专利名称：抗病高产蛹虫草栽培方法
技术领域：
本发明涉及一种药用食用菌蛹虫草的栽培工艺技术。
蛹虫草是名贵中药材虫草属的一个品种。可以代替虫草入药，性平味甘，益肾肺，补精髓，止血化痰，其药用价值已广为人知，市场需求量很大。但蛹虫草天然资源较少，故国内外都在致力于人工化生产的研究。综合现有技术成果，虽然已有相当一部分人工栽培技术公开，但尚有不足之处目前应用的蛹虫草栽培的菌种在栽培过程中侵染的杂菌病害很多，危害较重的病是枯萎病—尖孢镰孢病原菌，先侵害子实体(草)的柄部，使柄的髓部萎缩，草即不再长大，最后使草萎蔫。蛹虫草抗菌抗病能力低，这是造成减产的重要原因之一。其次目前应用的所有栽培菌种，产生子实体(即草)的适宜温度都是18-23℃，25℃以上不易产生草，所以在很多地区夏季不能栽培，相应年产量受到限制。
本发明的目的是提供一种能抗菌、病的蛹虫草之高产栽培方法。
本发明是这样实现的1).抗病高产蛹虫草菌种选育a.从发病区(瓶)中，选出健康子实体(草)用单细胞分离法，分离获得单孢纯菌株。
b.把若干单孢纯菌株，接种到被病菌侵染的培养料环境中，进行驯化培养出草，从中选出健康的草，再单孢分离出单孢纯菌株，然后把分离出的单孢纯菌株接到被病菌侵染的培养料中进行驯化，这样一直重复三次驯化。
c.从三次抗病驯化的结果中，选出健康株，进行三次出草栽培试验，选其产量高的菌株。
d.从上述抗病力强、高产的不同批号中选出两个亲本进行单孢杂交(单孢分离，配对杂交，对杂交后代的抗病力和产量试验)。
e.为提高蛹虫草新菌株的抗病力，把上述单孢杂交选育出来的抗病高产菌株，选一代表株作为一亲本，再从当年由山上采回的野生蛹虫草分离单孢纯菌株，经过出草试验选其高产的菌株作为另一个亲本(因为野生抗病力强)。将两个亲本按上述单孢杂交法选育出一些抗病强的高产菌株，这些菌株再经过三次出草栽培试验，最后筛选出抗病高产蛹虫草菌种。
虽然已经选育出抗病菌种，但要使栽培菌的培养料等外部环境尽量减少或无杂菌侵染，应有防治方法，最终保证提高产量。为此经过药效试验，最后筛选出防治侵染菌效用较佳的药物，如铵铜液和井岗霉素可防治尖孢镰孢菌，保菇灵可防治木霉等杂菌。
f.蛹虫草高温驯化选育，即选原来在26℃左右能产生子实体(草)的抗病高产菌株作为出发菌株，在26℃、27℃、28℃三个温度梯度下进行驯化试验先进行26℃驯化，培养菌丝阶段(即发菌阶段)按一般常规25℃培养，出子实体(草)阶段置于26℃培养，待草成熟时，选择出草早、量多、粗壮、色深的子实体，用单孢分离法分离出单孢纯菌株，以上述方法再分别进行27℃、28℃驯化试验，按上述标准选出耐高温抗病高产菌株，然后在28℃进行三次出草栽培试验。
2).一级种制备首先制备PDA培养基斜面，然后以无菌操作由原母种转接到PDA斜面上，置25±1℃恒温培养7天。
3).二级种(生产种)制备分液体种和固体种两类①液体种取液体培养基适量装入容器内，用聚丙烯塑料膜封口，121℃、一个气压下灭菌30分钟，待冷却后，无菌操作接入一级种子，置25±1℃，静止或震荡培养7-10天。
②固体种子取适量固体培养基装入容器内制成平面，用聚丙烯塑料膜封口，121℃、一个气压下灭菌30分钟，冷却后取一级种子，以无菌操作转接到容器内培养基上，置25±1℃培养7天。
4).栽培培养基取培养基原料适量装入栽培瓶内，用聚丙烯塑料膜封口，121℃、一个气压下灭菌30分钟，PH7.0-7.5。
