防止移植中移植排斥和产生通用基因治疗宿主细胞的方法

专利名称：防止移植中移植排斥和产生通用基因治疗宿主细胞的方法
技术领域：
本发明涉及防止移植的器官、组织或细胞发生移植(物)排斥的方法，尤其涉及这样的方法，该方法包括对细胞类型进行遗传工程改造使其植入宿主时会表达LAG-3蛋白。更具体地，本发明涉及产生在其表面表达LAG-3蛋白的通用基因治疗宿主细胞。
背景技术：
的描述淋巴细胞活化基因(lymphocyte activation gene)(LAG-3)是免疫球蛋白超家族的一员，它在人的活化T细胞(CD4+和CD8+)和NK细胞中被选择性地转录(Triebel等人，1990)。其序列数据以及经与内含子/外显子组织结构和染色体定位相比较，揭示出LAG-3与CD4紧密相关(Baixeras等人，1992)。LAG-3和CD4之间的紧密关系还得到了进一步的证实，即两者共享相同的配体即MHCⅡ类分子(Baixeras等人，1992)。然而，与CD4相反，LAG-3不与人免疫缺陷病毒gp120结合(Baixeras等人，1992)。在体内，LAG-3的表达既没有在初级淋巴器官(如脾脏、与粘膜相关的淋巴组织)中发现，也没有在正常淋巴结中发现。然而，可在受感染的扁桃体或滤泡增生的淋巴结中轻易地检测到它，这一现象支持了这样的观点即使在体内，LAG-3的表达是在活化作用之后(Huard等人，1994A)。在抗-LAG-3单克隆抗体(mAb)存在下，对T细胞克隆进行抗原特异性刺激会导致胸苷掺入量增加、活化标记物CD25的表达更高以及细胞因子的产量增加(Huard等人，1994B)。
因此，添加可溶性重组LAG-3可抑制抗原特异性T细胞增殖，这暗示LAG-3在CD4+T-淋巴细胞激活作用中有调控作用(Huard,1996)而且涉及熄灭正进行的免疫应答反应。最近，已表明，LAG-3还作为NK细胞的协同受体，并且界定受先天免疫系统控制的杀伤肿瘤细胞的不同模式(Miyazaki等人，1996)。
T细胞对外来(同种异体或异种)蛋白或细胞或器官发生应答的机制，已经了解得相当清楚。抗原呈递细胞(APC)会被吸引到炎症或受伤区域(这可因手术移植而诱发)。在外周的全部T细胞会不停地检查组织是否有病原体的证据或是否存在外来(同种异体或异种)组织。一旦识别任何警告信号，APC就会吞下蛋白，消化它并将其呈递给宿主的免疫系统。
早已对异体的或同系的肿瘤细胞进行遗传工程改造，以表达病毒性IL-10，这可诱导对肿瘤细胞局部无反应性。这种处理并不影响较远部位处非转导肿瘤发生排斥(SuZuki等人，1995)。局部IL-10给药，被认为能够将对移植细胞起反应的全部T细胞转变为Th2表型，这种表型不导致细胞溶解而且甚至可起保护作用。
在无免疫抑制的情况下，天然表达Fas配体的细胞已经可移植通过异体或异源屏障。宿主T细胞对植入位点的监视，会在与Fas配体接触时导致T细胞的杀伤(Bellgrau等人，1995)。此外，胰岛异体移植物的排斥现象，已经可通过同时移植同系的、经遗传工程改造而表达Fas配体的成肌细胞而得以防止(Lau等人，1996)。
免疫系统的装备精良，可以快速地识别外来的、生病的或发炎的组织，并且快速加以摧毁。这一直是组织、器官和细胞移植中以及基因治疗中的主要障碍。主要问题通常与长期免疫抑制、封闭或免疫隔离有关。长期免疫抑制的不利副作用包括对机会性感染和肿瘤形成的易感性上升。
在无须持续免疫抑制的情况下，希望长期接受移植组织，是人类医学上一个久已存在的目标。
本文引用任一文献，并不意味着承认该文献是相关的已有技术，也不认为与本申请权利要求的专利性有关的材料。对于任何文献的内容或日期的陈述，是以申请人在申请之时所能获得的信息为基础的，因而并不表示承认这一陈述的正确性。
发明概述现已发现，移植在其表面上表达LAG-3蛋白的细胞，可起保护作用以避免宿主免疫系统的移植排斥现象。
