运输系统的制作方法

专利名称：：运输系统的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种运输系统。本发明尤其涉及向受体-如人运送疫苗的疫苗运输系统。更为特别的是，本发明涉及通过有机体。如常带有寄生虫的食植物或食血性有机体运送寄生虫抗原至受体的运输系统。尤为特别的是，本发明涉及通过蚊子运送疟疾疫苗至受体的运输系统。关于动物和人疾病昆虫载体转基因技术的普通讲义可发现于Crampton等(1989)。对热带地区人群进行有效免疫时遇到的问题中有疫苗运送的后勤学(logistics)问题，尤其是反复的疫苗运送及对合适受体的有效定向。前者的一个实施例为将要进行野外试验的抗疟疾传播-阻滞疫苗(transmission-blocking)(TBV25H)。这里建议如果要在当地获得对寄生虫的有效控制，有效免疫力将需要维持多达约12年之久。然而，被免疫的人将不会被保护而不受感染，且所得的寄生血症将不会提高免疫力(Kaslow1992；Sinden，1994)。这带来了如何有效维持免疫力的问题。在这方面，已进行过一些尝试以克服这个问题-如设计持续释放免疫原(Kaslow，1992)-但这些方法虽然似乎是有希望的，但他们达不到所需的理论目标。此外，如果要对当地人群完成有效的保护，以可选择的贮主宿主如T.cruzi，利什曼原虫属和兽类寄生虫Theleria和梨浆虫属感染存在必须克服的特定困难。在这种情况需要对人/牛/马的受体和贮主人群进行平行免疫，但目前是不可能的。此外，贮主常不容易免疫或确定。因此，总而言之，许多旨在对人和农畜种群进行有效免疫的接种方案在持续疫苗运送的后勤学和对合适受体的有效定向中遇到较大的问题。定向是可选择贮主宿主寄生虫疾病情况中的特殊问题。本发明寻求克服与已知接种方案有关的问题。根据本发明的第一方面，提供一种对于受体的运输系统，该运输系统包括含有受体疫苗的有机体，其中的疫苗能被有机体从它那里传送至受体且其中的疫苗是在受体外部制备。根据本发明的第二个方面，提供了一种从那里接种疫苗的包括能表达疫苗基因的转基因有机体，其中的转基因有机体本身适于用作向受体运送疫苗的手段而进行接种，且其中的疫苗在受体外部制备。根据本发明的第三个方面，提供了一种对受体接种的方法，包括将受体暴露于根据本发明的转基因有机体且允许疫苗从转基因有机体那里并由它传送至受体，其中的疫苗在受体外部制备。根据本发明的第四个方面，提供了一种来自根据本发明的转基因有机体。根据本发明的第五个方面，提供了根据本发明的转基因有机体生产对受体接种的疫苗的用途，其中的疫苗通过转基因有机体运送至受体，且其中的疫苗在受体外部制备。根据本发明的第六个方面，提供了一种具有包含能表达所需抗原基因的唾液腺的转基因昆虫(如转基因食血性或食植物性昆虫)。根据本发明的第七个方面，提供了一种包括根据本发明转基因有机体的唾液的受体，其中的唾液含有通过编码相同抗原基因的表达而产生的抗原。根据本发明的第八方面，提供了根据本发明的转基因有机体生产和运送疫苗而对受体进行接种的用途，其中的疫苗在受体外部制备且通过转基因有机体传送至受体。术语“受体”包括任何合适的对象，可通过用本发明的运输系统向其运送合适的疫苗。例如，受体可以是人或家畜动物-如马或牛。它甚至可以是植物。术语“受体”也包括对象的群体(即贮主)。术语“有机体”包括任何能向所需受体运送合适疫苗的有机体。有机体的例子包括带有寄生虫的食植物或食血性有机体-如蚊子、沙蝇类、厩蝇(stableflies)、蜱类、舌蝇类等。其它例子包括蚜虫及其它植食性昆虫。优选地，有机体是一种在其自然状态下通常以所需的受体为食的有机体。因此，一个优选的实施方案为含有疟疾疫苗的蚊子。有机体可以是在其自然状态下通常会以所需受体为食且在这样做的时候传送感染原至受体而导致感染的有机体。同义语“疫苗”和“抗原”以它们的常规意义使用-即一种本体(如蛋白质)，其在给与一种有机体后能刺激产生适当的应答并因此获得对相关感染的免疫力(部分或完全的)。