的手性HPLC用得自J.T.Baker的Bakerbond手性OD柱进行。用来分离EHPA对映体的流动相是90％己烷10％丙醇。
通过与对映体或消旋混合物的真实标准相比较进确定上述酯的对映体组成，浓度和色谱鉴定。
实施例1
对于表1列出的微生物株，离心收集II期生长的细胞，再悬浮于5m150mM磷酸盐缓冲液pH6.0(50-100mg湿重细胞/mL缓冲液)。然后加入溶于50μL DMF的10μmol消旋MCIC。30℃温育24小时后终止反应(2mM生物转化)或再加10μmol溶于50μl DMF的消旋MCIC继续温育24小时(4mM生物转化)用3M H2SO4酸化至pH3终止2mM和4mM MCIC生物转化。每个样品加2体积的二氯甲烷，搅动悬浮液15分钟。移去二氯甲烷层，在氮气流下蒸发干，残渣再悬浮于10ml乙腈中。分别用反相HPLC和手性HPLC确定MCIC回收百分比和(+)-MCICe.e，结果由表1给出。
实施例2
10mg每种糜蛋白酶样品(表1)加入2mL 50mM磷酸盐缓冲液pH6.0，然后加入4μmol溶于20μL DMF的消旋MCIC。相似地；把20mg手性酶L-7脂酶样品加入50mM磷酸盐缓冲液pH6.0，再加入40μmol溶于20μL DMF的消旋MCIC。30℃(糜蛋白酶)或25℃(L-7)温育24小时后，按实施例1的萃取和分析过程，确定MCIC回收百分比和(+)-MCIC e.e.结果由表1给出。表1(+)-甲基5-氯-2，3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚并-2-羧酸的对映体富集
底物
株菌 生长温育时间 加入
培养基(小时)mM数 回收％ ％e.e.霍克氏棒状杆菌ATCC7005 SM4845350黄杆菌属ATCC27551 SM4844752食油假单细菌NRRL-B-3429SBG 24219100恶臭假单细菌ATCC23973 NB2424960假单细胞菌属NRL-B-11330SBG 4841464马红球菌ATCC14887 NB4842980嗜红红球菌ATCC4277 SBG 4842182嗜粪红球菌NRRL-B-16535 SBG 48433100rhodnii红球菌NRRL-B-16535 SBG 48415100玫瑰色红球菌ATCC55602 SBG 4843598红球菌属NRRL-B-16534 SBG 4841466灰色链霉菌ATCC6855 SBG 4843366田野黄单胞菌ATCC21818 SBG 48436100深红酵母ATCC4557 SBG 4843786蚕白僵菌ATCC74292 PD4844192蚕白僵菌ATCC26851 PD48431100刺孢小克银汉霉ATCC8688 PD2423650马昆德氏拟青霉ATCC10525SM4845260小孢盘多毛孢ATCC11816 PD4842050米根霉ATCC10404PD48449100米根霉ATCC22580PD48448100同心发癣菌ATCC74293PD4842092α-糜蛋白酶(Sigma) NAa 24246100β-糜蛋白酶(Sigma) NA24245100γ-糜蛋白酶(Sigma) NA24260100δ-糜蛋白酶(Sigma) NA2430 6072手性酶L-7脂酶(宝灵曼公司) NA2420 3480aNA-不可应用
实施例3
对于表2列出的微生物株，离心收集II期生长的细胞，再悬浮于5ml50mM磷酸盐缓冲液pH6.0(50-100mg湿重细胞/μL缓冲液)。与实施例1相同方式加入10μmol消旋MCIC。相同地温育(4mM生物转化)后，如实施例1用萃取和分析方法确定MCIC回收百分比和(-)-MCICe.e.。结果由表2给出。
实施例4
5mg手性L-2脂酶，10mg SP524脂酶，SP526脂酶，SP539蛋白酶或20mg手性酶L-5脂酶(表2)加入2ml 50mM磷酸缓冲液pH6.0。然后加入40μmol溶于20μL DMF的消旋MCIC(对SP526为20μmol)。25℃温育24小时后，按与实施例1相同的萃取与分析方法确定MCIC回收百分比与(-)-MCIC e.e。结果由表2给出。
表2(-)-5-氯-2，3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的对映体富集
底物
株菌 生长 温育时间 加入