因此，本发明提供了一种遗传工程改造过的细胞，该细胞可以是待移植的组织或器官的一部分，该细胞含有编码位于表面的跨膜LAG-3蛋白的DNA，从而起保护作用而免受宿主免疫系统的移植排斥作用，其中该DNA可以是基因组DNA或cDNA。该DNA可以是外源的、或者在本发明的一个具体例子中是内源的，该DNA的表达可利用同源重组通过定向插入调控序列和/或可扩增基因而得以激活或修饰。LAG-3蛋白是可被针对LAG-3的抗体所识别的蛋白质。
当这种细胞是待移植组织或器官的一部分时，可以直接在待移植组织或器官上实现LAG-3DNA的转染。
具体地，这种细胞是通用的基因治疗宿主细胞，它适用于例如任何种类的体细胞的或“活体外的”基因治疗。
在一个具体例子中，基因治疗宿主细胞还包括编码感兴趣治疗剂的外源DNA，因而遗传工程改造过的细胞被用作治疗剂。如本文所用，术语“治疗”包括疗治和/或预防。
在另一例子中，编码感兴趣治疗剂的基因位于细胞基因组中，而且该细胞还含有编码调控序列和/或可扩增基因的外源DNA，以激活或修饰感兴趣内源基因的表达。
然而，本发明的遗传工程改造细胞可以仅含有外源LAG-3DNA，并与含有感兴趣的治疗性DNA的其他基因治疗宿主细胞联合使用。
本发明细胞宜选自成肌细胞、成纤维细胞、造血干细胞、胚胎干细胞、胎儿肝细胞、脐静脉内皮细胞和CHO细胞。
如上所述的、衍生自转基因动物的细胞也在本发明范围之内。
本发明的另一目的是在细胞表面上表达的跨膜LAG-3蛋白(包括其突变蛋白和变异蛋白)的用途，它们被用于制造药物，该药物可引发防止宿主免疫系统发生移植排斥的保护作用。
此外，本发明提供了含有编码跨膜LAG-3蛋白(该蛋白在细胞表面上表达)的DNA的细胞的用途，它们被用于制造药物，该药物可引发防止宿主免疫系统发生移植排斥的保护作用。
在本发明范围之内的，还包括在其表面上表达LAG-3的细胞的用途，即用于制造与待移植的细胞、组织或器官相混合的药物，该药物可引发防止宿主免疫系统发生移植排斥的保护作用。
附图简述

图1-用LAG-3-CHO细胞或LH-CHO细胞致敏的(primed)小鼠脾细胞对于LH-CHO细胞的细胞毒性。平均值(±SD)来自如图例所示进行致敏的5只小鼠；此外还评估了2只未致敏的小鼠。
图2-用LAG-3-CHO细胞或LH-CHO细胞致敏的小鼠脾细胞对于LAG-3-CHO细胞的细胞毒性。平均值(±SD)来自如图例所示进行致敏的5只小鼠；此外还评估了2只未致敏的小鼠。
图3-Dα哺乳动物表达载体的结构图。使用的缩写如下DHFR，脱氢叶酸转录单元(Subraimani等人，1981)；pML,pBR322的衍生物(Lusky和Botchan,1981)；hAIVSA，人糖蛋白激素α亚基的内含子A的片段(Fiddes和Goodman,1981)；MMT-1，小鼠金属硫蛋白1的启动子(Hamer和Walling,1982)。
发明详述每年，成千上万的人因为心、肾、肝、肺和胰脏的衰竭而死亡。一种最有效的疗法就是移植。
与移植细胞、组织或器官相关的疗法，会在宿主中诱发针对植入的细胞、组织或器官的全身免疫保护状态。需要建立对移植物的特异性保护以免受宿主免疫系统的排斥，尤其在异体移植、异种移植和基因治疗中。此外，也需要抑制对肿瘤组织的耐受性，或否则让宿主免疫系统攻击肿瘤组织。
因此，本发明涉及所有的上述方法，这些方法利用了表达跨膜LAG-3蛋白的细胞或组织的移植，可保护移植物以避免宿主免疫系统发生移植排斥这一发现。
本发明采用新发现的LAG-3基因和蛋白，它通常是在活化的T细胞和活化的NK细胞上表达的。
如本文所用，定义“跨膜LAG-3蛋白”指任何含有LAG-3细胞质外结构域的跨膜蛋白，其盐、功能性衍生物、前体或活性部分，以及其活性突变蛋白和其活性变异体，它们都在细胞表面上表达。
该定义还指这样的跨膜蛋白，它以其天然状态表达，或可通过例如遗传工程而融合于其他蛋白(如糖基磷脂酰肌醇锚蛋白)或其他跨膜蛋白(如TNF受体、MPL-配体或跨膜免疫球蛋白)的任何有关片段。