疫苗的例子包括对疟疾、利什曼原虫病、昏睡病或血吸虫病(bilharzia)等产生免疫力的那些疫苗。术语“转基因有机体”意思为含有对有机体典型非天然的一种额外基因或几种额外基因的有机体。优选地，额外基因为有机体非天然基因-如编码疟疾疫苗的基因。如果能表达疫苗的基因能稳定插入转基因有机体的基因组，那么该有机体的后代也将能表达该疫苗。这是特别有利的。优选地，有机体为转基因有机体且疫苗通过在转基因有机体内含有的基因而表达。基因可在转基因有机体内以，例如质粒或其它形式存在。然而优选地，该基因被稳定插入到转基因有机体的基因组中。优选地，受体为家畜动物、人或植物。优选地，该有机体具有口且疫苗是通过有机体的口而被传送。优选地，有机体为食植物或食血性有机体。优选有机体为昆虫。优选有机体为食血性昆虫。优选有机体为蚊子。优选的蚊子为库蚊(Culex)或伊蚊(Aedes)或按蚊(Anopheles)种类。优选抗原为疟疾疫苗。优选有机体为通常带有寄生虫的有机体。优选基因编码影响(如停止或至少阻碍)导致需要治疗疾病的寄生虫生活周期的抗原。该基因可编码传播阻滞(transmission-blocking)免疫原，如TBV25H或Pfs28。本发明优选的组合包括家畜动物、人或植物作为受体；和影响(如停止或至少阻碍)导致需要治疗疾病寄生虫的生活周期的抗原-如传播阻滞免疫原作为抗原。另一个优选的组合是当受体为人时；转基因有机体为转基因的蚊子；且抗原为疟疾疫苗。优选的能表达所需抗原的基因置于运输系统天然免疫原蛋白之一，如37kDa的蚊子唾液蛋白的强启动子控制之下。本发明的一个主要优点是它提供了被动的和持续的免疫方案(或方法)。另外一个主要优点是本发明提供有效定向适当受体的手段-如定向于人从而对他(她)们接种以防止疟疾。另一个主要优点是本发明的运输系统可用于定向常规免疫方案一般难以得到的贮主种群。总之，本发明是基于这样的认识许多带有寄生虫(如昆虫)，包括许多正由于它而开发抗寄生虫疫苗的疾病的载体的有机体生活周期中一个必不可少的需求是需要在受体身上反复取食(如食血(bloodmeals))。本发明也基于这样的认识居住于充斥食植物或食血性昆虫地区的个体对昆虫唾液形成免疫/变态反应(即食植物或食血性昆虫能运送免疫原性量的蛋白至人)。在这一点，业已发现相当数量的食血性昆虫的唾液含有T细胞激活、嗜中性白细胞活性和巨噬细胞功能抑制剂以及血管舒张素和抗-炎症分子(Riberio等1991；1994；Bissonnette等1994)。然而最终显示长时间反复低水平暴露于食血性昆虫唾液将导致人和动物受体对唾液蛋白的免疫力。对蚊子叮咬变态反应的广泛研究证明了昆虫唾液中免疫原的免疫原潜力(Frazier，1987)。在伊蚊(Aedes)显示自然暴露的成年人的血清识别多达4种唾液蛋白(Brummer-Korvenkontio等，1994)。占优势的反应为IgG4，IgE和IgG1同种型抗原和定向抗‘36kDa’的蛋白。本发明也基于这样的认识在昆虫细胞中表达的重组寄生虫抗原可具有高度和合适的免疫原性。本发明也基于这样的认识构建重组昆虫的能力现在是可能的，因为在昆虫如果蝇(Drosophila)中已获得稳定的转基因。这样，在一高度优选实施方案中，本发明用食植物或食血性有机体(如通常带有寄生虫的昆虫)作为载体以在食血时直接运送抗原至人和动物种群。在有些情况下，本发明的接种方案可用作传统免疫方案的替代或辅助。具有本发明高度优选的运输系统，现在可以通过引起所患疾病传播的食植物或食血性昆虫或通过其它具有合适取食习惯的食血性昆虫的每次叮咬来连续不断地免疫和/或加强免疫人、家畜动物和其它动物贮主。此外，本发明提供能表达所需抗原于其唾液中的转基因食植物或食血性昆虫以使当它们采血取食时少量抗原被运送，这将诱导、维持或加强被叮咬‘受体’的免疫应答。在下面的评述中将更为详细地讨论本发明，其中描述了本发明的进一步优选方面及其优点。