专利名称：：测定硫酸抱合型胆汁酸用一体式多层分析元件的制作方法
技术领域：
：本发明涉及分析水溶性液体试样硫酸抱合型胆汁酸的一体式多层分析元件，更详细地说，是涉及定量分析生物体液，例如血液(全血、血浆、血清)、骨髓、淋巴液、唾液、尿等水溶性液体试样中的硫酸抱合型胆汁酸的可干式操作的适用于临床的一体式多层分析元件。作为硫酸抱合型胆汁酸的测定方法，有溶液法，但在特开平2-145183号公报中公开了使用硫酸抱合型胆汁酸脱硫酸酶(BileacidSulfateSulfatase。以下，简称为“BSS”)，首先将硫酸抱合型胆汁酸制成3β-羟基胆汁酸，而后使其与3β-羟基甾体脱氢酶(以下，简称为“3β-HSD”)和作为辅助酶的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸类(以下，简称为“NAD类”)或者烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸类(以下，简称为“NADP类”)反应，测定与硫酸抱合型胆汁酸量成比例地生成的NADH类(还原型NAD类)量或NADPH类(还原型NADP类)量的方法。但是，由于该方法使用发色系列中的四唑鎓盐类，所以在用于干式分析时，出现发色量过低的问题。另外，对于胆汗酸的高灵敏度定量法之一，有使用酶的循环进行测定的方法(参照特开平3-224498号公报)。在该方法中，使用α-HSD，在液体系统中进行α-型胆汁酸的高灵敏度定量。因此，试图用上述两个方法组合，以BSS脱硫酸的3β-羟基胆汁酸作为基质，用3β-HSD进行基质的定量表明，用比较单纯的试剂成分可促进硫代-NADH的着色。但是，由于在液体系统中测定很麻烦，所以希望研究出一种简便且具有高灵敏度的干式一体式多层分析元件。若只有以往的干式试纸的制造方法制作使用酶的循环法的干式一体式多层分析元件，会产生如下问题(1)在制造过程中，由于还原型硫代-NAD(硫代-NADH)发色引起背景的发色，而得不到充分的测定范围。(2)在溶液的调制过程中，由于脱硫酸酶发生混浊，而不能在溶液中均匀分散，所以作不成均匀的溶液，引起测定误差。(3)检体是尿的时候，由于每个人的尿的pH均不同，pH在4-9的宽范围内，因此要想得到可在此范围内缓冲，而且可用于干式缓冲剂是困难的。因此，在酶的循环中，在保持高灵敏度下，将上述溶液法的试剂体系直接用于干式分析元件是困难的。本发明就是要解决这些问题，制作可高灵敏度定量的硫酸抱合型胆汁酸测定用一体式多层分析元件。因此，本发明提供一种分析硫酸抱合型胆汁酸用一体式多层分析元件，它是由支持体、该支持体上的试剂层及该试剂层上的多孔性展开层构成的，在该试剂层及该展开层的至少一方，含有硫酸抱合型胆汁酸脱硫酸酶、3β-羟基甾体脱氢氧化酶及硫代-NAD+及还原型NAD类、或还原型NADP类，其中该试剂层含有水溶性高分子、糖醇类或Mn2+、或者其两者、及缓冲剂。图1是表示实施例1结果的图。检体试样是尿的时候，如上所述，由于每个人的尿的pH差异大，所以作为缓冲剂，需要具有pH4-10范围缓冲能力的缓冲剂。作为这样的缓冲剂本发明采用哌嗪及其氨酰替甘氨酸的混合缓冲剂。作为水溶性高分子，优选的是水溶性合成高分子或水溶性发酵粘性物质，作为例子，可举出聚乙烯吡咯烷酮或出芽短梗孢糖(pullulan)。