专利名称：无限增殖化细胞的方法
技术领域：
本发明涉及细胞无限增殖化领域以及细胞作为病毒繁殖和重组蛋白质表达的储存库的用途。具体地讲，本发明涉及诱导型启动子控制下的蛋白质p53生产无限增殖化细胞的用途。
背景技术：
用于生产鸟类和动物疫苗的许多鸟类病毒在胚胎化的鸡卵或原代鸡成纤维细胞培养物中进行繁殖。使用这些鸡的底物生产的动物疫苗的实例包括用于狗的Canine Distemper，用于火鸡的Marek’s病疫苗，呼肠孤病毒，禽痘病毒(Fowl Pox)以及用于家禽的感染性Bursal病疫苗。原代细胞培养物可以是各种各样的且存在着受内源性病毒、支原体及类似物的污染的危险。从中获取原代细胞培养物的动物组织的来源常常是有限的并由于需要保持动物原种处于无病原状态而价格昂贵。
需要开发一种可再现的方法，以产生适用于动物疫苗产品生产的无病毒的无限增殖化鸟类细胞底物。充分地研究了特征的无限增殖化(即，传代)细胞系的可用性具有限制或减少对原代动物组织培养物的依赖性的益处，而原代动物组织培养物从质量观点出发是不易控制的。在疫苗工业中，有关产品安全性，一致性和效价方面的规章的要求正促使公司寻求细胞系作为现行实践中使用卵为基础和原代细胞疫苗之底物的最佳替代物。疫苗生产公司必须先规定用于病毒生产的一致的细胞系以满足容许所述公司传播其疫苗的规章要求。在美国和国外，人和动物疫苗产品的生产厂家均必须证明其疫苗底物是无污染的。用于产生从原代组织获得的传代动物细胞系的可再现方法的出现将使生物制品生产厂家更好地控制生产过程并提高产品的安全性和一致性，同时最终降低成本。
发明概述本发明涉及转化细胞的方法和通过将金属硫蛋白启动子控制下的编码p53的核酸导入所述细胞并通过筛选有无限增殖化特征的细胞而产生的细胞。
在本发明的一个方面，公开一种转化原代非啮齿类动物细胞的方法，其步骤包括在一个能指导p53表达的基因载体中定位编码金属硫蛋白启动子控制下的p53之核酸；将所述基因载体引入原代非啮齿类动物细胞；和筛选群体倍增时间为每天约0.6到1.5倍的细胞灶，其中所述细胞呈反转录酶阴性并是非致瘤性的。在一个实施方案中，原代非啮齿类动物细胞是源于鸟类的，而另一实施方案中所述原代非啮齿类动物细胞是源于人类的。在本发明中使用的原代细胞可源于多种组织，而在优选实施方案中所述细胞从皮肤组织，胸肌组织和/或心肌组织获得。
在本发明的另一方面，公开了细胞。这些细胞是含有在金属硫蛋白启动子控制下能表达p53之基因载体的无限增殖化成纤维细胞。在一个实施方案中，所述细胞是源于鸟类的。
本发明还涉及繁殖病毒的方法，包括步骤用一种无限增殖化细胞培养物的至少一个细胞接触至少一种感染性病毒颗粒，其中所述培养物的细胞含能在金属硫蛋白启动子控制下指导p53表达的基因载体；和收集由所述细胞产生的病毒。在一个实施方案中，所述病毒是呼肠孤病毒，在另一个实施方案中，所述病毒是HVT，而在第三个实施方案中，所述病毒是禽痘病毒。
在本发明的另一方面，公开了繁殖病毒的方法，包括步骤用原代细胞接触至少一种感染性病毒颗粒；在细胞培养中，将原代细胞和含有处于金属硫蛋白启动子控制下表达p53的基因载体的无限增殖化细胞一起培养；以及从细胞培养物中收集病毒。
本发明还涉及含金属硫蛋白启动子控制下的p53并含能在细胞中指导重组蛋白质表达的至少一种载体的无限增殖化，非转化细胞。在一个实施方案中，所述细胞表达重组蛋白质，而在另一实施方案中，所述载体编码一种病毒的至少一部分。还有一种实施方案中，所述载体是逆转录病毒载体。
附图简述
图1是本发明的一个优选实施方案中使用的载体pJFNⅡ的示意图。
图2是本发明的一个优选实施方案中使用的载体pJFNⅡcMTD的示意图。
发明详述目前需要一种可重复地无限增殖化原代细胞和产生传代细胞系的方法。产生支持病毒复制的充分研究了特征的细胞系的技术开发将使公司省去重复生产原代细胞的时间并避免了与污染和两批卵之间存在的不一致性有关的问题。针对病毒繁殖所限定的无限增殖化细胞系降低了与终产品的质量控制测试相关的成本。
本发明公开了使用诱导型金属硫蛋白启动子控制下的重组p53对原代非啮齿类动物细胞，具体地讲是鸟类和人类细胞的无限增殖化。所述细胞用于培养病毒原种，用于表达病毒蛋白质和作为包装细胞系产生重组病毒。
