专利名称：改变由生物体产生的磷脂组成的方法和其重组载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及改变由生物体产生的磷脂组成的方法和其重组载体。
磷脂是天然存在的非离子表面活性剂，它们在食品、医学和各种物质的制备领域中具有使用价值。磷脂主要由生物物质产生，磷脂的组成是决定物质质量的要素之一。
目前人们尚不清楚确定磷脂组成的因素，还未曾报道过通过基因工程改变磷脂组成的方法。
本发明的一个目的是提供一种人工改变由细胞产生的磷脂组成的方法。
本发明人进行了深入的研究，发现通过抑制基因编码磷脂酶D(下文也称为“PLD”)的表达可以改变由细胞产生的磷脂的组成，从而完成本发明。
也就是说，本发明提供了一种改变由寄主细胞产生的磷脂组成的方法，所述方法包括用重组体DNA转化所述的寄主细胞，而重组体DNA具有磷脂酶D基因的反义基因，所述反义基因被表达在所述寄主细胞内，以产生在所述寄主细胞内和磷脂酶D基因的mRNA杂交的mRNA，由此抑制所述磷脂酶D基因的表达。本发明也提供了具有磷脂酶D基因的反义基因的重组体DNA，所述反义基因被表达在所述寄主细胞内，以产生在所述寄主细胞内和磷脂酶D基因的mRNA杂交的mRNA，由此抑制所述磷脂酶D基因的表达。
PLD是一种磷脂酶，例如它催化水解卵磷脂反应以释放磷脂酸和胆碱。已知这种酶存在于植物、动物和微生物中。在本发明的方法中所使用的寄主细胞可以是任何植物、动物和微生物细胞，只要它们具有PLD基因即可。优选的寄主细胞是植物细胞，更优选地是种子植物的细胞。
本文使用的术语“种子植物”是指开花并形成种子的植物。在本发明的种子植物细胞中，优选使用单子叶植物，尤其是大米。
本发明方法所使用的重组载体包括PLD基因的反义基因，所述反义基因能抑制PLD基因在寄主细胞内的表达。PLD基因的核苷酸序列是已知的。例如，微生物和动物的PLD基因的核苷酸序列描述于日本延迟公开专利申请号平3-187382Adrian L.M.Hodgson，Phllip Bird，和Ian T.Nisbet 1990，“在由假结核病棒状杆菌产生的磷脂酶D的大肠杆菌中的克隆，核苷酸序列和表达”细菌学(Journal of Bacteriology)172，1256-1261；和日本延迟公开专利申请号平5-76357中。就植物的PLD基因而言，在WO95/09234中公开了大米和玉米的PLD基因的核苷酸序列。此外，还报道了由拟南芥属和蓖麻子产生的PLD基因(《植物生理学》(Plant Physiol)(1995)1091497-1499，植物基因登记号PG95-096，《生物化学》(J.Biol.Chem.)(1994)26920312-20317)。
在上述参考文献(植物基因登记号PGR95-096)中，描述了由大米、玉米、拟南芥属和蓖麻子产生的PLD基因彼此是高同系的，因而建议种子植物的PLD基因是很好保藏。
因此，通过常规方法，采用上述的大米、玉米和诸如探针的PLD基因序列可以容易地获得种子植物的PLD基因。
由于PLD基因的核苷酸序列是已知的，因此反义基因易于制备，它们产生的mRNAs互补于使用PLD基因作模板而产生的mRNAs的至少一个区域。也就是说，PLD基因的反义基因是一种具有相同的序列的双链DNA作为完整的或部分的PLD基因，它们将被插入在起反义链作用的PLD基因的有义链方向上(下文也称之为“插入在反义方向上”)。反义基因的长度未必是PLD基因的全部长度，但可以是抑制PLD基因表达的长度。即反义基因的长度优选地不少于300bp并且不超过PLD基因的全部长度，更优选地不超过lkbp并且不超过PLD基因的全部长度。
由于PLD基因的核苷酸序列是已知的，所以PLD基因的反义基因可容易地通过化学合成，通过采用PLD基因作为模板的PCR或通过采用PLD基因的cDNAs作为模板的RT-PCR而制备。
在本发明中，对欲引入的反义基因是没有限制，只要该反义基因编码mRNA即可，而该mRNA在活体内和在寄主细胞内的PLD基因的mRNA杂交。由反义基因产生的mRNA和寄主内的PLD基因的mRNA互补链之间的同系现象优选地不超过70％，更优选地不超过80％，最优选地不超过90％，尤为优选地不超过95％，最好不超过100％(即寄主细胞内的PLD基因的反义基因)。