如本文所用，定义“盐”指通过已知方法获得的化合物的羧基盐或氨基官能团的盐。羧基盐包括无机盐，例如钠盐、钾盐、钙盐，以及与有机碱形成的盐，例如与三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸等胺形成的盐。氨基的盐包括例如与无机酸如盐酸形成的盐，以及与有机酸如乙酸形成的盐。
如本文所用，定义“功能(性)衍生物”指可根据已知方法从氨基酸部分的侧链上的功能基团或N-或C-末端基团制得的衍生物，而且当它们在药学上可接受时(即它们不破坏蛋白质活性，也不使含有它们的药物组合物具有毒性)，被包括在本发明内。这样的衍生物包括例如，羧基所形成的酯或脂族酰胺、以及自由氨基的酰基衍生物、或自由羟基的O-酰基衍生物，它们可以通过与酰基基团例如alcanoyl基或芳酰基反应而形成。
“前体”是可在人体或动物体内转变成LAG-3的化合物。
作为蛋白质的“活性部分”，本发明指化合物本身多肽链的任何片段或前体，它可以是单独的也可以与相关分子或与其结合的残基(例如糖残基或磷酸根残基)相混合，或者当这些片段或前体具有与作为药物的LAG-3相同活性时可指多肽分子的聚集体。
优选的“活性部分”是LAG-3蛋白胞外部分的可溶性部分，它包括LAG-3的细胞质外结构域即D1、D2、D3和D4四个结构域中的一个或多个结构域。
如本文所用，定义“活性突变蛋白”指其他的蛋白质或多肽，其中结构中的一个或多个氨基酸被删去或被其他氨基酸所置换，或者在序列中添加了一个或多个氨基酸，以便获得具有与LAG-3相同活性的多肽或蛋白质。例如，Arg73和/或Arg75和/或Arg76可以被不同的氨基酸(较佳地被Glu)所替换。
LAG-3的“活性变异体”是剪接方式不同的变异体以及所有一级基因转录物，它们是在基因的不同切割位点因不同剪接机制而衍生得到的。优选的变异体是缺少LAG-3胞外部分的D3和/或D4结构域的可溶性蛋白或跨膜蛋白，它可任选地含有位于D2或D3结构域后的一些额外的氨基酸。
跨膜LAG-3蛋白在细胞表面的表达可以用免疫反应方法加以证实。跨膜蛋白可被例如抗-LAG-3抗体11E3(保藏号No.CNCM I-1612)、17B4(保藏号No.CNCM I-1240)或15A9(保藏号No.CNCM I-1239)所识别。
本发明还涉及一种如上所述的多肽和衍生物的混合物。
当用于本说明书和权利要求书时，词语“LAG-3”、“LAG-3蛋白”、“LAG-3分子”指包括天然的、合成的和重组形式的该多肽，并且包括上述的所有定义。
本发明的细胞可选自原代或次代细胞。如本文所用，术语原代细胞包括存在于从脊椎动物组织源分离出的细胞的悬浮液中的细胞(在它们被平板接种之前，即在附着于组织培养基质如皿或瓶之前)，存在于衍生自组织的外植体中的细胞、被第一次接种的上述两种细胞、和衍生自该接种细胞的细胞悬浮液。术语次代细胞或细胞株指在随后的所有培养步骤中的细胞。即，第一次将接种的原代细胞从培养基质上取下并再接种(传代)时，它在本文就被称为次代细胞，在随后传代中的所有细胞也称为次代细胞。次代细胞是由已传代一次或多次的次代细胞所构成的细胞株。一个细胞株可由以下次代细胞构成(1)已经传代一次或多次的次代细胞；(2)在培养中表现出有限的平均群体倍增次数的次代细胞；(3)表现出接触抑制的、依赖于贴壁(“依赖于贴壁”并不适用于在悬浮培养中繁殖的细胞)生长的次代细胞；和(4)非无限增殖化的次代细胞。“克隆的细胞株”被定义为衍生自单个原始细胞(founder cell)的细胞株。“异源细胞株”被定义为衍生自两个或多个原始细胞的细胞株。
本发明包括原代和次代体细胞，例如成纤维细胞、角质化细胞、上皮细胞、内皮细胞、胶质细胞、神经细胞、血液的有形成分、肌肉细胞和其他能够被培养的体细胞以及体细胞前体，它们被外源DNA转染，其中外源DNA可稳定地整合入基因组中或者以附加体方式在细胞中表达。形成的细胞被分别称为转染的原代细胞和转染的次代细胞。