原代细胞培养物最常获得自从完整组织中新分离的细胞。这些细胞常常是无病毒材料的良好来源并且非常适合作为病毒复制的宿主细胞。原代细胞在病毒复制时不总是有效的，而且原代动物细胞在培养中呈现有限的寿命，最终会衰老。衰老时，细胞停止分裂并在一定时间内死亡。培养中细胞的分裂能力取决于几个参数，包括细胞来源的品种和组织处于培养中的时间。经历衰老的细胞不能长期在培养中维持，因而是病毒原种繁殖的非再生性宿主。原代细胞在达到衰老前一般经过23-26代。本发明的细胞优选在约第2代到第4代间用p53转染。
如本发明通篇所使用的无限增殖化细胞是指能在培养中生长超过25代的细胞。无限增殖化细胞不同于转化细胞，因为，与转化细胞不同，无限增殖化细胞呈现出密度依赖型的生长制约并保持一种正常的形态。与无限增殖化细胞相反，转化细胞能在软琼脂中生长并在注射给实验动物时常能形成肿瘤。
通过将诱导型金属硫蛋白启动子控制下的p53引入优选的原代细胞使本发明的细胞无限增殖化。一部分由于p53基因中的突变以某种方式导致所有的人类癌症上升50％的事实，因此细胞核癌基因p53是研究的最充分的肿瘤抑制基因之一(Levine等，自然351:453-456,1991)。p53是一种细胞的磷蛋白并常在转化细胞中呈现上升的水平(De Leo,A.B.等，Pro.Natl.Acad.Sci 76:2420-2424,1979)。野生型p53似乎在生长抑制方式中起作用(Michalovity等，细胞62:671-680,1990)并且p53使细胞停留在细胞周期的对DNA损伤反应的关卡(Kastan等，癌症研究51:6304-6311,1991)。该关卡功能通过p53的积累和随后的GADD45(一种重要的剪接修复蛋白质)，WAF1(p21)，和MDM2(其与p53形成一种稳定的复合物)基因的诱导来实现。(Kastan，等，细胞71:587-597,1992)。这个理论得到了对p53中的突变能导致细胞无限增殖化的观察的支持。
数篇报道通过一种普遍存在的细胞周期蛋白激酶抑制因子(即，Cipl,E1-Deiry等，细胞75:817-825,1993由Harper等在细胞75:805-816,1993报道的WAF1)将野生型p53分子与细胞分裂的抑制作用联系起来。实验显示p53蛋白质刺激产生另一种蛋白质p21，它在正常细胞中与一种四元复合物有关，其中包括细胞周期蛋白依赖型激酶，细胞周期蛋白，增殖细胞核抗原(PCNA)和p21。在转化细胞中，p53功能的丧失似乎是由于突变导致p21和来自多蛋白复合物的PCNA丢失的原因，从而导致没有控制的生长。
当将p53中的突变与细胞增殖的调节联系起来时，存在其他的理论，这些理论推断了p53调节细胞增殖的其他途径。(Milner，等CellBiol.Int.Rep.4:663-667,1980,Milner等112:785-788,1981,Mercer等Proc.Natl Acad.Sci.79:6309-6312,1982和Mercer等分子细胞生物学4:276-281,1984)。例如，p53基因中的突变可能与使细胞不能修复细胞周期临界点时由于生理和物理因素，如紧张，老化，离子辐射或接触致癌物而发生的损伤有关。
本领域人员已知p53用来调节细胞的增殖。有一些非突变的大鼠p53能无限增殖化啮齿类动物细胞的证据。Jenkins等证明了只有在使用来自致癌病毒、如劳氏肉瘤病毒(RSV)和猴病毒40(SV40)的组成型启动子时，大鼠软骨细胞才无限增殖化(Jenkins等自然317:816-818,1985)。Eliyahu等(自然312:646-649,1984)和Parada等(自然312:649-651,1984)也能无限增殖化大鼠细胞，但他们的数据与Jenkins等相矛盾并且证明了在单独转染p53基因时，p53构建体不能无限增殖化细胞，但用癌基因ras共转染所述细胞时p53构建体产生转化灶。当这些细胞具有转化细胞的特征时，所述细胞在转化后相对短的时间内经过衰老并停止增殖。