有机体的选择理想地，选作本发明运输系统和任何转基因的有机体(如食植物或食血性昆虫)应具有以下特征的一个或几个(优选为所有全部)分布广泛；广泛的食血习惯；在叮咬时运送基本的唾液量；在实验室容易饲养；其卵可长期保存；应该是重要的分子生物学研究对象和对其应该存在瞬时或永久的遗传转化技术。因此蚊子在目前显然是优选的有机体。认识到在疟疾当地区域，在雨季，一个人每晚受到多达200次的蚊子叮咬，因此通过用本发明的运输系统在唾液中运送蛋白的能力显然是高度优越的。在优选实施方案中，任何合适的蚊子将会满足需要。因此，目前制备本发明的运输系统的优选有机体为按蚊(Anopheline)或伊蚊(Aedine)种蚊子。基于特定的有机体，如蚊子是一种寄生虫来源的抗原的载化载体，故注意到其无须一定要被使用以制备本发明运输系统是重要的。而有机体应该是能以要被定向的‘受体’为食的有机体。这样，通过实施例，不带有引起疟疾的寄生虫的蚊子可运送疟疾疫苗。蚊子也可用于运送针对于除疟疾之外的疾病如-血吸虫病的疫苗。抗原的选择疟疾寄生虫抗原(动合子)、天然蛋白和重组蛋白均可用于测定通过抗原性-叮咬(antigenic-bite)而诱导的免疫应答并且现在与关于小鼠对这些蛋白(重组和天然的)免疫应答的广泛数据库一起进入一些实验室的常规使用。用于检测寄生虫传播(来自膜喂养和原封不动的小鼠(membranefeedsandintactmice)免疫效果的传播阻滞分析也在一些实验室中进入常规使用。一个实施例抗原为啮齿类疟疾寄生虫伯氏疟原虫(Plasmodiumberghei)的传播阻滞抗原Pbs21。Pbs21为位于质膜的动合子抗原。它为高度保守基因家族的一个成员，该家族也编码Pfs25和Pfs28，前者为即将进行野外试验的人传播-阻滞疫苗侯选产品(TBV25H)，并且后者为Pbs21的同源物。这些抗原都不是使自然免疫或通过感染而加强免疫，因此通过转基因蚊子重复‘加强免疫’的可能性将在本领域内至关重要。天然Pbs21是具有高度免疫原性的蛋白。据此观点，只要有5μg的单次接种便会诱导显著的传播阻滞活性。整个蛋白在昆虫细胞中表达(用杆状病毒载体)且重组蛋白(rPbs21)在没有佐剂的情况下与天然分子具有相同的免疫原性(Matsuoka等，1994；Margos等1994)。通常减少超过90％的传播，且到目前为止还没有报导重组抗原具有副作用-即增强了寄生虫的传播。rPbs21因此为一种理想的用于实验室研究的重组寄生虫蛋白，从而显示出本发明的运输系统能诱导有效的免疫应答。启动子的选择James等(1991)克隆了编码‘37kDa’的一种重要的唾液蛋白的伊蚊(Aedes)基因，其可能的免疫应答定向由Brummer-Korvenkontio等(1994)见到。该蛋白的信号序列和推断的启动子因此可得到。在一优选的实施方案中，选择的抗原置于来自天然免疫原性唾液蛋白之一，如37kDa蛋白的强启动子控制之下。该优选实施方案异致例如叮咬后被传送至受体的高产量的抗原。构建体的选择能表达所有或选择的T和B细胞分子表位的基因构建体是可以得到的。其它优选构建体包括天然信号序列但其中的膜锚定基序被删除。这些构建体导致可溶性免疫原从昆虫细胞的释放(Matsuoka等，1994)。识别构型依赖性和/或非依赖性表位的广泛范围的高滴度抗体是可以得到的，与ELISA、ELISPOT、IFAT和免疫金技术一起用于检测和测量抗原表达。转基因的定位选择在埃及伊蚊中以唾液腺特异方式表达的许多基因被鉴定(James等，1989)。因此一个优选的实施方案涉及这些基因的使用，如36/7kDa蛋白。在这里，这些基因的上游区域为已知且认为是含有适当的控制序列。因此，结合唾液腺特异基因5′区大片段与Pbs21基因特异免疫原功能区是可能的。对于在有些情况要定向Pbs21至转基因昆虫的唾液导管，以来自分泌型唾液蛋白如36kDa蛋白的信号序列代替Pbs21的信号序列也许是特别必要的。这些组的盒(Cassettes)然后可被导入转染载体。载体的选择可用于产生本发明运输系统的载体可以是已知的载体。