当编码LAG-3分子的基因被插入哺乳动物细胞，而该细胞被植入异体或异种宿主时，它们会被宿主免疫系统所识别但是不会引发免疫应答。
宿主免疫系统变得不能排斥这些细胞，而如果这些细胞没有被改造以在表面表达LAG-3分子的话，它们原本是会被排斥的。LAG-3还可在不相关的细胞类型的细胞表面上表达，然后与待移植的细胞或组织混合，这也可获得与上述相类似的结果。因此，本发明涉及在无全身免疫抑制下对细胞、组织或器官进行移植。
可移植这些细胞、组织或器官，以提供蛋白质或发挥某些功能来治疗某些疾病。通过使用这一技术，即将LAG-3呈递给宿主免疫系统，可以使移植物被宿主接受。
还可以通过共同施用已改造过从而表达LAG-3的成纤维细胞或其他原代或次代细胞，来防止对特定细胞、组织或器官的移植排斥。这种保护性状态可归咎于对介导免疫应答的机制进行了局部抑制或全身抑制。这种保护性状态可归咎于细胞介导的细胞毒性的无变应性、缺失、无应答性、耐受性或预防性。一旦建立了保护状态，它可持续长时间，甚至因例如感染耐受性之类的现象而永久保持(Qin等人，1993)。
本发明可以用于移植细胞、组织、器官或宿主细胞，以便为了各种人体医疗需要而输送基因或基因产物。
可通过标准的重组DNA技术或通过利用同源重组激活内源LAG-3基因的技术，来诱导LAG-3基因的表达。细胞类型可用任何方法从转基因动物获得，而该转基因动物在其特定组织或无关细胞中表达LAG-3基因。然后可将该这些细胞与需要保护以防止移植排斥的细胞相混合。这提示，免疫保护性分子LAG-3的局部分泌并不在全身发挥作用。用LAG-3转导但没有转化的成纤维细胞会在体内产生类似的应答。用LAG-3转导的成纤维细胞接种物的免疫保护效应是依赖于剂量的，但是不依赖于LAG-3分子的来源。
共同施用表达LAG-3的细胞，可使供体T细胞失活，同时防止宿主免疫系统的攻击。这种治疗可诱导特异性的无变应性、耐受性，或否则诱导保护作用以免受受体中细胞介导的细胞毒性，这会导致免疫微环境的长期改变从而可以起保护作用以免受自身反应性T细胞。这可以通过如下方式实现共同施用来自健康供体的少量异体骨髓细胞和已改造过以表达LAG-3的人异体细胞。这导致通过微嵌合性(microchimerism)的发展而使自身反应性T细胞下降(Delaney等人，1996)。
患有具体疾病或缺陷的人，可以因异体移植许多不同的细胞、组织或器官而受益。例如，诸如肝、肾、心、胰脏、小肠之类的器官是经常移植的，而细胞也适用于移植，例如胰岛，可用于治疗帕金森氏病或病灶性癫痫的神经组织，作为化疗或放疗的治疗手段的造血干细胞，治疗高胆固醇血症的正常肝细胞，治疗心肌梗塞的心脏细胞，治疗肌营养不良的肌肉细胞。
出于多种原因，异体骨髓移植一直难以实现。这些原因包括移植排斥、因机会感染而导致的感染(由移植物或免疫抑制药物的污染而造成)、或其他原因。排斥可归咎于受体对供体骨髓植入物的抗性以及竞争性免疫细胞有进攻受体的倾向(即移植物抗宿主疾病)(graft-versus-host disease,GVHD)。通过除去移植物中的T细胞，或者通过同时施用免疫抑制药物，可以控制GVHD。当T细胞被消除时，移植物就复原(reduced)了。
作为消除T细胞的后果，移植失败率就更高。据认为，T细胞可能对移植发挥重要作用，例如产生细胞因子(Kernan等人，1987)。
已表明，仅需少量异体的但健康的骨髓细胞，就可在实验模型中减少甚至防止自身免疫疾病的发生。然而，照此进行的治疗却导致了移植物抗宿主疾病。
骨髓移植已被用作根治某些肿瘤的方法。这主要是因为异体T细胞能够识别和杀灭肿瘤组织，例如在移植物抗白血病中。
在所有上述情况下，可以避免全身免疫抑制，如果用编码LAG-3的基因来改造待移植的细胞或器官，从而移植入宿主中时能够表达LAG-3蛋白并引发对移植物的保护作用。