与Jenkins,Eliyahu，和Parada(上述全部)不同，Rovinski和Benchimol(癌基因2:445-452,1988)用在其内源启动子控制下的大鼠p53证明了大鼠胚胎成纤维细胞的无限增殖化。Rovinski公布的结果可通过其他研究得到解释，这些研究表明人们知道大鼠细胞易于进行无限增殖化和转化。所述细胞被认为是以某种方式引发的以至它们对无限增殖化和转化刺激特别敏感。研究已经重复地证实了啮齿类成纤维细胞以高频率自发地进行无限增殖化(Ponten,.J.Virol.Monogr.8:1,1971；Ponten J.,Biochim,Biophys.Acta 458:397,1976；Todaro和Green细胞生物学杂志17:299-313,1963；Meek等，Exp.Cell Res.107:277-284,1977和Curatolo，等In Vitro 20:597-601,1984)。的确，Rovinski和Bechimol(上述446页)注意到他们的大鼠胚胎成纤维细胞对照物是单独用一种表达标记转染的并具有约10％的自发的无限增殖化频率。相反，《科学》中的一篇综述和其他研究表明不存在来自正常供体的人或鸡成纤细胞自发地无限增殖化的报道(Smith等科学273:63-67,1996,Hayflick,Exp.Cell Res.37:614-636,1965和Smith等，癌症研究进展54:63-77,1990)。况且，大鼠细胞携带各种各样的内源性病毒，特别是使其与商业疫苗生产不适应的逆转录病毒。
从各种哺乳动物已经分离出大量的p53基因。例如鸡p53的序列(SEQ ID NO:1)可从GenBank的登记号X13057获得和从Soussi等的文献中得到(核酸研究16(23):11383,1988)。正常人p53的序列可从GenBank的登记号W88747和HSP53G获得并且通过华盛顿大学药学院公众可得到该克隆。人p53基因还以GenBank的登记号M22881-M22884,M22887-M22888 M22894-M33898作为外显子1-11被提供，并由Buchman等发表(基因70(2):245-252,1988)。马的p53可从GenBank的登记号U37120获得，而非洲绿猴的p53从GenBank的登记号X16384获得。罗猴p53可从GenBank的登记号L20442获得，家牛p53从X81704(还参见Dequiedt F等，DNA序列5(4):261-64,1995)，而猫p53从GenBank的登记号D26608(Okuda M.等Int.J.Cancer 58(4):602-7,1994)获得。其他序列以及参考使用这些序列的出版物可从如GenBank及类似的许多基因数据库中获得。熟悉本领域的人将能容易地找到所述文献或基因数据库以获得本领域熟知的p53基因序列。
金属硫蛋白启动子具有多个金属结合区，并且由金属硫蛋白启动子调节的基因表达可由Cd++,Cu++和Zn++诱导。该启动子含多个金属调节因子和转录因子的多元潜在的结合位点，包括SPI和MLTF。在启动子区内的金属效应元件和该启动子中其他识别区域由Mueller等(基因与开发4:412-426,1988)和Lee等(自然325:368-372,1987)进行了详细的讨论。
与编码p53的基因类似，有许多本领域已知的来自各个物种的金属硫蛋白基因。例如鸡的金属硫蛋白启动子序列(SEQ ID NO:2)可从Fernando等的文献中得到(基因8:177-183,1989)。根据公开的所述金属硫蛋白启动子的特征(上述Mueller等和上述Lee等)从本领域可以得到的许多公布的金属硫蛋白基因序列的所述金属硫蛋白基因序列中可鉴别所述启动子区。人金属硫蛋白启动子基因的序列可从GenBankW68639,X65607,V00594获得(还参见Stennard等Biochim.Biophys.Acta1218(3):357-365,1994；Richards等，细胞37(1):263-272,1984和Karin等，核酸研究10(10):3165-3173,1982)。绵羊的金属硫蛋白启动子可从GenBank的登记号X04626获得(参见Peterson等，欧洲生物化学杂志，160(3):579-585,1986)。其他序列以及参考使用所述序列的出版物可从如GenBank,GenEMBL，和类似的许多基因数据库中获得。熟悉本领域的人将能容易地找到所述文献或基因数据库以得到本领域熟知的有关金属硫蛋白启动子的基因序列。