5).接种和培养菌丝体在无菌条件下，取生产种适量接入冷却后的栽培瓶内培养基上；于25±1℃暗培养13天左右，此阶段为培养菌丝体的阶段，又称发菌阶段。
6).子实体培养及其管理菌丝体移入栽培室培养，此阶段为培养子实体—草的阶段，室内温度为20-28℃，湿度为85-90％，保持散射光，防止直射光，光强度为4000-30000勒克斯，根据温度和湿度适当通风，发菌结束的栽培瓶移到栽培室，见光后变成黄色，3天以后开始出现幼小原基，后逐渐长大成子实体(草)。
7).采收再经过三周左右时间子实体成熟后，要及时采收，自然风干后收存。
上述为第一茬培养程序，其后可以进行第二茬、第三茬培养，方法同第一茬。但每茬采收时要在杀菌房中采收，然后往每个栽培瓶内加适量灭菌的培养液。只栽培三茬，生物转化率就可达170％以上，所以该菌种及栽培方法是高产的。
本发明通过一系列措施提高了人工栽培蛹虫草的产量1.选育出具有抗病高产的优良菌种。2.筛选出具有防治病菌的方法，以防止减产。3.对培养料中的营养成分做了精心调配。4.栽培工艺上把目前蛹虫草栽培中的三级种改为二级种，把目前所有蛹虫草的生产工艺的生产周期又缩短了10天以上，生产周期的缩短，必然促进产量增加。5.只一次栽种，连采收三茬，使生物转化率达170％以上。6.以往蛹虫草人工栽培中，子实体(草)产生和生长的温度都只在18-23℃范围内，高至25℃就不易产生。而本发明在26℃左右能产生子实体(草)的菌株中，选其生长势好的草分离出单孢纯菌株，置于26℃、27℃、28℃栽培进行温度驯化，经出草试栽后选出耐26-28℃的高产菌株。
实施例1抗病蛹虫草单孢杂交育种一.亲本选择
1.抗病力的驯化先从发病的生产瓶中，选出健康子实体(草)，用单细胞分离法分离出单孢纯菌株。分离和保存菌种培养基为PDA，成分是去皮马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，水1000毫升。
把选定的100株菌以无菌操作分别接到被病菌尖孢镰孢菌侵染的培养瓶内的培养基上，培养基成分为大米30克，培养液50毫升，PH7-7.5；营养液成分为20％的马铃薯汁100％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.1％。每栽培瓶加104/毫升病源菌悬液0.5毫升)。置25℃暗培养13天后移入栽培室内见散射光(不是直射光)，光强度为4000-30000勒克斯，温度20-25℃，湿度85-90％，适当通风。进行抗病驯化培养，待长出草时从中选出出草早、最高最粗的、橙黄色深的草10株，再用单菌分离法分离出单孢纯菌株，以此类推重复三次抗病驯化培养。
2.亲本选择从三次抗病驯化的结果，选出健康株10株，(标准同前)，分离出单孢菌株，每株选出10株，共选出100株进行出草栽培产量试验(栽培方法同前)从中选出健康的、抗病强、产量高的菌株，再从其中选出不同批号的两株作为单孢杂交的两个亲本。
二.单孢分离1.制备孢子悬液以无菌操作，用多孢分离法收集两个亲本的孢子在三角瓶内，用生理盐水制备104/毫升孢子悬液，再接到45℃半固体PDA培养基内，振摇使孢子分离。