在本发明方法中使用的重组载体是一种可以在寄主细胞内表达上述PLD基因的反义基因的重组载体。因此，重组载体在寄主细胞和启动子内具有复制起点的作用，并且反义基因被插入到启动子的下游中。优选地，重组载体具有终止区和选择性标记，例如抗药基因。这类表达载体的数量对于各种寄主细胞来说是已知的并且可以从市场上购得。由于市售的表达载体具有称为多克隆位点的区域，而该位点具有多个启动子下游的限制性位点，所以本发明的重组载体可以容易地通过将上述反义基因插入到多克隆位点上来制备。
然后用按上述方法制备的重组载体来转化寄主细胞。可以通过对于各种类型的寄主细胞来说众所周知的方法进行这种转化。例如，在下面描述的实施例中，采用众所周知的电穿孔法来转化大米细胞。但是，不用说，转化方法并不限于电穿孔法。
然后选择转化的细胞。这种选择可以根据表达载体内的选择标记来进行。此外，更可靠的是通过Southern分析或类似方法确证在含有选择性标记的细胞内存在反义基因。
随后从转化细胞中回收磷脂。磷脂的提取可以按常规方法进行。例如，可以通过在沸水中处理细胞，然后用有机溶剂萃取所得产物而提取磷脂。在寄主细胞是能从愈伤组织中再生植物的诸如大米细胞的植物细胞的情况下，所述的转化处理可以在原生质体上进行，植物可以通过培养愈伤组织而得到再生，并且可以从再生的植物中回收磷脂。这种方法特别适合于大规模生产。在这种情况下，优选地是通过Southern法确证在再生植物中有反义基因存在。
磷脂分子由磷脂酰胆碱(下文也称之为“PC”)，磷脂酰丝氨酸(下文也称之为“PS”)和磷脂酰乙醇胺(下文也称之为“PE”)等组成，可以通过这些组分含量的比例确定磷脂的组成。本发明的方法是改变构成磷脂的所有组分的含量比例，并且不改变特定的磷脂的含量。另外，尽管在下面描述的实施例中仅测定了PE，PS含量的比例，但是改变磷脂的组成并不受到它们的限制。
按照本发明，首先通过基因工程方法改变由生物体产生的磷脂的组成。因此，本发明能够产生在食品、医学和生产各种物质领域使用价值比天然存在的磷脂更大的磷脂。
本发明的具体效果如下1.作为磷脂主要组分的PC被用作可消化的表面活性剂，食品添加剂，例如乳化剂和用作为药物的包裹膜。例如，通过改变磷脂的组成可以获得如下的效果。
通过增加PC的含量，可以很容易地提纯PC。
通过增加除PC外的磷脂的含量，可以容易地提纯这些磷脂，以便可以研制所要求的具有新特性的表面活性剂和乳化剂等物质。
可以研制所要求的具有不同消化和吸收特性的药物的包裹膜。
2.在需要从油中除去磷脂的情况下，所要求的是通过改变磷脂的组成，可以容易地除去磷脂。
3.在使用含磷脂的油的情况下，可以通过改变磷脂的组成而获得下面的效果从这些普通的油中可以研制所要求的具有不同物理特性(优选地是粘度，味觉和舌头的触觉等)的油。
通过降低使油变褐色的PE的含量，可以研制所要求的难以变成褐色的油。
4.通过改变作为生物膜主要组分的磷脂的组成，可以改变所要求的生物膜的特性(温度敏感性和抗干燥性等)。
另外，所要求的是改变磷脂的组成可以对生物膜的代谢产生影响，以便减缓或加速老化。
实施例现在，本发明将通过实施例进行更详细的描述。应该注意的是本发明不受下面这些实施例的限制。实施例1构建用于转化的质粒采用在WO95/09234中描述的含有大米PLD基因(在下面的序列表中在SEQ ID 1号中表明其核苷酸序列)的pBluescript质粒(从Stratagene购得，在WO95/09234中描述了含有大米PLD基因的pBluescript质粒)作为模板，并且采用在其末端具有SacI和XbaI识别位点的引物，它所具有的核苷酸序列为5’-GCAGGAGCTCTAGAGGGATGACAGGACTTCAGTTGGT-3’和在其末端具有BamHI和EcoRI识别位点的引物，它所具有的核苷酸序列为5’-GGGAATTCGGATCCGCTTCTGGTTGTTCTTCAGGC-3’，通过常规方法用市售的试验盒进行PCR。采用这些引物扩增的区域是在下面所列序列表中的SEQ ID 1号中所示的核苷酸序列中的1008nt至2115nt的区域。