培养基 (小时)mM数 回收％％ e.e.季也蒙式假丝酵母ATCC6260 SM 484 33 100乳酒假丝酵母ATCC4135 SM 481 NDa50热带假丝酵母ATCC46491 SM 484 29 76yarrowia lipolyticaATCC9773SM 484 32 50洋葱曲霉ATCC10060 SM 481 ND 100nivea白僵菌ATCC74290 PD 484 38 86Lophotrichus martiniiATCC11221 PD 484 36 100掷孢酵母属ATCC20290PD 484 45 100SP524脂酶(诺和诺德公司)NAb 2420 16 66SP526脂酶(诺和诺德公司)NA 2410 22 85SP539蛋白酶(诺和诺德公司) NA 2420 40 68手性酶L-2脂酶(宝灵曼公司) NA 2420 13 100手性酶L-5脂酶(宝灵曼公司) NA 2420 14 80aND-未确定bNA-不能应用
实施例5
对表3列出的微生物株，每一24小时II期培养物中加入溶于10μlDMF的42μmol消旋MCIC。(25ml SBG培养基)。加入MCIC后，27℃温育8小时或29小时后从肉汤中移出4ml。每个样品加1ml乙酸乙酯，将悬浮液振荡10秒。从每个样品移出0.2ml乙酸乙酯层，氮气流下蒸发干，残余物再悬浮于3ml乙腈中，用反相HPLC和手性HPLC分别测定MCIC回收百分比和(-)-MCIC e.e.。结果由表3给出。
表3(-)-5-氯-2，3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯
底物
株菌生 长温育时间 加 入
培养基 (小时)mM数 回收％ ％e.e蜡状芽孢杆菌NRRL-B-14591 SBG 29 1.727 48诺卡菌属NRRL-B-5646 SBG 29 1.712 60恶臭假单胞菌ATCC17453SBG 29 1.719 46酿酒酵母NRRL-Y-2034 SBG 29 1.735 78八孢裂殖糖酵母NRRL-Y-854 SBG 8 1.730 98洋葱曲霉NRRL-315 SBG 29 1.712 64产黄青霉ATCC10002SBG 8 1.738 50点青霉ATCC36740 SBG 29 1.719 46
实施例6
对表4中检测的微生物株，离心收集II期生长的细胞，再悬浮于5ml 50mM磷酸缓冲液pH6.0(50-100mg湿重细胞/mL缓冲液)。然后加入溶于50μL DMF的10μmol消旋EHPA。30℃温育24小时后终止反应(2mM生物转化)或再加10μmol溶于50μL DMF的消旋EHPA继续温育24小时(4mM生物转化)。用3M H2SO4酸化至pH3终止2mM和4mM EHPA生物转化。每个样品加2倍体积的二氯甲烷，搅动悬浮液15分钟，移去二氯甲烷层，在氮气流下蒸发干，残余物再悬浮于10mL乙腈中。分别用反相HPLC和手性HPLC确定EHPA回收百分比和(+)-EHPAe.e.。结果由表4给出。
实施例7
20mg IM60酯酶，SP524脂酶，SP526脂酶或1mL酯酶脂酶样品加入2ml 50mM磷酸缓冲液pH6.0(对酯酶为1mL)。然后加入20μmol溶于20μL DMF的EHPA。30℃温育48小时(IM60酯酶)或25℃温育24小时(SP 525，SP 526，酯酶)后，用3M H2SO4酸化至pH3终止反应。按实施例6的萃取和分析过程确定EHPA百分比和(+)-EHPAe.e.结果由表4给出。
表4(+)-α-羟基-α-甲基-4-苯氧基苯乙酸乙酯的
对映体富集
底物
菌株生 长 温育时间 加 入
培养基 (小时) mM数 回收％ ％e.e假单胞菌属NRRL-B-11330SBG 24 2 52 86马红球菌ATCC13556 SBG 24 2 40 88热带假丝酵母ATCC46491 SM24 2 87 42白色曲霉ATCC20022 SM24 2 48 24蚕白僵菌ATCC26851 PD24 2 43 90蚕白僵菌ATCC38657 PD24 2 28 100微孢藻真菌ATCC89821 PD48 4 44 40同心发癣菌ATCC74293 PD48 4 39 100IM60脂酶(诺和诺德)NAa 48 1047 84SP524脂酶(诺和诺德) NA24 1010 60SP526脂酶(诺和诺德) NA24 1036 51Lipolase Lipase(诺和诺德) NA24 1022 50aNA-不能应用
实施例8
对表5列出的两个微生物株，离心收集II期生长的细胞，再悬浮于5ml 50mM磷酸盐缓冲液pH6.0(50-100mg湿重细胞/mL缓冲液)。以与实施例5相同方式加入10μmol消旋EHPA。同样地温育(2mM生物转化)后，如实施例5的萃取和分析过程确定EHPA回收百分比和(-)-EHPA e.e.结果由表5给出
表5(-)-乙基α-羟基-α-甲基-4-苯氧基苯乙酸乙酯