2.单孢分离(毛细管法)待孢子悬液温度降至40℃时，把灭菌的毛细管插入其中吸取孢子悬液，然后将吸满孢子悬液的毛细管置于无菌载玻片上，用显微镜镜检，找出左右两侧相间较大且呈单个的分散孢子，以无菌操作用镊子将此段毛细管折断后置PDA斜面或平板上，25℃培养一周，挑取由单孢子萌发的菌落，逐个镜检，留取白色、均一、正齐、粗壮的典型单核体菌落，再培养一周，取出保存在4℃冰箱中。
三.配对杂交把选留的单核体菌落，见光后挑选变黄色的，按两个亲本分别编成A、B两组，各组内的编号分别为1-30号。取直径为5厘米的小培养皿30套，在背后用红色玻璃笔写上编号1-30，左部写A，右部写B，然后制成PDA平板，再按A、B两组及编号对应将单核体菌落各取0.5厘米一块，以无菌操作分别移接到平板上，两菌块间距为2厘米，置于25℃培养10天以上，当两个单核体菌落生长相互连接时，形成一交界线，外观看有一明显突起界线，颜色也不同其他部位，见光后，明显变黄色至橙黄色，这种颜色变化标志着由无性阶段进入了有性阶段，即在显微镜下镜检有双核细胞出现。将这一部位的菌丝，取其中橙黄色深的，均一、整齐、粗短壮的菌丝，以无菌操作转接到PDA斜面上，置25℃培养两周后，待出草栽培试验。
四.出草试验将培养两周的上述单孢杂交的纯菌株，以无菌操作转接到栽培培养基上(培养方法、培养基、培养条件同前)培养出草，待出草成熟时，以生物转化率计算产量，选瓶单产高的，从中再选出草早、健康无病、粗高色深的草进行单孢分高出纯菌株，再进行出草栽培试验，反复三次出草试验，最后以上述标准，选出抗病强、高产的菌株为单孢杂交选育的新菌种。
五.提高抗病能力为提高和巩固上述选育出的蛹虫草新菌种的抗病力，把该菌种作一亲本，当年从山上采的野生蛹虫草分离出的单孢纯菌株，经出草栽培试验后，选其产量高、粗壮、出草早的草，分离出的单孢纯菌株为另一亲本。两个亲本进行单孢杂交(方法同前)，选育出的一批菌种，再进行三次出草栽培试验(方法同前)，从中选出优良菌株，再经过万瓶以上的扩大栽培，最后选出抗病能力强，生物转化率高的菌株，鉴定为抗病高产蛹虫草菌种。
实施例2保菇灵、井岗霉素、铵铜液、对木霉菌、尖孢镰孢菌的防治一.防治药品效果试验1.药品保菇灵、井岗霉素、铵铜液、多菌灵、甲基托布津、代森锌。
配制浓度保菇灵、多菌灵、甲基托布津、代森锌配0.1％，井岗霉素配1000倍液，铵铜液(硫酸铵与硫酸铜比为11.1∶1)300倍液2.病原菌种木霉菌、尖孢镰孢菌、接在无琼脂的PDA培养液中制备孢子悬液。
3.效果试验蛹虫草的出草栽培方法同前，只是在料中拌进上述浓度的药品，在接种蛹虫草时同时接种0.5毫升/瓶的木霉或尖孢镰孢菌，每种菌每种药品各接30瓶。
4.效果保菇灵防治木霉效果最好，为95％以上；铵铜液和井岗霉素防治尖孢镰孢菌效果最好，为90％以上，上述药品对其它杂菌也有防治作用，而对蛹虫草却无毒害。
二.保灵菇对木霉菌，井岗霉素和铵铜液对尖孢镰孢菌防治浓度试验1.药品保菇灵配成0.1％、0.15％、0.2％浓度，井岗霉素配成5单位、3单位、1单位的1000倍液，铵铜液配成300倍液、310倍液、320倍液。
2.菌种木霉菌和尖孢镰孢菌菌悬液浓度同前。
3.试验方法同前。
4.效果保菇灵防治木霉菌的最佳浓度为0.2％，效果达99％以上；井岗霉素最佳浓度为5单位1000倍液，效果96％以上，铵铜液最佳浓度为320倍液，效果达97％以上。