通过将编码p53的核酸引入细胞使本发明的细胞无限增殖化，其中编码p53的核酸处于金属硫蛋白启动子的控制下，即把该金属硫蛋白启动子可操作地连接到编码p53的核酸上。在本发明的一个优选实施方案中，金属硫蛋白启动子控制下的p53由一表达载体被引入所述细胞中。有各种市售表达载体可用，且熟悉本领域的人将易于认识到许多种载体可用于在非啮齿类动物细胞中表达p53。表达载体还可包括各种其他特征，这些特征促进了载体在原核细胞中的复制，选择载体，整合其他基因序列或通过添加其他调节序列来促进基因的表达。这些特征的实例包括，但不限于细菌复制起点的内含物，赋予抗生素抗性的基因，其他选择性标记，其中包括但不限于β半乳糖苷酶，荧光素酶，或类似物，增强子序列，多克隆位点等。
实施例1详细描述了金属硫蛋白启动子和p53基因的鉴别以及将所述启动子与p53插入到表达载体中。金属硫蛋白启动子与p53基因优选来自同一物种。把金属硫蛋白启动子控制下的p53构建体引入细胞。所述细胞优选原代细胞，并且如本公开文本中所使用的，原代细胞优选已培养1-10代和/或不超过2个月的细胞。
原代细胞一般其特征为在培养中有有限生长能力的细胞。原代细胞是从完整组织分离并置于培养中的那些细胞。所述细胞可从哺乳动物的各个品种的许多组织获得。人的活检组织，来自狗、马、猪、鸡、牛的组织样品，胚胎组织等可被绞碎，用胰蛋白酶消化并分离为悬浮液中的单细胞或作为单层培养物或小的(但完整的)组织样品用于转染。分离的适合于转染的细胞包括成纤维细胞，肌细胞，上皮细胞，内皮细胞和其他细胞。熟悉本领域的人将认识到有许多熟知的从各种组织样品中得到和分离各种细胞的方法，并认识到可以不经过过多的试验来实施这些方法。实施例2公开了用于从鸡胚组织分离细胞的方法，也包括从皮肤，心肌和胸肌分离细胞的方法。
在本领域中已知有许多方法用于将能指导核酸序列表达的载体引入细胞或将核酸片段引入细胞。这些方法包括，但不限于，磷酸钙沉淀法，电穿孔法，脂质转染技术，多胺转染技术和病毒颗粒转染技术。实施例3提供使用脂质转染胺将本发明的p53/金属硫蛋白核酸片段引入真核细胞的方法。有各种市售试剂盒可用，它们使用各种方法使核酸片段结合到真核细胞中。因此，引入金属硫蛋白启动子控制下的编码p53的核酸之方法不应有损于本发明的范围。
转染后，在选择性生长压力下培养和扩展本发明之细胞，若有必要，鉴定含转染的核酸片段的克隆。用必需使用的阳离子处理细胞以促进金属硫蛋白启动子表达。实施例3使用硫酸锌以诱导金属硫蛋白启动子。挑选细胞灶并使其在培养中生长。术语“细胞灶”指有不同于周围细胞的特征的细胞群。在本发明中，被金属硫蛋白启动子控制下的编码p53的核酸片段无限增殖化的细胞比其周围没有无限增殖化的细胞生长的更快。无限增殖化的细胞生长的更快并在原代培养物的单层上形成集落。使用克隆环可分离所述集落并使其在培养中扩展。
当将含p53/金属硫蛋白的构建体引入所述细胞后约经25代组织培养时，和当所述细胞以每天至少约0.6倍进行群体倍增并优选以每天约0.6到1.5倍进行群体倍增时，则认为所述细胞被无限增殖化。所述细胞维持一种正常的形态并呈现密度依赖型和/或接触抑制型生长。通过本发明方法分析了来自鸡胚三种组织的细胞的无限增殖化能力。从如实施例5中提供的心肌细胞，胸肌细胞和皮肤细胞鉴定出许多克隆。
应该检测本发明的无限增殖化细胞的病毒污染物以及其他组织培养污染物，如低水平的细菌污染物，支原体及类似物。可检测所述细胞的逆转录病毒感染，禽流感病毒(A型)，禽呼肠孤病毒，禽腺病毒(Ⅰ-Ⅲ类群)，禽脑脊髓炎病毒，禽痘病毒，新城疫病毒，副粘病毒(2型)，以及支原体，沙门氏菌和其他污染物(如在9C.F.R.§113及其细目所列污染物)的证据。
用聚合酶链反应检测所述细胞的大范围的病毒污染物以鉴定污染的核酸片段。有各种针对各种各样病毒的市售可得的检测试剂盒，可用于测定是否本发明细胞含污染病毒。同样，有检测病毒抗原的市售检测，其中抗原来自各种不同的病毒。这些检测包括ELISA测定，免疫荧光测定等。所有这些测定是众所周知的并涉及常规实验技术。实施例4提供一种测定本发明细胞是否呈逆转录酶阴性的方法。在含金属硫蛋白启动子控制下的p53之无限增殖化细胞中逆转录酶活性的证据是逆转录病毒污染的证据。