对映体富集
底物
菌株生长 温育时间 加 入回收 ％
培养基 (小时) mM数 ％ e.e.Amycolatopsis rugosa NRRL-B-2295 SM 24 23850内涂链霉菌NRRL-B-2339SBG24 21282
实施例9
对表6列出的微生物株，离心收集II期生长的细胞-80℃冻存，化冻后再悬浮于2ml 50mM磷酸盐缓冲液pH6.0(150-300mg湿重细胞/ml缓冲液)。细胞悬液加入含有100μmol 50％e.e.(+)-MCIC的反应小试管中。30℃温育24小时后，用3M H2SO4酸化至pH3终止反应。每个样品加5倍体积的二氯甲烷，悬浮液振荡15分钟。移去各二氯甲烷层的一半，在氮气流下蒸发干，残物再悬浮于10mL乙腈。分别用反相HPLC和手性HPLC确定MCIC回收百分比与(+)-MCIC e.e.。结果由表6给出。
表6 50％e.e.(+)-5-氯-2，3-二氢-2-羟基-1-氯-1H-茚-2-羧酸甲酯的对映体富集
菌株 生 长 细胞浓度 温育时间 加 入回收 ％
培养基 (g/mL) (小时) mM数 ％ e.e红球菌属NRRL-B-16531 SBG 0.30 245067 82红球菌属NRRL-B-16534 SBG 0.30 245082 82玫瑰色红球菌ATCC55602SBG 0.30 245067 86同心发癣菌ATCC74293 PD 0.16 245077 76蚕白僵菌ATCC26037PD 0.29 245082 76无细胞 - - 2450100 50
实施例10
10mg CR酯酶(Altus生物公司，坎布里奇，麻省)加入2mL 50mM磷酸盐缓冲液pH6.0中。然后加入溶于20μmol DMF的10μmol消旋EHPA。30℃温育24小时后，用3M H2SO4酸化至pH3终止反应。每个样品加5倍体积的二氯甲烷，悬浮液振荡15分钟。移去各亚甲基氯层的一半，在氮气流下蒸发干，残渣再悬浮于10mL乙腈。分别用反相HPLC和手性HPLC确定EHPA回收百分比和(+)-EHPA。结果由表7给出。
表7(+)- α-羟基-α-甲基-4-苯氧基苯乙酸乙酯
对映体富集
底物
酶 温育时间 加入mM数 回收％％e.eCR脂酶(Altus Biologics)24 5 3890
权利要求
1.一种对映体富集的羧酸酯的制备方法，它包括将式I的酯的对映体混合物与一种生物催化剂接触，
其中
R1和R2独立地选自苯基和C1-C6烷基，它们任选地被卤素、C1-C3烷氧基和苯氧基中最多3个取代；条件是R1与R2不同；或
R1，R2和它们所连的碳原子一起形成如下基团
其中
X选自C＝O，O，S和NH；
R3选自OH和NH2；
R4是C1-C6烷基；和
R5选自卤素和C1-C3氟烷氧基，
其中手性碳由星号标出；
所述生物催化剂选自IM60酯酶；手性酶L-2脂酶；手性酶L-5脂酶；手性酶L-7脂酶；SP524脂酶；SP526脂酶；SP539蛋白酶；酯酶脂酶；CR脂酶；霍克氏棒状杆菌ATCC7005；黄杆菌属ATCC27551；食油假单胞菌NRRL-B-3429；恶臭假单胞菌ATCC23973；假单胞菌属NRRL-B-11330；马红球菌ATCC14887；嗜红红球菌ATCC4277；嗜粪红球菌NRRL-B-16536；rhodnii红球菌NRRL-B-16535；玫瑰色红球菌ATCC55602；红球菌属NRRL-B-16531；红球菌属NRRL-B-16534；灰色链霉菌ATCC6855；田野黄单胞菌ATCC21818；季也蒙氏假丝酵母ATCC6260；乳酒假丝酵母ATCC4135；热带假丝酵母ATCC46491；深红酵母ATCC4557；Yarowia lipolytica ATCC9773；洋葱曲霉ATCC10060；蚕白僵菌ATCC26037；蚕白僵菌ATCC74292；蚕白僵菌ATCC26851；蚕白僵菌ATCC38657；nivea白僵菌ATCC74294；刺孢小克银汉霉ATCC8688；Lophotrichus martinii ATCC11221；马昆德氏拟青霉ATCC10525；小孢盘多毛孢ATCC11816；米根霉ATCC10404；米根霉ATCC22580；掷孢酵母属ATCC20290；同心发癣菌ATCC74293；蜡状芽孢杆菌NRRL-B-14591；诺卡氏菌属NRRL-B-5646；恶臭假单胞菌ATCC17453；酿酒酵母NRRL-Y-2034；八孢裂殖糖酵母NRRL-Y-854；洋葱曲霉NRRL-315；产黄青霉ATCC10002；点青霉ATCC36740；Amycolatopsis rugosa NRRL-B-2295；马红球菌ATCC13556；内涂链霉菌NRRL-B-2339；白色曲霉ATCC20022；和微孢藻真菌ATCC89821。