用Bam HI和Sac I消化含有部分(1108bp)PLD基因的PCR产物，并且将生成物插入到pBI221质粒(从Toyobo处购得)中，通过Bam HI和Sac I从质粒中除去葡萄苷酸酶基因。通过上面描述的方法，得到在35S启动子的反义方向下游插入部分PLD基因的质粒(pB35P)。实施例2通过电穿孔法将基因引入大米中用70％乙醇灭菌Japonica大米品种“Tsukinohikari”的未成熟种子的表面30秒，然后用1％次氯酸钠溶液灭菌40分钟，接着用消毒水将种子冲洗三次。将种子放置在2N6固体培养基中，并在暗处在30℃下培养。将从未成熟种子的小盾片中去分化的愈伤组织分培到N6液体培养基上，并将生成物在25℃下，在旋转摇动器(125rpm)中培养。每周将培养的细胞分培到新鲜的培养基上。
将从开始分培第3天的细胞悬浮在酶溶液中，所述酶溶液含有1.0％纤维素酶(cellulase)Onozuka RS(Yakult Honsha有限公司)，1.0％MacerozymeR10(Yakult Honsha有限公司)0.1％溶果胶酶(Pectolyase)Y-23(SeishinSeiyaku)，0.5％Dricellase(Kyowa Hakko)和0.4M甘露糖醇，并将悬浮液在30℃下在暗处培育3小时。然后通过20μm尼龙目筛过滤所述细胞悬浮液，将所得到的滤液在50×g下离心分离5分钟。使所得到的原生质体的沉淀物悬浮在0.4M甘露糖醇中，用该溶液冲洗该原生质体两次。将所得到的原生质体悬浮在EPAA缓冲液中(Tada Y.，Sakamoto M.，Fujimura T.(1990)，通过电穿孔和转基因植物的分析将高效基因引入大米中使用无氯离子的电穿孔缓冲液。Theor.Appl.Genet.80475-180)，以使群体密度为2×106细胞/ml，将悬浮液放置在冰上5分钟。向原生质体悬浮液中加入10μg pGL2质粒(BilangR.，Iida S.，Peterhans A.，Potrykus I.，Paszkowski J.(1991)抗潮酶素B基因的3’-末端区域对于大肠杆菌和烟草，(Nicotiana tabacum)中的活性来说是重要的。基因100247-250)和30μg通过Eco RI线性化的pB35P质粒，并采用电穿孔装置(Bio-Rad，USA)向悬浮液施加250μF，600V/cm的电脉冲。将经脉冲处理的原生质体放置在冰上15分钟，然后在室温下放置30分钟。通过离心分离收集原生质体，并将它们悬浮在含有1.25％Seeplaque(商品名)琼脂糖(FMC)的R2-1培育基中，以使细胞群体为3×105细胞/ml。然后将悬浮液以小液滴的形式固化在9cm培育皿上。在进行培育时，加入R2-1培养基和大米Oc细胞(Baba A，Hasezawa S，Shono K通过农杆菌属原生质体介导的大米原生质体的培养和其转化，(《植物细胞生理学》(Pant Cell Physiol.)27463-471(1986))并在25℃下在暗处培养生成物。
两周后，除去液体培养基和Oc细胞，加入R2-t培养基，接着在25℃，在照明的条件下进行培养。一周后，将培养基换成含有40mg/l潮酶素的R2-t培养基并继续进行培养。一周后，将直径为约0.2-0.5mm含愈伤组织的琼脂糖液滴与少量的消毒水一起破裂，将生成物放置在含有40mg/l潮酶素的N6-12培养基中，接着在25℃，在继续照明的条件下进行培养。当愈伤组织生长到直径大于2mm时，将愈伤组织移植到含有40mg/l潮酶素的N6S3培养基中，再继续进行培养。将生长高度不低于约10cm的分化植物移植到盆中，在温室中培养。所使用的培养基和参考文献如下培养基的组成2N6培养基(pH5.8)N6基本培养基(Chu 1978)酪蛋白氨基酸 1000mg/ml2，4-D2.0mg/ml蔗糖 20000mg/mlGelrite 2000mg/mlN6液体培养基(pH5.8)N6基本培养基酪蛋白氨基酸 300mg/ml2，4-D1.0mg/ml蔗糖 30000mg/mlR2-1培养基(pH5.8)R2无机盐培养基(Ohira等人，1973)MS维生素培养基(Murashige和Skoog1962)酪蛋白氨基酸 1000mg/ml2，4-D 1.0mg/ml