例如，可用于在培养的蚊子细胞或蚊子胚胎中导入和表达DNA的典型DNA载体可分别见于Lycett和Crampton(1993)或Miller等(1987)，McGrane等(1988)和Morris等(1989)的文献中。细胞培养系统的选择在细胞培养系统中，细胞可用DNA瞬时或稳定地转染并且导入的DNA在适当启动子的控制下表达(Lycett等1992；Lycett和Crampton1993)。转染方法的选择现在通过瞬时转染方法修饰蚊子唾液腺和中肠是可能的。向蚊子胚胎导入DNA的技术也已被开发且虽然整合不是以高频率发生，但导入的DNA的确偶而整合进入受体基因组以使其传递到蚊子的后代中(Miller等1987；McGrane等，1988；Morris等，1989)。关于本发明，使用细胞转染分析和分离的蚊子唾液腺的转染是可能的。然而，在后者情况下切除的腺体相对地不能透过转染DNA，因为基膜(basementmembrane)作为障碍起作用。但是如果腺体孵育于0.2％弹性蛋白酶，这将去除基膜从而可用阳离子脂，DOTAP将DNA瞬时转染进入唾液腺。使用该技术，同源报告基因可在埃及伊蚊唾液腺中表达。这方面是优选方法的特征。同源重组实验显示同源重组是以基因定向方式向蚊子种系(germline)导入基因构建体的适当方式(Comley等，1994)。因此，通过显微注射向蚊子胚胎导入在适当启动子控制之下的实施例Pbs21基因而产生在其唾液中表达Pbs21的转基因蚊子家系是可能的。基于唾液-斑点(spit-blot)系统(Billingsley等，1991)的简单体外分析和体内分析然后可在蚊子取食时用于测量抗原运送。因此，总言之本发明与过去所做努力的不同在于它旨在发展对昆虫载体分子生物学的更深一步理解(Crampton，1994b)-如用转基因技术产生蚊子或其它不能传送病原体，如疟疾寄生虫的载体(Crampton等，1993；Muller等，1993；Crampton，1994a)。与以前的方法相反，本发明没有使有机体对感染不应。而是本发明用有机体(如昆虫)和它们的取食行为以新奇和创造性的方式去诱导或提高受体的免疫力-如打断病原体生活周期。在这里，本发明运输系统和其中使用的转基因有机体的一个重要方面是这样的事实有机体含有和/或在受体外部原位产生疫苗且然后由转基因有机体本身将疫苗运送至受体。这样，在其最广泛的意义上，本发明涉及向受体的运输系统，包括含有受体疫苗的有机体，其中的疫苗能从有机体那里由它传送至受体，且其中的疫苗是已在受体外部制备的。本发明优选的实施方案包括转基因食植物或食血性昆虫，它们具有包括能表达所需抗原基因的唾液腺。本发明高度优选的实施方案是向受体的运输系统，运输系统包括含有受体疫苗的有机体，其中的疫苗能从有机体那里由它传送至受体，其中的疫苗由在有机体内含有的基因所表达，疫苗在受体外部制备，且其中的有机体是通常以受体为‘食’的食植物或食血性有机体(可以不一定带有寄生虫)。本发明现在将仅通过实施例来加以描述。在下面的实施例中，列出实施例伯氏疟原虫疟疾传送-阻滞抗原Pbs21和埃及伊蚊及史蒂芬斯氏按蚊(Anophelesstephensi)作为参考。而且，下面的说明同样适用于产生根据本发明的其它运输系统。为了证实本发明运输系统的有效性，遵循下面程序中至少一些或全部阶段是必要的程序1.将编码传播-阻滞抗原Pbs21的克隆基因导入到培养的蚊子细胞中并且在典型瞬时和稳定的表达系统中表达该基因。2.反复运送在杆状病毒或从蚊子细胞中产生的且适当低水平的重组Pbs21至实验室小鼠以评估产生的免疫力。这可以在幼年小鼠和以前以Pbs21免疫过(测试应答的增强)的小鼠上进行。3.以含有在组成型和唾液腺特异的启动子控制下的编码Pbs21基因的DNA载体构建体转染培养的蚊子唾液腺。4.以合适的基因构建体转化蚊子胚胎以产生能以适当数量表达蚊子唾液腺中具有高度免疫原性蛋白Pbs21基因的转基因蚊子。5.在实验室研究中，当通过转染蚊子叮咬而运送免疫原时，用小鼠测试作为免疫原的重组Pbs21的有效性。