还检测所述细胞的致瘤的潜力。本发明细胞优选是不致瘤的。测定细胞群是否是致瘤的测试在本领域中是已知的。实施例6提供评定本发明的无限增殖化细胞在软琼脂中的生长的方法，而实施例7提供将本发明细胞引入对本发明细胞来说是优选品种之动物的方法，以测定是否本发明细胞能诱导受体动物中的肿瘤。为测试含编码金属硫蛋白启动子控制下的p53之核酸的人类细胞的致瘤潜力，可测试所述细胞在软琼脂中的生长和测试所述细胞在裸鼠中或鼠或其他有重建的人免疫系统之实验动物中的生长。
在本发明的一个方面，所述细胞可用于繁殖病毒。如实施例8中所证明的，本发明细胞支持呼肠孤病毒感染，火鸡疱疹病毒(HVT)和马立克氏病病毒。从鸡组织得到的本发明细胞还可用做感染性Bursal病病毒，感染性支气管炎病毒，新城疫病毒，感染性喉头气管炎病毒，包括Ⅲ型腺病毒在内的各种腺病毒，Circodnavirideae，鸡HSV，禽痘病毒及其他病毒的宿主。许多人和动物病毒在含胚卵中生长，其中包括，但不限于，狂犬病病毒，犬细球病毒，猫白血球泛减症病毒，嵌杯样病毒，肝炎病毒，流感病毒，水痘带状疱疹病毒以及其他病毒的宿主。还可检测这些病毒在本发明无限增殖化细胞中的生长能力。
为生产病毒原种，可将所述本发明细胞接种到组织培养烧瓶，滚瓶，旋转培养或中空纤维反应器中。为滚瓶中病毒的繁殖，按约2-5×104细胞/平方厘米表面积接种所述细胞。启动病毒原种生长的感染复数(感染性病毒颗粒与细胞的比例)将根据毒株而有所不同。熟悉病毒学领域以及熟悉具体病毒生长和病毒株的人无须过多实验即能通过标准地控制感染复数，温度，培养基的变化等使病毒原种产率最大化。
感染后收获病毒以取得感染病毒原种的方法还随病毒株而不同。被膜病毒比无被膜病毒更慢地释放到培养基中。病毒原种可仅从所述培养基获得或从用条件培养基汇集的细胞裂解物获得。对裂解病毒来说(在病毒释放期间它们足以裂解一个细胞)，在轻微的离心步骤以除去细胞碎片后收获所述条件培养基(例如含病毒的余下的培养基)就足够了。而且，收获并保存来自大范围病毒株之病毒的方法是本领域所熟知的。
本领域众所周知的还有从细胞培养物中定量病毒生长的各种方法。例如，对疱疹病毒科的成员以及对在细胞单层表面上产生细胞病理学上的细胞灶的各种病毒的病毒原种滴度通过噬菌斑测定(如噬菌斑形成单位/毫升培养液或如噬菌斑形成单位/疫苗接种物的病毒定量的剂量)或以组织培养感染剂量-50(TCID50)而容易地被定量。通过TCID50更好地定量了快速裂解病毒，其中TCID50为在一定时间内，能感染50％的所述培养物的病毒原种的剂量或稀释度。培养和定量病毒的方法在本领域中是众所周知的，而指导病毒定量方法的资料来源在Fields等(eds.)基础病毒学1991,Raven出版社，纽约或在Mandell等(eds.)传染病的原理与实践，1985,John Wiley & Sons，纽约中可找到。
本发明的细胞也可以用来生产重组蛋白质，包括病毒蛋白质及类似物。将编码重组蛋白质的核酸插入到能指导蛋白质在真核细胞(如本发明的无限增殖化细胞)中表达的调节元件控制下的核酸载体的方法是本领域众所周知的。表达载体是能指导重组蛋白质表达的可复制的核酸片段。通过杂志出版物和供应商，许多表达载体，包括逆转录病毒载体在本领域中是可用的。可复制表达载体成分一般包括，但不限于下述一种或多种成分复制起点，一个或多个标记基因，增强子元件，启动子元件，任选的信号序列和转录终止序列。所述选择或标记基因编码起识别被转化或被转染细胞群作用的蛋白质。典型的选择基因编码提供对抗生素或其他毒素的抗性，补充营养缺陷型或提供复合培养基所没有的关键营养成分的蛋白质。
把含编码重组蛋白质的核酸之表达载体转染到所述细胞中并用来指导在本发明无限增殖化细胞中重组蛋白质的表达。所述载体优选可编码任何能在鸡胚成纤维细胞中表达的重组蛋白质，其中包括但不限于病毒蛋白质，包括逆转录酶和/或病毒结构蛋白质。在细胞中产生重组蛋白质的载体的实例包括产生肿瘤抑制蛋白或病毒结构蛋白质[如Givol等癌基因11(12):2609-2618,1995,Givol等细胞生长与分化5(4):419-429,1994,Akiyama等病毒学203(2):211-220,1994和Boyer，等癌基因20:457-66,1993公开的那些病毒结构蛋白质]的逆转录病毒载体。