棓酸正丙酯0.05mg/ml蔗糖 68500mg/ml葡萄糖36000mg/mlR2-t培养基(pH5.8)R2无机盐培养基MS有机组分培养基酪蛋白氨基酸 1000mg/l2，4-D1.0mg/ml蔗糖 20000mg/ml葡萄糖10000mg/mlN6 12培养基(pH5.8)N6基本培养基酪蛋白氨基酸 2000mg/ml2，4-D0.2mg/ml6-BA 0.5mg/mlABA 5.0mg/ml蔗糖 20000mg/mlD-山梨糖醇30000mg/mlGelrite 2000mg/mlN6S3培养基半浓度的N6主要盐培养基N6少盐培养基N6维生素培养基AA氨基酸培养基(Toriyama和Hinata1985)酪蛋白氨基酸 1000mg/mlNAA 0.2mg/ml激动素1.0mg/ml蔗糖 20000mg/mlgelrite 3000mg/ml参考文献Chu，C.-C.(1978)N6培养基和其在谷类作物的花药(an ther)培养中的应用。在植物组织培养物进展论文集。PekingScience Press，第43-50页，Murashige，T.and Skoog，F.(1962)用于快速生长的修改培养基和用烟草组织培养物进行的生物测定。《生理学植物》(Physiol.Plant.)15第473-497页.Ohira，K，Ojima，K.和Fujiwara，A.(1973)对大米细胞培养物的营养研究I。用于在悬浮液培养物中快速生长的一种简单的限定培养基。《植物细胞生理学》141113-1121.Toriyama，K.，Hinata，K.和Sasaki，T.(1986)由大米中花药(an ther)愈伤组织的原生质体再生单倍体和双倍体植物。Theor.Genet.7316-19.实施例3通过Southern分析证实引入的基因和通过Western分析证实反义基因的作用用转化大米的结果5的叶片制备DNAs并进行Southern分析[Hiei Y.，Ohta S.，Komari T.，Kumashiro T.(1994)由农杆菌属介导的大米(Oryza sativa)的高效转化和T-DNA的边界的序列分析，植物(Plant)J.6271-282]。用Eco RI消化DNAs。采用通过pBluescript质粒消化得到的具有大小为984bp的cDNA片段制备探针，所述质粒通过HincII作为模板而含有上面第1部分中所描述的PLD基因。
在得自非转化植物的DNAs中，只检测到8.1kb片段，而在得自转化植物的DNAs中，对于全部的转化体来说，检测到新的片段。
用液氮冷冻各转化体的叶片(0.2g)，用研钵粉磨生成物，接着用0.4ml50mM三羟甲基氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)(pH7.0)萃取可溶性蛋白质。在10000×g，4℃下离心分离10分钟后，回收上清液，将其15μl的等分部分进行Western分析[Burnette W.N.(1981)Western blotting将蛋白质由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳转移到未修饰的硝基纤维素，并用抗体和放射性碘蛋白质A进行的射线照相检测。《分析生物化学》112l95-203]。聚丙烯酰胺凝胶的浓度为7.5％。使抗体[Ueki J.，Morioka S.，Komari T.，Kumashiro T.(1995)由大米(Oryza sativa L.)产生的磷脂酶D(PLD)的提纯和表征并用于由大米和玉米(Zea may L.)的PLD的cDNA的克隆《植物细胞生理学》36903-914]在8.9ug/ml IgG的浓度下反应。
在这些转化体中，在一个个体(下文也称之为“SAP8”)中，未检测到PLD蛋白质，因此观察到反义基因的作用。在SAP8的Southern分析中，除了检测到8.1kb片段外，还检测到两个大的片段。实施例4 制备由转化大米种子的未成熟胚胎所产生的培养细胞的悬浮液随机选择16个转化大米(SAP8)所结的种子，制备用各个种子的未成熟胚胎产生的培养细胞的悬浮液。根据实施例2描述的方法，每周将悬浮液培养物分培到新鲜的N6液体培养基上。