若使用这些水溶性合成高分子或水溶液发酵粘性物质，可解决由于硫代-NAD(硫代-NADH)的发色引起的背景着色问题。另外，对于糖醇类的种类，没有特别限制。若不用糖醇，在溶液配制过程中，会使脱硫酸酶产生混浊，而且试纸中的组合物的保存稳定性非常低。作为糖醇，可举出D-山梨醇、D-甘露醇等。另外，也可使用与糖醇结构上类似的组合物，例如蔗糖、甘油、聚乙二醇等的多元醇。Mn2+可由锰盐供给，作为锰盐，优选的可使用水溶性的盐，例如氯化锰、硝酸锰、硫酸锰、磷酸锰、硼酸盐、醋酸锰等。对于检体试样是尿时，作为缓冲剂，可使用如上所述的哌嗪-甘氨酰替甘氨酸混合缓冲剂，但对于尿以外的检体试样，作为缓冲剂也可使用操作者常用的缓冲剂。当然，使用哌嗪-甘氨酰替甘氨酸混合缓冲剂，也可缓冲尿以外的检体试样，这是不言而喻的。BBS、3β-HSD、NADH类、硫代-NAD+、水溶性高分子、糖醇或Mn2+、缓冲剂的相互量的关系，如下所述BBS20-200U/ml，优选的是50-100U/ml3β-HSD5-100U/ml，优选的是20-40U/mlNADH0.5-5mM，优选的是2-3mM硫代NAD+1-5mM，优选的是1.5-3mM水溶性高分子6-12％(W/W)，优选的是8-10％(W/W)糖醇1-5％(W/W)，优选的是2-3％(W/W)锰30-300μM，优选的是50-150μM缓冲剂100-500mM，优选的是200-300mM作为支持体的材料，任何一种材料均可以使用，特别是，可使用对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚碳酸酯、聚乙烯、纤维素酯。对于该种试片，只要是普通使用的片状、薄膜状的聚合物都可以。试剂层可通过将含有上述试剂的溶液涂敷在支持体材料上，进行干燥而形成，或者，将其溶液涂敷或浸渍在适当的基材(例如滤纸、无纺布、织物材料、编织材料、玻璃纤维滤纸等)上，进行干燥而制成。多孔性展开层是由滤纸、无纺布、纺织材料、编织材料、玻璃纤维滤纸、过滤膜、聚合物微珠组成的三维栅状的结构物等的一般用于这种试片的材料作成的。以下，举例说明本发明一体式多层分析元件的制造方法。预先将脱硫酸需要的BSS、以及酶循环反应需要的3β-HSD、硫代-NAD+及NADH溶解在缓冲剂溶液中。此时，通过将糖醇或Mn2+中的至少一种添加到缓冲剂溶液中，可抑制溶液中产生的混浊。接着，预先将溶解在与上述相同的缓冲剂溶液中的水溶性高分子溶液与上述酶溶液充分混合再搅拌。将该混合溶液，在支持体上均匀展开后进行干燥，形成试剂层，然后，将展开层叠层，进一步干燥。往往在两个干燥阶段中产生不希望的着色，使背景色上升，但通过使用水溶性高分子、特别是精制度高的聚乙烯吡咯烷酮和/或出芽短梗孢糖，可抑制背景色的上升。切断这样得到的试验片原片，用粘结胶带粘结在支持体上，进行切断，得到测定用试片。按照本发明，可抑制空白值的上升，在配制试剂层所用溶液时，可防止酶的凝集。实施例1配方BSS(マルキン酱油株式会社制)1.33mkat/l(80Uml)3β-HSD(マルキン酱油株式会社制)0.33mkat/l(20Uml)NADH(东方酵母株式会社制)3.0mmol/l硫代-NAD+(东方酵母株式会社制)2.5mmol/l吐温(Tween)20(ナカラィテスク社制)0.5重量％粘合剂(聚乙烯吡咯烷酮)9.0重量％(对于涂敷的总重量)[(Kollidon)90F(BASF公司制)]缓冲剂哌嗪-甘氨酰替甘氨酸200mmol/l(pH7.0)D-山梨醇((ナカラィテスク社制)3.0％混合上述配方的成分，将得到的溶液涂敷在PET膜的表面，在温度40℃下，干燥约10分钟。