专利名称：水稻中一种抗真菌蛋白及其基因的制作方法
技术领域：
分子生物学技术。
现有技术(与本发明最接近的现有技术)科学家们一直在作物体内寻找能抵抗病原真菌的蛋白及其基因，人们已发现几丁质酶和葡聚糖苷酶能抑制一些病原真菌的生长。但对胰蛋白酶抑制剂能抑制病原真菌的生长还未见报道，我们从水稻种子中分离得到了一种胰蛋白酶抑制剂的基因并发现它能抑制一些病原真菌的生长。通过和现有的EMBL数据库比较，发现我们得到的胰蛋白酶抑制剂基因是一种新的基因。
发明的目的植物的真菌病害是农业上作物减产及品质下降的主要原因之一，科学家们一直努力寻找解决此问题的方法，传统育种方法是一较有效的方法，也培育了一些抗真菌作物，但此方法在财力及人力上耗费很大，而且历时很长，加上真菌进化速度很快，很易产生抗病性。化学农药也被用来防治作物的真菌病，但它对土壤结构破坏性很大，而且作物也易产生抗药性。我们从水稻中分离出一个抗菌的蛋白及其基因，经体外检测发现它能抑制一些病原真菌如引起水稻稻瘟病、棉花植萎病、小麦赤霉病等的真菌的生长。由于此基因在水稻体内只在一定生长阶段少量地表达，因此我们想将此基因转入到植物体内，使其在正常生长情况下都表达，以达到防病抗病的作用。
发明的内容及方案(1)蛋白质我们从水稻种子中分离出的蛋白质其分子量为16.59KD，为一碱性蛋白(pI＝8.7)，其N端的20个氨基酸序列见图1，经与EMBL现有蛋白数据库比较，发现它与胰蛋白酶抑制剂有一定的同源性，并有胰蛋白酶抑制剂的活性。经过打孔法抑菌试验，发现此蛋白能抑制一些病原真菌的生长(见表1)。
(2)基因我们参考上述蛋白序列及水稻选择性密码子设计合成了一对DNA聚合酶链式反应(PCR)引物，经过PCR扩增反应，我们克隆到一个长415bp的DNA片段(图2)，经分析，我们发现它编码了一个有133个氨基酸的蛋白质，与包曼-伯克型胰蛋白酶抑制有74％的同源性。经过与EMBL DNA数据库比较，此基因在此以前无人克隆过。此基因将被用基因工程的方法转入植物，特别是水稻中进行表达，以期得到抗真菌水稻。
优点及效果应用基因工程的方法将目的基因转入异源植物而获得抗病、抗逆、高产高质品种不仅效率高，而且能在很短的时间内将一些农业上优良性状结合在一个品种中，实践已证明这种方法十分有效。而作为这种方法的原材料-目的基因则是一个关键，我们分离到的抗真菌基因来源于水稻，因此它将比原核生物的基因更适合于植物体中表达；目前从植物体内分离到的抗真菌基因还不多，能具有较广谱的抗性则更少。
图1 抗真菌蛋白RAFPI的N端部分氨基酸序列图2 水稻中抗菌蛋白(RAFPI)基因序列及其推导的氨基酸序列表1 抗真菌蛋白RAFPI的抑菌活性实施例我们用抑菌圈的方法对7种病原菌有抑制作用(表1)。将萌发的水稻种子(1120g)磨碎，在预冷的2400ml 60mM醋酸中混合1小时，离心(10,000g，20分钟)取上清。用1M Tris中和至pH7.6并于4℃放置过夜。离心去除沉淀。粗提液用(NH4)SO4饱和至55-80％，将形成的沉淀溶于水后，上CM-Sepharose fast flow离子交换层析柱，平衡液为磷酸缓冲液(10mM，pH7.0)，用0-0.8M NaCl线性梯度洗脱，收集各峰的洗脱液进行抗真菌活性分析，将具抗菌活性最高的峰II洗脱液对磷酸缓冲液透析浓缩后上Sephacryl S-200层析柱，平衡缓冲液为磷酸缓冲液，流速12ml/hour，峰I的洗脱液具抗菌活性，用其对磷酸缓冲液彻底透析浓缩后上FPLC Mono S离子交换层析柱，用0-1MNaCl作线性梯度洗脱，峰II的洗脱液即为具抗菌活性的RAFPI。
根据所得到的RAFPI的部分氨基酸序列，参照水稻偏爱密码子设计引物，序列如下5′端引物为5′CCATCGATGGAGAGGCCATGGAAGTG 3’3’端引物为5’GGAATTCTTATCTTGGCTTGCAGACGGGCCCTGGC 3’以水稻总DNA为模板进行PCR扩增，用常规方法进行PCR产物的克隆及序列分析，得到了编码RAFPI的基因。
*+++，++，+表示相对抑菌活性，由强至弱-表示无抑菌活性表权利要求
1.水稻中一种抗真菌蛋白的基因，其特征在于基因序列如下CCATCGATG GAG AGG CCA TGG AAG TGC TGC GAC AAC ATC GAG 42M E R P W K C C D N I K 12CGG CTG CCG ACG AAG ACC AAC CCG CCG CAG TGG CGC 78R L P T K T N P P Q W R 24TGC AAC GAC GAG CTG GAG CCC AGC AAG TGC GTG GCA 114C N D E L E P S K C V A 36CAG TGC GAG GTG TGC CAG GAG GCG CCG GGG CCA TTC 150Q C E V C Q E A P G P F 48CCG GGC CCG CTC ATC TGC AGC GAC GTC TAC TGG GGC 186P G P L I C S D V Y W G 60GCC GAC CCG GGT CCC TTC TGC ACG CCG CGG CCG TGG 222A D P G P F C T P R P W 72GGA TAT TGC TGC ACC AAC ACC ACC TGC ACC AGG TCG 258G Y C C T N T T C T R S 84ATC CCG CCG ATC TGC CGC TGC AAC GAC AAG GTG AAG 294I P P I C R C N D K V K 96AAG TGC GCC GCC GCG CGC AAG GAT TGC AAG CGG GTG 330K C A A A R K D C K R V 108AAG TCG TCA AAG CCT CCT CGC TAC GTC TGC CAG GAC 366K S S K P P R Y V C Q D 120CAG TTC ACC GGC CAG CCA GGG CCC GTC TGC AAG CCA 402Q F T G Q P G P V C K P 132AGA TAAGAATTCC 415R 133它由415个核苷酸组成，含一个编码133个氨基酸开放读码框架。
2.根据权利要求1中所述基因序列，其特征在于进行PCR扩增的引物序列如下5’端引物为5’CCATCGATGGAGAGGCCATGGAAGTG 3’3’端引物为5’GGAATTCTTATCTTGGCTTGCAGACGGGCCCTGGC 3’
全文摘要
本发明属生物技术领域，采用了分子生物学的实验手段如蛋白质测序、PCR扩增、DNA序列分析等。申请专利的蛋白及基因具抑制真菌生长的功能，能为基因工程提供原料，培育抗真菌作物品种在农业上有较高的应用价值。
文档编号C12N15/29GK1138099SQ9610479
公开日1996年12月18日 申请日期1996年4月30日 优先权日1996年4月30日
发明者顾红雅 申请人:北京大学