按照实施例3描述的方法，在开始分培的第6天从培养细胞中萃取蛋白质，并对萃取的蛋白质进行Western分析。结果有被检测到PLD的培养细胞和未被检测到PLD的培养细胞存在。这些类型的细胞的比例为1∶3。在检测到PLD的培养细胞中，仅检测到8.1kb片段，而在未检测到PLD的培养细胞中，除了检测到8.1kb片段，还检测到两个大的片段。这些结果表明引入的基因是两个复制品，这两个复制品的基因是以彼此接近的位点存在，所述基因在其后的SAP8产生中被分离。在检测到PLD的培养细胞和未检测到PLD的培养细胞之间观察到其增殖速率和外观都没有差别。实施例5 萃取磷脂并分析其组成根据参考文献描述的方法[Satou N.，Okuyama H.(1987)植物膜脂质、蛋白质，核酸和酶的分析，Extra Edition，No.30163-170]，将开始进行分培第6天的培养细胞(0.5g)放置在内部体积为1.5ml的聚丙烯管中，并紧密地盖好管子。将管子浸渍在沸水中热处理5分钟，然后用溶剂萃取脂质。从回收的脂质中蒸发掉溶剂，并将脂质溶解在0.5ml氯仿∶甲醇(2∶1)中。在用于薄层色谱的硅胶60色谱板(Merck)上，点滴20μl的等分溶液，并用氯仿∶甲醇∶乙酸∶水(25∶15∶4∶2)展开斑点。将茚三酮(由Wako Pure化学有限公司购得)喷雾到干燥板上，将制成的板在120℃下加热5分钟。根据试验盒中的标准磷脂(从Funakoshi购得)的迁移率，鉴定各斑点的磷脂。注意用茚三酮检测的磷脂PE和PS，确定各培养细胞中PE和PS含量的比例。采用光密度计(型号GS670，Bio Rad)进行定量分析，用上述标准的磷脂绘制校正曲线。
对于检测到PLD的培养细胞而言，PS/PE比为3.5+/-0.2％，而对于未检测到PLD的培养细胞而言，PS/PE比为5.3+/-0.3％。这些结果表明在培养细胞中引入反义基因可以改变PS含量与PE含量的相对比例。序列表序列ID号1序列长度3040序列类型核酸分子类型cDNA-mRNA起始源生物体Orysa sativa链型双键拓扑结构线型序列描述AGTCTCTCTT CTCCCGCAAT TTTATAATCT CGATCGATCC AATCTGCTCC CCTTCTTCTT 60CTACTCTCCC CATCTCGGCT CTCGCCATCG CCATCCTCCT CTCCCTTCCC GGAGAAGACG 120CCTCCCTCCG CCGATCACCA CCCGGTAGGG CGAGGAGGGA GCCAAATCCA AATCAGCAGC 180C ATG GCG CAG ATG CTG CTC CAT GGG ACG CTG CAC GCC ACC ATC TTC GAG 229Met Ala Gln Met Leu Leu His Gly Thr Leu His Ala Thr Ile Phe Glu1 5 10 15GCG GCG TCG CTC TCC AAC CCG CAC CGC GCC AGC GGA AGC GCC CCC AAG277Ala Ala Ser Leu Ser Asn Pro His Arg Ala Ser Gly Ser Ala Pro Lys20 25 30TTC ATC CGC AAG TTT GTG GAG GGG ATT GAG GAC ACT GTG GGT GTC GGC325Phe Ile Arg Lys Phe Val Glu Gly Ile Glu Asp Thr Val Gly Val Gly35 40 45AAA GGC GCC ACC AAG GTG TAT TCT ACC ATT GAT CTG GAG AAA GCT CGT373Lys Gly Ala Thr Lys Val Tyr Ser Thr Ile Asp Leu Glu Lys Ala Arg50 55 60GTA GGG CGA ACT AGG ATG ATA ACC AAT GAG CCC ATC AAC CCT CGC