在异体移植中的第一个问题是缺少可供移植的人组织，目前对于器官的需求远远超过了供应量。尽管仍被认为是一种实验程序，但是异种移植被认为是异体移植的有力替代形式。诸如猪或狒狒之类的动物目前正考虑作为器官或细胞供体。建立免受移植排斥的保护作用，对于临床上成功使用不同物种的器官是至关重要的。通过例如使用抗人CD4、CD8、NK细胞的抗体，或者将待移植的动物细胞进行微囊化处理，可以至少部分克服宿主的抗性。根据本发明，动物可以被转基因式地改变，以便在某些细胞类型中表达LAG-3基因，例如胰岛细胞，可使用胰岛素基因启动子和导向系统或其他组织特异性的标记系统。
据认为，在肿瘤组织中表达LAG-3，在其对抗宿主免疫系统对肿瘤组织的细胞介导式攻击中起重要作用。
根据本发明的一个具体实施例，通过使用基因治疗或活体外处理少量肿瘤组织并再植入，可以对肿瘤组织进行改造以表达反义LAG-3分子或对LAG-3信使特异的核酶。这样可使免疫系统能够与肿瘤组织反应并学会摧毁它。还可用抗LAG-3的抗体来处理少量肿瘤组织，以防止LAG-3所诱发的T细胞抑制作用，从而引发针对肿瘤组织的细胞或体液免疫。
目前，非常需要基因治疗来治疗各种不同疾病，其中包括(但并不限于)腺苷脱氨酶缺陷症(ADA)、镰形细胞贫血、地中海贫血、血友病、糖尿病、α-抗胰蛋白酶(α-antitripsin)缺陷症、脑疾病如早老性痴呆病(Alzheimer’s disease)和其他疾病如生长疾病和心脏病(比如胆固醇代谢途径改变所导致的疾病)，以及免疫系统缺陷。
可将不同细胞用于个体移植，例如成肌细胞可用于肌营养不良，分泌诸如TPO、GH、EPO、因子Ⅸ或其他因子之类物质的细胞和血细胞可用于治疗遗传性血液病，以及其他原代人或动物细胞，例如内皮细胞、上皮细胞、结缔组织细胞、成纤维细胞、间充质细胞、间皮细胞和实质细胞(parenchymal cell)。
由于许多问题，基因治疗的结果还不十分令人满意。即使是最先进的试验，在该试验中用腺苷脱氨酶(ADA)基因来治疗一位年轻女孩，但是因为害怕仅用基因治疗还不足以有效，病人仍然每周接受PEG-ADA注射。
目前，基因治疗方案的缺点之一是，为了防止宿主免疫系统排斥细胞，需要单独地生产宿主细胞。基因治疗必须以个体为基础在个体上进行治疗。此外，即使在基因治疗中使用自身的细胞，仍经常发现转基因的表达是短暂的，因为表达的其他病毒蛋白会引起宿主免疫系统的反应。
可使用缺陷型腺病毒载体，但是仍有问题，因为被表达的其他病毒蛋白仍会引发免疫应答。高浓度的病毒，即使是缺陷型病毒，也会刺激炎症应答和免疫攻击。宿主细胞免疫系统会记住病毒载体，这样将来给药的效力就更低了。
缺失了病毒蛋白E1的复制缺陷型腺病毒，被常规地用于基因治疗方案中。不幸的是，它们在成年的且免疫能力的宿主中仅暂时有效，这可能是针对腺病毒或重组蛋白的免疫应答所造成的(Kozarsky和Wilson,1993；Barr等人，1992；Stratford等人，1992；Rosenfeld等人，1992；Lemarchand等人，1992)。因此，迫切需要开发免疫原性不那么强的新载体，或者可以免疫保护遗传工程改造过的细胞的方法。
这些载体可制成效价高达1011噬斑形成单位/毫升，并且感染许多复制阶段和非复制阶段的细胞。可使用复制缺陷型腺病毒来将生理浓度的重组蛋白输送给全身的循环系统。LAG-3基因宜在普遍存在的活化性细胞EFlα启动子和4F2HC增强子的转录控制之下(Tripathy等人，1994)。
已经尝试通过包裹细胞或免疫抑制宿主来避免该问题。
使用此处所述的方法，可将异种或异体细胞用作在表面上表达LAG-3分子的基因治疗宿主细胞，从而引发保护作用以免宿主免疫系统发生移植排斥。它们包括例如，成肌细胞、成纤维细胞、造血干细胞、胚胎干细胞、胎儿肝细胞、脐静脉内皮细胞和CHO细胞。基因治疗宿主细胞还可被改造以表达单纯疱疹腺苷激酶基因。通过添加9-(1,3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤(gancylovir)可特异性地摧毁这些细胞。