本发明的细胞可用做表达重组病毒(包括但不限于重组逆转录病毒)的培养基。本发明的细胞可用做对基因治疗等有用的遗传工程病毒的包装细胞系。使用具体的细胞系作为包装细胞系所涉及的构建体和方法是本领域所熟知的。例如Boerkoel等(病毒学195(2):669-79,1993)公开了用原代鸡胚成纤维细胞为包装细胞系包装病毒的方法。那些同样的方法可用于在本发明的无限增殖化细胞中包装病毒。
由于大多数鸟类细胞系和全部转化的鸟类细胞以及几乎所有的啮齿类转化细胞系或者含病毒污染物(如内源性病毒)或者产生病毒蛋白质，它们不适合于生产人或动物疫苗。所述细胞不能用于产生重组蛋白质，因为所述内源性污染物会污染纯化的重组蛋白质制剂。作为优点，本发明的细胞提供对这些问题的适当的替代方案。
本发明的细胞还可用做支持来自其他细胞的病毒生长的底物。这些其他细胞包括原代细胞或在其他细胞存在或细胞外基质蛋白质(如胶原，层连粘蛋白等)存在时的培养中显示出生长有所改进或寿命延长的培养细胞。在一个实施方案中，将细胞与病毒混合，然后与本发明细胞混合，优选的比例是细胞与本发明细胞之比约为1∶5个细胞到约1∶20个细胞之间，并更优选约1∶10的比例(1个细胞比大约10个本发明的细胞)。然后把混合的细胞置于培养中。在第二个实施方案中，把所述细胞与病毒混合并置于已经附着在组织培养表面上的本发明无限增殖化细胞的表面上。本发明的细胞起到其他细胞的支持物的作用并且(无意限制本发明范围)本发明细胞可提供生长因子等以及细胞外基质成分等以便在其他细胞产生病毒时支持这些其他细胞。实施例9提供使用本发明细胞作为细胞底物的一个实例。
本文引用的全部参考文献专诚插入本公开文件、仅供参考。本发明的具体实施方案将进行详细讨论，并且在本发明范围内已经提到了可能的变动。有各种可为熟悉本领域的人所用的替代的技术和方法，这些技术和方法同样能使专业人员成功地实现预计的发明。
实施例1例举性p53表达载体的制备通过用pBluescriptSK载体(Stratagene,LaJolla,CA)起始来构建质粒pJFNⅡ(5436bp)。用PvuⅡ除去多克隆位点和lacZ基因。用牛小肠碱性磷酸酶处理2513bp的载体片段。然后用EDTA处理所述片段，在65℃培养并用苯酚/氯仿，继之以乙醇沉淀提取。用BamH1和NdeⅠ消化质粒pRSVneo(Gorman,C.，等科学221:551-553,1983)。用DNA聚合酶的Klenow片段(Stratagene,LaJolla,CA)处理所述片段并用2513bp载体片段与平头末端连接。在分离该克隆后，用EcoRⅠ消化所述载体，用Klenow片段处理并重新连接。所述消化从启动子区除去EcoRⅠ位点。该质粒被命名为pJFNⅡ(参见图1)。
在载体中距离编码新霉素抗性基因所使用的SV40聚腺苷酸化信号下游约1000bp的位点上用BamHⅠ切开pJFNⅡ。用PCR获得鸡金属硫蛋白启动子。下述引物用于聚合酶链反应(PCR)以获得所述金属硫蛋白启动子左引物5’CGAAGATCTCTCAGCACGGCCCCACGCT3’(SEQ ID NO:3)右引物5’CGAAGATCTTTATTCTCGAGATATCGAATTCTCGGGTGGGCTCGTAGCAGT3’(SEQ ID NO:4)在这些实验中，PCR反应的模板是质粒pCBcMTlacZ。质粒pCBcMtlacZ中的鸡金属硫蛋白诱导型启动子(Fernando和Andres，基因81:177-183,1989)从Dr.Ann Gibbins(Guelph大学，Guelf，安大略，加拿大)处获得。熟悉本领域的人将认识到所述启动子还可从基因表达文库鉴定以得到其他物种(包括鸡)的启动子。所述引物从IDT(Coralville,LA)购得。左和右引物均被设计为包括BglⅡ位点。用这些引物扩增产生了与SEQ ID NO:2相应的核酸片段内所含的金属硫蛋白启动子。