TGG421Val Gly Arg Thr Arg Met Ile Thr Asn Glu Pro Ile Asn Pro Arg Trp65 70 75 80TAT GAG TCG TTC CAC ATC TAT TGC GCT CAT ATG GCT TCC AAT GTG ATC469Tyr Glu Ser Phe His Ile Tyr Cys Ala His Met Ala Ser Asn Val Ile85 90 95TTC ACT GTC AAG ATT GAT AAC CCT ATT GGG GCA ACG AAT ATT GGG AGG517Phe Thr Val Lys Ile Asp Asn Pro Ile Gly Ala Thr Asn Ile Gly Arg100 105 110GCT TAC CTG CCT GTC CAA GAG CTT CTC AAT GGA GAG GAG ATT GAC AGA565Ala Tyr Leu Pro Val Gln Glu Leu Leu Asn Gly Glu Glu Ile Asp Arg115 120 125TGG CTC GAT ATC TGT GAT AAT AAC CGC GAG TCT GTT GGT GAG AGC AAG613Trp Leu Asp Ile Cys Asp Asn Asn Arg Glu Ser Val Gly Glu Ser Lys130 135 140ATC CAT GTG AAG CTT CAG TAC TTC GAT GTT TCC AAG GAT CGC AAT TGG661Ile His Val Lys Leu Gln Tyr Phe Asp Val Ser Lys Asp Arg Asn Trp145 150 155 160GCG AGG GGT GTC CGC AGT ACC AAG TAT CCA GGT GTT CCT TAC ACC TTC709Ala Arg Gly Val Arg Ser Thr Lys Tyr Pro Gly Val Pro Tyr Thr Phe165 170 175TTC TCT CAG AGG CAA GGG TGC AAA GTT ACC TTG TAC CAA GAT GCT CAT757Phe Ser Gln Arg Gln Gly Cys Lys Val Thr Leu Tyr Gln Asp Ala His180 185 190GTC CCA GAC AAC TTC ATT CCA AAG ATT CCG CTT GCC GAT GGC AAG AAT805Val Pro Asp Asn Phe Ile Pro Lys Ile Pro Leu Ala Asp Gly Lys Asn195 200 205TAT GAA CCC CAC AGA TGC TGG GAG GAT ATC TTT GAT GCT ATA AGC AAT853Tyr Glu Pro His Arg Cys Trp Glu Asp Ile Phe Asp Ala Ile Ser Asn
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355 360 365TAT GAC ACT CAG TAC CAT TCT TTG TTT AGG ACA CTC GAC AGT ACC CAT 1333Tyr Asp Thr Gln Tyr His Ser Leu Phe Arg Thr Leu Asp Ser Thr His370 375 380CAT GAT GAC TTC CAC CAG CCA AAC TTT GCC ACT GCA TCA ATC AAA AAG 1381His Asp Asp Phe His Gln Pro Asn Phe Ala Thr Ala Ser Ile Lys Lys385 390 395 400GGT GGA CCT AGA GAG CCA TGG CAT GAT ATT CAC TCA CGG CTG GAA GGG 1429Gly Gly Pro Arg Glu Pro Trp