tk-“9-(1,3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤”敏感型细胞具有优于非敏感型细胞的明显优势，即它们可以随时被摧毁(Bi等人，1993)。
因此，根据本发明制得的能够在其细胞表面上表达LAG-3和Hsv-tk基因的通用宿主细胞，可以产生一种通用的基因治疗宿主细胞，该细胞可以在无免疫抑制的情况下植入，并且可以在不再需要其活性的任何时候加以摧毁。
通过使用任何基因转移方法，本发明的异体或异种基因治疗宿主细胞可被改造以表达转基因和/或LAG-3基因。这些方法有例如(但并不限于)复制缺陷型病毒法、腺伴随病毒法、高效逆转录病毒法、将DNA直接注射入骨髓，电穿孔法、磷酸钙转染法，微注射法、包裹入脂质体或红细胞血影法。表达LAG-3的细胞，如成肌细胞或CHO细胞，可以与表达感兴趣蛋白的待永久移植的细胞一起施用。如果瞬时暴露于LAG-3已足够，那么被LAG-3转染的成肌细胞或CHO细胞可含有自杀基因(如上面所述的tk基因)，从而可以通过用9-(1,3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤处理而除去。
该方法可用于回复正常功能，即通过施用基因或基因产物，或通过去除或灭活对身体有害的基因(如癌基因)。这一目的可以这样实现植入输送核酶或反义cDNA的细胞，从而抑制不利蛋白质(如HIV蛋白或生长因子)的产生。该方法可用于纠正酶缺陷，如在Gaucher氏病或ADA缺陷症中。
根据另一实施例，本发明涉及一种基因治疗方法，它包括(ⅰ)在选定的人或动物细胞中插入治疗所需基因和编码LAG-3分子的基因；和(ⅱ)将步骤(ⅰ)中得到的细胞引入病人中。或者，上述基因可以被插入到病人的组织器官中，这可以在体内进行，或通过基因的直接转染或通过针对该组织或器官的定向载体来进行。
例如，所述的表达系统可以将裸DNA或病毒载体直接注射入细胞群(如肌肉细胞)中，或者直接施用于导气管(airway)中(例如治疗囊性纤维变性)。构建物不仅含有感兴趣基因(例如传导调节子(conductance regulator,CFTR)cDNA)，还含有LAG-3基因，以便在该细胞类型上共表达，从而防止可能发生的针对例如腺病毒衣壳蛋白的体液免疫应答(针对腺病毒衣壳蛋白的免疫应答会限制重复给药时的效力)。将基因转入造血干细胞可用于输送多种药物抗性基因，以便与化疗时抑制快速分裂免疫细胞的副作用相斗争。逆转录病毒载体可与细胞因子组合使用以促进干细胞分裂，这些因子有例如青灰因子(steel factor)、kit配体、IL3、GM-CSF、IL-6、G-CSF、LIF、IL12等。
除了LAG-3基因之外，选定的细胞还可用编码其他免疫抑制物质如IL10、TGFβ、Fas配体等的基因进行共转染。
作为本发明的一个具体例子，上述方法可用于治疗受体，即用少量感兴趣的且改造过以表达LAG-3基因的细胞来治疗受体，这会使宿主因宿主免疫系统的感染耐受性而能够耐受下一次给予的细胞、组织或器官。
下面仅以阐述方式，结合下列实施例来描述本发明。
实施例1方法产生表达跨膜LAG-3的CHO细胞从pCDM8质粒(Invitrogen,San Diego,CA)中，将LAG-3cDNA以1620bp片段形式切下，并用琼脂糖凝胶电泳进行纯化。
将该片段亚克隆人用Xho消化的pCLH3AXSV2DHFRhαIVSA(Dα)哺乳动物表达载体(图3)。通过磷酸钙沉淀法，用DαLAG-3构建物转染CHO-DUKX(DHFR-)细胞。转染后的细胞在选择培养基(MEM培养基，不含脱氧核糖核酸和核糖核酸，并加有10％透析过的胎牛血清和1％L-谷氨酰胺+0.02μM氨甲蝶呤)上生长。LAG-3的表达是通过Western印迹法对裂解的细胞膜制剂进行检查，并定期用抗-LAG-3的单克隆抗体17B4，通过流式细胞分析进行检查。