优选的鸡金属硫蛋白启动子序列(SEQ ID NO:2)是CTCTCAGCACGG CCCCACGCTG TGCGCACCGC CTCGCAGCGCGGCCCGGGGG GGTGGCGGGG GTGGGAGCAG CAGTGGCGCAATGACCCCTC CGGGTCACAT TCCCGCAACC GAGCGCAGAGTGCGTGGCCG GGAAATTCCC CCCCCCCAAT TCGCCTTTCGGCAGCCAAAG CGGGAGGGGG GGAGTGAGGA GGGTCAGGCACGTTGGGGTC CGTGCCGTGT TCTGGCAAAG TGTCGTGTTTGGGGGGGGGG GGGAGCAAGG AAGGGAGGCG AGGGGTGAGGACACAAAGCA AAAGCGCCCT AAATCTGTTG GCACACATGGCCATCCCACA GCTGTATCCC CCTGCTTTGG GGGAACCCCAACACCAGGGC TGGCCCCGCG GTGAGGCTCC CCCCAGGCAGGGGGCACGGC CGTGACCCCG CTGAGCACGG CACGGCGCTGCCCCGCCCCG CTGAGCACGG CACGGCACGG CACGGCACGGCCCCCCGAGC ACGGCTCAGC ACGGCACGGC GCTCAGCACGGCACGGATCG GCACCGCCCC GCCGTGCGCT GCGCGCAGCACCACCCCGGC CCTATAAATA CAGGGCGGGC AGCGGGACTCGGGACTGCTA CGAGCCCACC CGAG3′该启动子含三个主要的金属调节元件，GC-盒功能区和TATA盒。所述金属调节元件结合金属并诱导位于下游的鸡金属硫蛋白基因。用BamHⅠ将从左和右引物插入BglⅠ末端的扩增的金属硫蛋白片段连接到pJFNⅡ。选择从所述连接鉴定的载体克隆提供的新霉素抗性的能力。所述克隆被命名为pJFNⅡcMTD并且约为6088bp。该载体包括多克隆位点，其中包括EcoRⅠ,EcoRⅤ和XhoⅠ。所述右引物内的聚腺苷酸化信号使缺乏此信号的DNA序列有效地表达。
把如来自T.Soussi的EcoRⅠ插入片段所提供的鸡p53cDNA(SEQ IDNO:1)(GenBank的登记号#X13057)插入到pJFNⅡcMTD的多克隆位点中的EcoRⅠ内切酶限制位点。该cDNA序列(Soussi等，核酸研究16:11383,1988)含64bp的5’非翻译区(UTR)，一个编码367个氨基酸的p53分子的1101bp的开放阅读框，一个390的3’UTR和一个小的poly-A尾。鸡p53与人的同源片段有约47％的同源性。得到含EcoRⅠ粘性末端的1555bp的鸡p53cDNA，并用EcoRⅠ消化cMT(金属硫蛋白)/SK+构建体。把所述鸡p53cDNA插入片段连接到EcoRⅠ位点。鉴定出含以正向(有义)取向的所述p53插入片段的克隆。把所述构建体转染进入感受态大肠杆菌XL-1 Blue细胞(Stratagene公司)并在添加氨苄青霉素的LB肉汤中培养过夜。通过Sambrook等的大型(maxi)质粒制备方法分离质粒(分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港，纽约，1989)。转染前通过氯化铯离心两次纯化质粒DNA。
实施例2从完整组织分离原代细胞胚胎SPAFAS系鸡胚(HyVac,Abel,IA)是这些实验的原代细胞来源。所述卵和生这些卵的鸡由供应商证明对禽流感病毒(A型)，禽呼肠孤病毒，禽腺病毒(Ⅰ-Ⅲ种)，禽脑脊髓炎病毒，禽痘病毒，新城疫病毒，副粘病毒(2型)，支原体，沙门氏菌及其他已知感染禽畜的感染介质皆为阴性。受精卵在无菌隔离的培养箱中进行培养并对10天龄和19天龄的胚胎处理加工以建立原代培养物。
用三个10天龄SPAFAS胚胎从心脏，肝脏，皮肤和肌肉(胸和大腿)获得细胞。19天龄胚胎也用于建立原代皮肤培养物。用胰蛋白酶/EDTA溶液解离胚胎组织并铺在含10％胎牛血清(Gibco)，含1％抗生素/抗真菌剂(Gibco)和2mML-谷氨酰胺(Gibco)的DMEM培养基上(Gibco)。把解离的细胞悬液收集在一个含10％毫升胎牛血清的50毫升离心管中以使所述胰蛋白酶失活并在700xg下离心10分钟。