His Asp Ile His Ser Arg Leu Glu Gly405 410 415CCA ATC GCA TGG GAT GTT CTT TAC AAT TTC GAG CAG AGA TGG AGA AAG 1477Pro Ile Ala Trp Asp Val Leu Tyr Asn Phe Glu Gln Arg Trp Arg Lys420 425 430CAG GGT GGT AAG GAT CTC CTT CTG CAG CTC AGG GAT CTG TCT GAC ACT 1525Gln Gly Gly Lys Asp Leu Leu Leu Gln Leu Arg Asp Leu Ser Asp Thr435 440 445ATT ATT CCA CCT TCT CCT GTT ATG TTT CCA GAG GAC AGA GAA ACA TGG 1573Ile Ile Pro Pro Ser Pro Val Met Phe Pro Glu Asp Arg Glu Thr Trp450 455460AAT GTT CAG CTA TTT AGA TCC ATT GAT GGT GGT GCT GCT TTT GGG TTC 1621Asn Val Gln Leu Phe Arg Ser Ile Asp Gly Gly Ala Ala Phe Gly Phe465 470 475 480CCT GAT ACC CCT GAG GAG GCT GCA AAA GCT GGG CTT GTA AGC GGA AAG 1669Pro Asp Thr Pro Glu Glu Ala Ala Lys Ala Gly Leu Val Ser Gly Lys485 490 495GAT CAA ATC ATT GAC AGG AGC ATC CAG GAT GCA TAC ATA CAT GCC ATC 1717Asp Gln Ile Ile Asp Arg Ser Ile Gln Asp Ala Tyr Ile His Ala Ile
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645 650 655AGG TTC ATG ATC TAT GTC CAC ACC AAA ATG ATG ATA GTT GAC GAT GAG 2197Arg Phe Met Ile Tyr Val His Thr Lys Met Met Ile Val Asp Asp Glu660 665 670TAC ATC ATC ATC GGT TCT GCA AAC ATC AAC CAG AGG TCG ATG GAC GGC 2245Tyr Ile Ile Ile Gly Ser Ala Asn Ile Asn Gln Arg Ser Met Asp Gly675 680 685GCT AGG GAC TCT GAG ATC GCC ATG GGC GGG TAC CAG CCA TAC CAT CTG 2293Ala Arg Asp Ser Glu Ile Ala Met Gly Gly Tyr Gln Pro Tyr His Leu690 695 700GCG ACC AGG CAA CCA GCC CGT GGC CAG ATC CAT GGC TTC CGG ATG GCG 2341Ala Thr Arg Gln Pro Ala Arg Gly Gln Ile His Gly Phe Arg Met Ala705 710 715 720CTG TGG TAC GAG CAC CTG GGA ATG CTG GAT GAT GTG TTC CAG CGC CCC 2389Leu Trp Tyr Glu His Leu Gly Met Leu Asp Asp Val Phe Gln Arg Pro725 730 735GAG AGC CTG GAG TGT GTG CAG AAG GTG AAC AGG ATC GCG GAG AAG TAC 2437Glu Ser Leu Glu Cys Val Gln Lys Val Asn Arg