6.释放适当的有效转基因蚊子到野外以影响，如，人的相关疾病，如疟疾。Pbs21通过蚊子细胞的表达和分泌完整的Pbs21以及其信号或锚定序列已被删除的突变体用杆状病毒表达系统在斜纹夜蛾(Spodoptera)细胞和棉铃虫属(Heliothis)幼虫中表达(Matsuoka等1994；Margos等1994)。用同样的方法，蚊子细胞表达和分泌可溶性、正确折叠和修饰过的具有高度免疫原性的Pbs21。作为检验，可以用整个Pbs21编码区和‘少锚定区’(anchor-less)的构建体(Pbs21c2)以现存的载体用果蝇热休克(hsp70)及肌动蛋白5C启动子(Lycett和Crampton，1993)在切除下的唾液腺的暂时表达系统中测试转染的埃及伊蚊和史蒂芬斯按蚊(Anophelesstephensi)细胞系，同样也可在转染的伊蚊(Aedes)胚胎和转基因昆虫中用果蝇的热休克和肌动蛋白启动子。在一个方面，唾液蛋白置于特定启动子和信号序列的控制之下从而在体内提供适当的表达和分泌极性。优选的信号和启动子序列从在唾液腺中表达的基因如从36kDa蛋白获得(James等1991)。监测Pbs21的表达典型的监测Pbs21表达的技术为已知的。例如，Pbs21表达用原位杂交技术在mRNA水平(Thompson&Sinden，1994)和用ELISA及IFAT/共聚焦扫描显微术在蛋白质水平加以检测-由此可提供mRNA和蛋白表达的定量和组织学定位。对整体或器官匀浆的ELISA捕获分析使用两种独特的单克隆抗体12.1和13.1(Tirawanchai等，1991)；对于可制备整个蚊子和/或分离器官的IFAT分析由Simonetti等(1993)描述。如果唾液腺组织在体外或体内表达Pbs21，那么唾液-斑点分析(Billingsley等，1991)用于检测是否重组伊蚊(Aedes)的叮咬运送的唾液运送了可检测或可定量水平的抗原。所表达的Pbs21的免疫原性a.重组Pbs21由静脉注射按蚊(Anopheles)和皮下(SubCut)伊蚊(Aedes)途径在独立的实验中被运送。在不同的实验中施给的剂量反映每周蚊子叮咬频率在5～1000次之间。结果显示在三周期限内仅50次的伊蚊(Aedes)叮咬诱导出小鼠唾液中可检测的免疫应答。认识到截止目前所描述的传播-阻滞效应剂机制均为抗体为基础的(Ranawaka等，1994a-c)，在所有实验中检测免疫应答的以下一个或几个特征i)用rPbs21在捕获分析中(Tirawanchai等1991)全部抗-Pbs21抗体的滴度；ii)传播阻滞效率；这里的免疫小鼠给予激发感染且分析了它们向首次实验的蚊子传播疟疾的能力(Tirawanchai等，1991)。b.重复实验以检测是否重复小剂量抗原的施用会有效地增强已用已知免疫有效量的rPbs21免疫的小鼠(见Matsuoka等1994；Margos等1994)的免疫应答。初次免疫以后，直到检测到总的抗体滴度下降时(通常在上次免疫后5～9周(Margos等，1994))免疫应答才跟上。此时在延长的期限内将免疫小鼠暴露于已知剂量的重组抗原-以模仿自然暴露于转基因蚊子中。接着是激发的和增强的小鼠的免疫应答以检测是否且在什么频率，该免疫作用能在与保护相关的水平(即100μg/ml或更高)维持或提高抗体滴度。如果它们被维持，该实验使人们能够检测到持续免疫应答的维持时间。在构建了在其唾液中表达Pbs21的转基因蚊子以后，用转基因蚊子作为抗原来源重复所有在a.和b.(见上文)中的实验。作为选择，用蚊子唾液和来自棉铃虫属幼虫的rPbs21的混合物重复2a/b的挑选的方面是可行的。Pbs21-A在昆虫细胞中的表达Pbs21在其羧基末端具有一个＜25氨基酸的疏水序列，它被认为是将该蛋白锚定于膜上。该序列已从分子中删除且在培养的昆虫细胞中检测产物的分泌和免疫原性。