放置在含浸0.01％特里顿(triton)X-100的滤纸上面，加压，密贴，将展开层叠层。然后，进行干燥，得到试片原片。在得到的试片原片的PET侧，贴上两面粘结胶带后，裁成规定的尺寸，用两面粘结胶带贴在支持体(PET板)上，得到试验片。测定在如上所述，在制作的各试验片上，以石胆甘氨酸(Lithocholilglycine)3-磺酸盐(以下，简称“GLCA”)作为检体，进行试验，用专用反射率计(スポツトケム株式会社京都第一科学制)测定110秒后的反射率的变化。另外，在表中，使用K/S单位，但它是准反射率换算成浓度时使用的单位，若用R表示反射率时，K/S＝(1-R)2/2R该K/S值，在检体中含的被测物质浓度高时，表示的值大，浓度低时，表示的值小。实施例1的结果，如表1所示。表1</tables>(单位k/s值)在实施例1中，由于背景色的降低，与GLCA浓度成比例，可以得到测定的充分灵敏度。另外，图1表示空白值的随时间变化。表明在实施例1中，其值稳定。图中，PVP表示聚乙烯哟咯烷酮。实施例2将含有10μmol/l的GLCA，用1N盐酸或1N氢氧化钠调节成表2所示pH的尿检体各5μl点着的试验片上。用小型的pH计测定点着的尿检体，其结果如表2所示。表2</tables>从此结果可以看出对具有宽范围pH的尿检体都具有充分的缓冲能力。权利要求1.一种分析硫酸抱合型胆汁酸的一体式多层分析元件，它是由支持体、该支持体上的试剂层及该试剂层上的多孔性展开层构成的，在该试剂层及该展开层的至少一方，含有硫酸抱合型胆汁酸脱硫酸酶、3β-羟基甾体脱氢氧化酶及硫代-NAD+及还原型NAD类或还原型NADP类，其中该试剂层含有水溶性高分子、糖醇类或Mn2+、或其两者及缓冲剂。2.根据权利要求1所述的分析硫酸抱合型胆汁酸用的一体式多层分析元件，其中的水溶性高分子是水溶性合成高分子或水溶性发酵粘性物质。3.根据权利要求1或2所述的分析硫酸抱合型胆汁酸用的一体式多层分析元件，其中含在试剂层中的缓冲剂是在pH4-10的范围具有缓冲能力的缓冲剂。4.根据权利要求3所述的分析硫酸抱合型胆汁酸用的一体式多层分析元件，其中的缓冲剂是哌嗪-甘氨酰替甘氨酸。5.根据权利要求1所述的分析硫酸抱合型胆汗酸用的一体式多层分析元件，其中在该试剂层及该展开层的至少一方含有硫酸抱合型胆汁酸脱硫酸酶20-200U/ml；3β-羟基甾体脱氢氧化酶5-100U/ml及硫代-NAD+及还原型NAD类或还原型NADP类0.5-5mM；硫代-NAD+1～5mM；水溶性高分子6-12％(W/W)；糖醇1-5％(W/W)；Mn2+30-300μM及缓冲剂100-500μM。全文摘要一种分析硫酸抱合型胆汁酸用的一体式多层分析元件，它是由支持体，该支持体上的试剂层及该试剂层上的多孔性展开层构成的，在该试剂层及该展开层的至少一方，含有硫酸抱合型胆汁酸脱硫酸酶、3β-羟基甾体脱氢氧化酶及硫代-NAD文档编号C12Q1/32GK1159481SQ96105779公开日1997年9月17日申请日期1996年3月13日优先权日1996年3月13日发明者田村浩,帖佐敏,米原聪申请人:株式会社京都第一科学