Ile Ala Glu Lys Tyr740 745 750TGG GAC ATG TAC TCC AGC GAC GAC CTC CAG CAG GAC CTC CCT GGC CAC 2485Trp Asp Met Tyr Ser Ser Asp Asp Leu Gln Gln Asp Leu Pro Gly His755 760 765CTC CTC AGC TAC CCC ATT GGC GTC GCC AGC GAT GGT GTG GTG ACT GAG 2533Leu Leu Ser Tyr Pro Ile Gly Val Ala Ser Asp Gly Val Val Thr Glu770 775 780CTG CCC GGG ATG GAG TAC TTT CCT GAC ACA CGG GCC CGC GTC CTC GGC 2581Leu Pro Gly Met Glu Tyr Phe Pro Asp Thr Arg Ala Arg Val Leu Gly785 790 795 800GCC AAG TCG GAT TAC ATG CCC CCC ATC CTC ACC TCA TAGACGAGGA AGCACT 2633Ala Lys Ser Asp Tyr Met Pro Pro Ile Leu Thr Ser805 810ACACTACAAT CTGCTGGCTT CTCCTGTCAG TCCTTCTGTA CTTCTTCAGT TTGGTGGCGA 2693GATGGTATGG CCGTTGTTCA GAATTTCTTC AGAATAGCAG TTGTTACAGT TGTGAATCAT 2753AAAGTAATAA GTGCAGTATC TGTGCATGGT TGAGTTGGGA AGAAGATCGG GGATGCAATG 2813ATGCTTGTGA AGTTGTGATG CCGTTTGTAA GATGGGAAGT TGGGAACTAC TAAGTAATTG 2873GCATGATTGT ACTTTGCACT ACTGTTTAGC GTTGTTGATA CTGGTTAACC GTGTGTTCAT 2933CTGAACTTGA TTCTTGATGC AGTTTGTGGC ATTACCAGTT TATCATCGTT CTTCAGGAAA 2993AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 3040
权利要求
1.改变由寄主细胞所产生的磷脂组成的方法，包括用重组体DNA转化所述的寄主细胞，所述重组体DNA具有磷脂酶D基因的反义基因，它在所述寄主细胞中表达反义基因，以产生在所述寄主细胞中和磷脂酶D基因的mRNA杂交的mRNA，由此抑制所述磷脂D基因的表达。
2.根据权利要求1的方法，其中，所述的寄主细胞是植物细胞。
3.根据权利要求2的方法，其中，所述的植物细胞是种子植物的细胞。
4.根据权利要求3的方法，其中，所述的种子植物细胞是单子叶植物的细胞。
5.根据权利要求4的方法，其中，所述的单子叶植物细胞是大米细胞。
6.根据权利要求1-5任一项的方法，其中，所述的磷脂酶D基因的反义基因是在寄主细胞内的磷脂酶D基因的反义基因。
7.具有磷脂酶D基因的反义基因的重组体DNA，其中，它在寄主细胞内表达反义基因，以产生在所述寄主细胞中和磷脂酶D基因的mRNA杂交的mRNA，由此抑制所述磷脂D基因的表达。
8.根据权利要求7的重组体DNA，其中，所述的寄主细胞是植物细胞。
9.根据权利要求8的方法，其中所述的植物细胞是种子植物的细胞。
全文摘要
本发明公开了人工改变由细胞产生的磷脂组成的方法。根据本发明的方法,用重组体DNA转化所述的寄主细胞,所述重组体DNA具有磷脂酶D基因的反义基因,它在所述寄主细胞中表达反义基因,以产生在所述寄主细胞中和磷脂酶D基因的mRNA杂交的mRNA,由此抑制所述磷脂D基因的表达。
文档编号C12N9/16GK1188507SQ9719033
公开日1998年7月22日 申请日期1997年2月20日 优先权日1997年2月20日
发明者植木润, 森冈真二 申请人:日本烟草产业株式会社