在基因3′端缺少75个核苷酸的Pbs21编码序列的产生Pbs21基因构建体(PBS21-A)用整个Pbs21编码区序列作为模板通过PCR技术获得，且5′端寡核苷酸引物为5′TCACGGAATTCAATTTTAAATACAGTTTTAT3′EcoR1AsnPheLysTyrSerPhe且也使用反向引物3′TGACCATCGCTTTGCGGTATTCAGCTGGATGC5′终止Sall得到的PCR产物相应于全部编码序列减去最后75个核苷酸且被设计要被翻译和表达蛋白羧基末端减去最后25个氨基酸的Pbs21。PCR产物克隆进入PCr载体(ProkaryoticT-AcloningOneShotKitINVITROGENInc)。PCr载体适于PCR产物的定向克隆。它利用了PCR扩增的DNA末端突出的A和T的优点。在克隆重组载体经转化感受态DH5α大肠杆菌而被扩增后，插入子以EcoRI和Sall核酸内切酸切割，这样允许后来的定向克隆进入pSynXIVVI/2转移质粒。当克隆进入转移质粒后，通过DNA的定向测序确证其取向和正确的序列。草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞以重组转移质粒和亲本vSynVIgal杆状病毒DNA通过脂质体介导的转染进行共转染。经几轮筛选和分离重组杆状病毒后，扩增重组的Pbs21-A杆状病毒(通过斜纹夜蛾细胞的系列感染)。表达蛋白的免疫学结构在杆状病毒-昆虫细胞系统中表达的Pbs21-A蛋白由既结合共转化依赖性又结合非依赖性传播阻滞表位(Mab13.1共转化非依赖性，Mab17.9共转化依赖性)的抗体所识别。蛋白的细胞表达显示蛋白产量的最大水平在感染后48小时，表明该时间是此系统的表达高峰，在还原或非还原条件下通过蛋白质印迹分析，异源蛋白为21kD(类似于天然的寄生虫蛋白)。重组蛋白的分泌通过活体或固定细胞的间接荧光抗体筛选发现蛋白位于细胞内部的细胞质中但没有结合到细胞表面，并且也是以十分显著(Significant)的数量(与细胞蛋白相比)分泌于感染细胞的上清中。感染后20小时，约65％的总蛋白位于上清而35％位于细胞中。48小时后，33％位于上清中而47％位于细胞中，72小时后，77％位于上清而23％位于细胞中且最终经96小时后91％蛋白位于上清中而9％位于细胞中。相同制品的存活性分析显示如下结果20小时-88％存活；45小时-84％存活；72小时-65％存活和96小时-34％存活。因为在这些时间未发现明显的细胞死亡或裂解，因此证明细胞在20小时和48小时分泌Pbs21-A。因此该构建体可用作要在转基因昆虫中表达的抗原。因此本发明涉及向受体的运输系统，该运输系统包括含有受体疫苗的有机体，其中的疫苗能由有机体从它那里传送至受体，且其中的疫苗在受体外部制备。优选地，有机体与受体对象，如人是拮抗性的。这样，本发明提供了包括含有和/或能产生受体疫苗的有机体的疫苗运输系统，其中的疫苗能由有机体从它那里传送至受体，且其中的疫苗在受体外部制备。本发明也提供了一种向受体的疫苗运输系统，该运输系统包括含有和能产生受体疫苗的有机体，其中的疫苗能由有机体从它那里传送至受体，且其中的疫苗通过受体以外的合适基因的表达而产生。对本发明的其它修改对本领域的技术人员是显而易见的。参考文献Beard，C.B.等(1993)舌蝇(tsetse)细菌共生体的遗传转化和种系发生。昆虫分子生物学1，123-131。Billingsley，P.F.，等(1991)。活体蚊子中成熟疟疾感染的检测。Trans.R.Soc.皇家热带医药与卫生学汇刊85，450-453。Bissonnette，E.Y.，等(1993)。蚊子唾液腺提取物抑制肥大细胞(mastcells)肿瘤坏死因子α的释放。寄生虫免疫学15，27-33。Brummer-Korvenkontio，H.，等(1994)用免疫印迹对蚊子唾液特异的IgE和IgG4抗体的检测。变态反应和临床免疫学杂志93，551-555。Collins，F.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