将CHO细胞移植入小鼠将未转染的(野生型)，或者是用全长的人LAG-3或人LH cDNA转染过的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，从塑料瓶上脱离下来，并以1.75×107细胞/毫升的浓度悬浮于Dulbeceo改进的极限必需培养基(DMEM)。将26头鼠龄为7-9周的C57BL/6雌性小鼠如表Ⅰ分成7组，然后将200毫升所示的细胞悬浮液(含3.5×106细胞)皮下注射于每头动物的右侧。在第3、6和7组中，同一小鼠在右侧接受LAG-3转染过的细胞，在另一侧接受对照细胞(LH-转染过的细胞或未转染细胞)。在注射后4天，用二氧化碳吸入法杀死小鼠，然后剖开皮肤检查注射部位。
表1-实验组

评估对CHO细胞的细胞毒性对每组5头C57BL/6雌性小鼠皮下注射4×105个用人LH或人LAG-3cDNA转染过的CHO细胞。在14天后，杀死小鼠，取出脾脏，制得脾细胞悬浮液。用培养液(RPMI1640+10％胎牛血清+抗生素)将107细胞/毫升的脾细胞悬浮液(效应子)进行稀释，然后在不同稀释度下接种一式3份，以获得不同的效应子(effector)靶细胞之比。对于每种悬浮液，制备2块板。将5×103细胞/100微升用51Cr标记过的靶细胞(被LH或LAG-3转染过的细胞)加至板中(每种靶细胞一块平板)。在37℃20小时后，从每个孔中取出20微升上清液，通过液闪法评估51Cr的释放情况。根据下式计算细胞毒性，以裂解的百分比表示

其中，“自发”和“最大”分别表示培养液孔(靶细胞自发释放Cr)和用TritonⅩ1％替换效应子悬浮液的孔(最大的Cr释放量)。
结果将CHO细胞移植入小鼠大多数接受LAG-3转染型细胞的小鼠，在注射部位有白色小结(nodule)，而用野生型CHO处理或接受LH转染型CHO细胞的动物却没有出现小结。在大多数小鼠中，注射野生型CHO细胞导致在注射部位出现弥漫性出血。这一现象在接受LH转染型CHO细胞的动物中较不明显。在不同部位同时注射野生型和LAG-3转染型CHO细胞的动物中，该小结仅在注射LAG-3转染型CHO细胞的部位出现，而在注射野生型的部位出现出血(表2)。
早先在类似实验中进行的组织学分析表明，在该小结中存在异源细胞。该实验结果示于附图(对于小鼠的识别编号可见表1)并总结于表3。
表2

每种细胞类型单独注射于一侧(a)=LAG-3一侧(b)=LH一侧(c)=野生型一侧表3

对CHO细胞的细胞毒性在CHO细胞表面上表达LAG-3，并不影响小鼠对异种细胞进行免疫致敏的能力。事实上，来自注射LAG-3-CHO细胞的小鼠脾细胞会使两种靶细胞裂解，而且与用LH-CHO细胞致敏(primed)的小鼠同样有效并优于未致敏的小鼠。然而，在细胞表面上表达LAG-3，伴随着对细胞毒性(由小鼠对靶细胞的免疫所诱导)敏感性的下降，这可从图1和图2中裂解百分比的比较看出。由非致敏小鼠脾细胞所产生的“天然”细胞毒性，并不因表面表达LAG-3而下降。这表明，LAG-3的表面表达降低了细胞毒T淋巴细胞(CTL)活性的输出部分(efferent branch)。CTL是效应子中的一种，它在移植器官的排斥现象中起主要作用(G.Berke,1993)，因此抑制它们的功能可延长异体移植物的存活期。
文献1．Triebel等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.),171:1393,19902．Baixeras等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.),176:327,19923．Huard等人，免疫遗传学Immunogenetics,39:213,1994A4．Huard等人，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.),24:3216,1994B.