实施例3耐高温高产蛹虫草高温驯化选育1.菌种选原来在26℃左右能产生子实体(草)的菌株，为出发菌株。
2.驯化试验
驯化温度为26℃、27℃、28℃三个温度梯度。
首先进行26℃驯化，先按以前出草栽培方法进行，培养菌丝阶段(即发菌阶段)按一般常规25℃培养。出子实体(草)阶段置于26℃培养。待草成熟时，选择出草早、量多、粗壮、色深的子实体，用单孢分离法分离出单孢纯菌株，以上述方法进行27℃、28℃驯化试验，按上述标准选出耐高温高产菌株，再在28℃进行三次出草栽培试验。
实施例4抗病高产蛹虫草栽培一、菌种制备1.菌种用单孢杂交法选育抗病高产菌种(方法见实施例1)2.一级种制备首先制备PDA培养基斜面，然后以无菌操作由原母种转接到PDA斜面上，置25℃恒温培养7天。
3.二级种(生产种)制备分液体和固体两种①液体种取液体培养基100毫升装入罐头瓶或500毫升三角瓶内，用聚丙烯塑料膜封口，121℃、一个气压下灭菌30分钟，待冷却后，无菌操作接入一级种子，置25℃，静止或震荡培养7-10天。
液体培养基20％的马铃薯汁100％，蔗糖或食用糖2％，蛋白胨0.2％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.1％，PH7.0-7.5。
②固体种子取50毫升固体培养基装入250-300毫升三角瓶或罐头瓶内制成平面，用聚丙烯塑料膜封口，121℃、一个气压下灭菌30分钟，冷却后取一级种子，以无菌操作转接到瓶内培养基上，置25℃培养7天。
培养基20％马铃薯汁100％，蔗糖或食用糖2％，蛋白胶0.2％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.1％，琼脂2％，PH7.0-7.5。
二、栽培1.栽培培养基取大米32克，小米2克，培养液54毫升装入栽培瓶内，用上述塑料膜封口，121℃、一个气压下灭菌30分钟，PH7.0-7.5。
培养液20％的马铃薯汁100％，蛋白胨0.2％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.1％，维生素液20毫升，铵铜液3％，(或井岗霉素0.27单位)，保菇灵0.2％。
维生素液VB1--0.01％，VB2--0.01％，VB12--0.01％混合。
铵铜液11.1份硫酸铵和1份硫酸铜混合。
2.接种与培养在无菌条件下，取液体生产种3-5毫升，或者固体生产种0.8平方厘米，接入冷却后的栽培瓶内培养基上，于25℃暗培养13天左右，(此阶段为培养菌丝体的阶段，又称发菌阶段)。之后移入栽培室培养(此阶段为培养子实体--草的阶段)，室内温度为20-28℃，湿度为85-90％，保持散射光，防止直射光，光强度为4000-30000勒克斯，根据温度和湿度做适当通风，不同情况通风方式也不同。发菌结束的栽培瓶移到栽培室，见光后变成黄色，这叫转色，3天以后开始出现幼小原基，后逐渐长大成子实体(草)，再经过三周左右时间子实体成熟了，要及时采收，自然风干后收存。这是第一茬，然后可以进行第二茬、第三茬培养，方法同第一茬。但每茬采收时要在杀菌房中采收，然后往每个栽培瓶内加15-20毫升上述灭菌的培养液。只栽培三茬，生物转化率就可达170％以上，所以该菌种及栽培方法是高产的。
权利要求