2权利要求1的方法，其中式I中，
R1是任选地被苯氧基取代的苯基；
R2是C1-C3烷基；或
R1，R2和它们所连的碳一起形成如下基团
其中
X是C(＝O)；
R3是OH；
R4是C1-C3烷基；和
R5是卤素。
3.权利要求2的方法，其中式1的对映体酯混合物中的酯是5-氯-2，3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯，其中对映体富集的羧酸酯是(+)对映体，其中生物催化剂选自霍克氏棒状杆菌ATCC7005；黄杆菌属ATCC 27551；食油假单胞菌NRRL-B-3429；恶臭假单胞菌ATCC 23973；假单胞菌属NRRL-B-11330；马红球菌ATCC14887；嗜红红球菌ATCC 4277；嗜粪红球菌NRRL-B-16536；rhodnii红球菌NRRL-B-16535；玫瑰色红球菌ATCC 55602；红球菌属NRRL-B-16531；红球菌属NRRL-B-16534；灰色链霉菌ATCC6855；田野黄单胞菌ATCC 21818；深红酵母ATCC 4557，蚕白僵菌26037；蚕白僵菌ATCC 74292；蚕白僵菌ATCC 26851；刺孢小克银汉霉ATCC8688；马昆德氏拟青霉ATCC10525；小孢盘多毛孢ATCC 11816；米根霉ATCC 10404；米根霉ATCC 22580；同心发癣菌ATCC 74293；手性酶L-7脂酶。
4.权利要求2的方法，其中式I的对映体酯混合物是5-氯-2，3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯且对映体富集的羧酸酯是(-)对映体，其中生物催化剂选自季也蒙氏假丝酵母ATCC 6260；乳酒假丝酵母ATCC 4135；热带假丝酵母ATCC 46491；Yarrowialipolytica ATCC 9773；洋葱曲霉ATCC 10060；nivea白僵菌ATCC74294；Lophotrichus martinii ATCC 11221；掷孢酵母属ATCC 20290；蜡状芽孢杆菌NRRL-B-14591；诺卡氏菌属NRRL-B-5646；恶臭假单胞菌ATCC 17453；酿酒酵母NRRL-Y-2034；八孢裂殖糖酵母NRRL-Y-854；洋葱曲霉NRRL-315；产黄青霉ATCC 10002；点青霉ATCC 36740；SP524脂酶；SP526脂酶；SP539蛋白酶；手性酶L-2脂酶和手性酶L-5脂酶。
5.权利要求2的方法，其中式I的对映体酯混合物是α-羟基-α-甲基-4-苯氧基苯乙酸乙酯，其中对映体富集的羧酸酯是(+)对映体，其中生物催化剂选自假单胞菌属NRRL-B-11330，马红球菌ATCC 13556，热带假丝酵母ATCC 46491，白色曲霉ATCC 20022，蚕白僵菌ATCC 26851，蚕白僵菌ATCC 38657，微孢藻真菌ATCC 89821，同心发癣菌ATCC 74293，IM60酯酶，SP524脂酶，SF526脂酶，酯酶脂酶和CR脂酶。
6.权利要求2的方法，其中式I的对映体酯混合物是α-羟基-α-甲基-4-苯氧基苯乙酸乙酯，其中对映体富集的羧酸酯是(-)对映体，其中生物催化剂选自Amycolatopsis rugosa NRRL-B-2295和内涂链霉菌NRRL-B-2339。
7.权利要求1的方法，其进一步包括从生物催化反应混合物中分离出对映体富集的羧酸酯的步骤。
8.权利要求7的方法，其中所述分离是用萃取或相分离实现的。
9.一种制备对映体富集的羧酸酯的方法，它包括将5-氯-2，3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的对映体酯混合物接触生物催化剂，其中对映体富集的羧酸酯是(+)对映体，其中生物催化剂选自α-糜蛋白酶，β-糜蛋白酶，γ-糜蛋白酶和δ-糜蛋白酶。
10.权利要求9的方法，其进一步包括从生物催化反应混合物中分离出对映体富集的羧酸酯的步骤。
11.权利要求10的方法，其中所述分离是用萃取或相分离实现的。
全文摘要
本发明提供一种用含有微生物细胞或部分或高度纯化的酶制剂的生物催化剂从α叔羧酸酯混合物中富集相应酯的对映体的方法。对映体酯产物可用作制备药物和农业活性化合物的中间体。
文档编号C12R1/645GK1160421SQ9519559
公开日1997年9月24日 申请日期1995年10月4日 优先权日1994年10月12日
发明者F·S·沙利斯兰尼, B·斯蒂格利茨, V·G·维特豪特 申请人:纳幕尔杜邦公司