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权利要求
1．一种遗传工程改造过的细胞，其特征在于，它含有编码位于该细胞表面的跨膜LAG-3蛋白的DNA，从而起到防止宿主免疫系统发生移植排斥的保护作用。
2．如权利要求1所述的细胞，其特征在于，该编码LAG-3蛋白的DNA是外源的。
3．如权利要求1所述的细胞，其特征在于，该编码LAG-3蛋白的DNA是内源的，并且通过同源重组从而定向插入调控序列和/或可扩增基因，来激活或修饰它的表达。
4．如权利要求1-3中任一权利要求所述的细胞，其特征在于，该细胞是待移植的组织或器官的一部分。
5．如权利要求1-3中任一权利要求所述的细胞，其特征在于，该细胞是基因治疗宿主细胞。
6．如权利要求5所述的细胞，其特征在于，该基因治疗是体细胞基因治疗，或是“在活体外”基因治疗。
7．如权利要求1-6中任一权利要求所述的细胞，其特征在于，还含有额外的免疫抑制物，如IL-10、TGFβ或Fas配体。
8．如权利要求1-7中任一权利要求所述的细胞，其特征在于，还含有腺苷激酶(tk)基因，该基因对tk-9-(1,3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤自杀系统敏感。
9．如权利要求1-8中任一权利要求所述的细胞，其特征在于，该细胞衍生自转基因动物。
10．如权利要求1-9中任一权利要求所述的细胞，其特征在于，它选自成肌细胞、成纤维细胞、造血干细胞、胚胎干细胞、胎儿肝细胞、脐静脉内皮细胞和CHO细胞。
11．如权利要求5-10中任一权利要求所述的细胞，其特征在于，还含有编码感兴趣治疗剂的外源DNA。
12．如权利要求5或10所述的细胞，其特征在于，还含有外源DNA，该DNA编码调控序列和/或可扩增基因，来激活或修饰感兴趣的内源基因的表达。
13．在细胞表面上表达的跨膜LAG-3蛋白的用途，其特征在于，它被用于制造药物，该药物可引起防止宿主免疫系统发生移植排斥的保护作用。
14．如权利要求1-12中任一权利要求所述的细胞的用途，其特征在于，被用于制造药物，该药物可引起防止宿主免疫系统发生移植排斥的保护作用。
15．如权利要求1-10中任一权利要求所述的细胞的用途，其特征在于，被用于制造药物，该药物与待移植的细胞、组织或器官相混合，从而引起防止宿主免疫系统发生移植排斥的保护作用。
16．一种引起特异性保护作用，以防止宿主免疫系统对移植的细胞、组织或器官发生移植排斥的方法，其特征在于，包括向宿主病人施用权利要求1-12中任一权利要求所述的细胞。
17．如权利要求16所述的方法，其特征在于，该细胞是待移植组织或器官的一部分。
18．如权利要求16所述的方法，其特征在于，该细胞是基因治疗宿主细胞。
19．如权利要求18所述的方法，其特征在于，包括(ⅰ)在选定的宿主细胞中插入治疗所需基因和编码LAG-3分子的基因；和(ⅱ)将步骤(ⅰ)中得到的细胞引入需要治疗的宿主病人中。
20．如权利要求16-19中任一权利要求所述的方法，其特征在于，包括用少量改造过以表达LAG-3基因的细胞来治疗需治疗的宿主病人，以引起防止宿主免疫系统发生移植排斥的保护作用，从而能再次施用待移植的细胞、组织或器官。
21．一种排斥肿瘤组织的方法，其特征在于，对该肿瘤组织细胞进行改造，使其表达反义LAG-3分子或对LAG-3信使特异的核酶。
22．一种遗传工程改造的细胞，其特征在于，它含有DNA，该DNA编码位于细胞表面的跨膜LAG-3蛋白以用作药物。
全文摘要
描述了一种在无全身免疫抑制的情况下,防止对移植的细胞、组织或器官发生移植排斥的方法。该方法利用了新发现的蛋白质LAG－3。当异体或异种细胞被基因改造从而在表面上表达LAG－3并且被移植时,可防止对植入的细胞、组织或器官发生免疫摧毁,同时宿主免疫系统仍保留其功能。该方法的一种具体应用是制备在表面上表达LAG－3的通用基因治疗宿主细胞,从而起防止宿主免疫系统发生移植排斥的保护作用。
文档编号C12N15/11GK1234834SQ96180510
公开日1999年11月10日 申请日期1996年11月29日 优先权日1996年11月29日
发明者M·比弗尼, R·帕波恩 申请人:应用研究系统Ars股份公司