1.一种抗病高产蛹虫草栽培方法，其特征在于经过菌种选育、一级种制备、二级种制备、培养基制备、接种、发菌、子实体培养及其管理、采收等步骤实现，即1).抗病高产蛹虫草菌种选育a.从发病区(瓶)中选出健康子实体(草)，用单细胞分离法，分离获得单孢纯菌株；b.把若干单孢纯菌株，接种到被病菌侵染的培养料环境中，进行驯化培养出草，从中选出健康的草，再单孢分离出单孢纯菌株，然后把分离出的单孢纯菌株接到被病菌侵染的培养料中进行驯化，这样一直重复三次驯化；c.从三次抗病驯化的结果中，选出健康株，进行三次出草栽培试验，选其产量高的菌株；d.从上述抗病力强、高产的不同批号中选出两个亲本进行单孢杂交；e.把上述单孢杂交选育出来的抗病高产菌株，选一代表株作为一亲本，再从当年由山上采回的野生蛹虫草分离单孢纯菌株，经过出草试验选其高产的菌株作为另一个亲本，将两个亲本按上述单孢杂交法选育出抗病强的高产菌株，这些菌株再经过三次出草栽培试验，最后筛选出抗病高产蛹虫草菌种；f.蛹虫草高温驯化选育，即选原来在26℃左右能产生子实体(草)的抗病高产菌株作为出发菌株，在26℃、27℃、28℃三个温度梯度下进行驯化试验—先进行26℃驯化，培养菌丝阶段(即发菌阶段)按一般常规25℃培养，出子实体(草)阶段置于26℃培养，待草成熟时，选择出草早、量多、粗壮、色深的子实体，用单孢分离法分离出单孢纯菌株.以上述方法进行27℃、28℃驯化试验，按上述标准选出耐高温抗病高产菌株，再在28℃进行三次出草栽培试验；2).一级种制备首先制备PDA培养基斜面，然后以无菌操作由原母种转接到PDA斜面上，置25+1℃恒温培养7天；3).二级种(生产种)制备分液体种和固体种两类①取液体培养基适量装入容器内，用聚丙烯塑料膜封口，121℃、一个气压下灭菌30分钟，待冷却后，无菌操作接入一级种子，置25+1℃，静止或震荡培养7-10天；②取适量固体培养基装入容器内制成平面，用聚丙烯塑料膜封口，121℃、一个气压下灭菌30分钟，冷却后取一级种子，以无菌操作转接到容器内培养基上，置25+1℃培养7天；4).栽培培养基取培养基原料适量装入栽培瓶内，用聚丙烯塑料膜封口，121℃、一个气压下灭菌30分钟，PH7.0-7.5；5).接种和培养菌丝体在无菌条件下，取生产种适量接入冷却后的栽培瓶内培养基上，于25+1℃暗培养13天左右；6).子实体培养及其管理菌丝体移入栽培室培养，室内温度为20-28℃，湿度为85-90％，保持散射光，防止直射光，光强度为4000-30000勒克斯，根据温度和湿度适当通风，发菌结束的栽培瓶移到栽培室，等待其见光后变色、出现幼小原基后逐渐长大成子实体(草)；7).采收再经过三周左右时间子实体成熟后，及时采收，自然风干后收存；8).其后进行的第二茬、第三茬培养，方法同第一茬。
全文摘要
一种抗病高产蛹虫草栽培方法，经过菌种选育、一级种制备、二级种制备、培养基制备、接种、发菌、子实体培养及其管理、采收等步骤人工培育出抗病高产蛹虫草，同时筛选出防治侵染菌药物，调配恰当的培养料中营养成分，把以往蛹虫草栽培中的三级种改为二级种，生产周期缩短了10天以上，只一次栽种，连采收三茬，生物转化率达170％以上，且耐26-28℃的高温。
文档编号C12N1/14GK1138097SQ9611511
公开日1996年12月18日 申请日期1996年2月26日 优先权日1996年2月26日
发明者张显科, 刘文霞 申请人:张显科