把所述细胞重新悬浮在富含36微克/毫升胰岛素(Sigma)，1.6微克/毫升运铁蛋白(Sigma,St.Louis,MO),2mML-谷氨酰胺，10％胎牛血清，1％抗生素/抗真菌剂溶液的10毫升Dulbecco’s改良的Eagles’s培养基中并按约1×106细胞/平皿将细胞用吸管转移到4-5只100平方毫米的培养皿中并在40.5℃下，在5％二氧化碳，95％空气中培养。培养24小时后，更换所述培养基。
使培养物生长到铺满平皿(5天)并用胰蛋白酶/EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)溶于PBS中)从所述平板移出培养物并重铺平皿以得到第二代。在液氮中冷冻细胞原种。
实施例3把p53/金属硫蛋白启动子构建体转染至细胞来自ELL-0 19天龄的胚胎的原代鸡皮细胞在第一代到第二代之间被转化。将所述细胞以在100平方毫米平皿中5×105细胞密度铺在高浓度葡萄糖DMEM上，所述培养基加有10％合格的胎牛血清并富含1.6微克/毫升运铁蛋白(Sigma,St.Louis,MO)，36微克/毫升胰岛素(Sigma)和抗生素。培养细胞过夜以稳定所述培养物并于次日早晨再添加9毫升培养基并采用包装说明(PanVera公司，麦迪逊，WI)用脂质转染胺TransitⅡ转染。每次转染使用10微克纯化的p53构建体。转染细胞5小时并用600微克/毫升的选择性抗生素G418(Sigma,St.Louis,MO)更换所述培养基。转化细胞在选择性培养基中传代直到形成细胞灶(通常4-10天)并对所得细胞灶进行克隆选择和繁殖。
培养细胞2-3代以产生G418(600微克/毫升)抗性细胞的细胞灶(约103-104)。在开始时当需要时以5×105细胞/100平方毫米平皿分装细胞以避免铺制密度对p53表达效果的影响。未转染的对照细胞用对照质粒假转染。所述对照细胞衰老并在到达12代时死亡。细胞在50mM硫酸锌选择培养基中培养2周直到稳定转染的细胞开始增殖。几只对照培养平皿没有供给硫酸锌(不存在金属硫蛋白启动子的诱导)。再次添加的两周后(后-转染4周)开始出现比周围看上去较老的细胞生长更快的表型特异的细胞灶。在进一步再次添加后，所述被转化的皮肤细胞的细胞灶之一表现为快速增长的细胞。用克隆环从培养平板移出约5×104细胞/细胞灶。把这些细胞转移到一个六孔板。把在锌存在下生长的几乎铺满细胞的两只培养皿以2×105细胞/皿分装成六只培养皿，所术培养皿外加50μM的锌。在锌的存在下以1×105细胞/平方厘米每3-4天增殖所述皮肤细胞直到17代。在约20-22代时，群体倍增出现下降，并在以后回升到群体倍增数每天约为0.7到约1.0倍。还从分离自10天龄鸡胎的转染的皮肤细胞得到细胞灶。由于文献中众所周知p53为一种致瘤抑制基因并为一种生长调节基因，因此所述实验结果是出乎意料的。用含反义p53基因片段的相同的构建体转染皮肤细胞的完全相同的培养物。用这种构建体转染的细胞不能进行无限增殖化。
对原代心肌和胸肌细胞而言，将所述冷冻的培养物解冻并传代。在第2代用有义p53构建体与多胺化合物，脂质转染胺TransitⅡ(PanVera公司，麦迪逊，WI)一起转染每种类型的细胞之8×106细胞(铺满40-70％)。维持未转染的细胞作为阳性生长的对照和作为阴性细胞死亡的对照(额外添加G418的培养物)。为进行转染，滴加2-12微升/微克DNA到100微升无血清培养基(RPMI 1640,LifeTechnologies)。轻轻混合该混合物并在室温下培养5分钟。在厂商提供的TransitⅡ试剂中稀释1-3微克DNA并培养6小时。洗细胞并再次添加培养基。在24小时恢复期后，将心和胸细胞分装到4只培养皿中，每只有3×105细胞并置于G418选择和锌诱导下。鉴定所述实验培养中的细胞灶。从加50μM锌的对照培养皿中没有得到细胞灶。
实施例4检测含p53-构建体之细胞的病毒污染物检测所述细胞的逆转录酶活性。从快速增长的培养物中分离1×106细胞于4毫升培养基中。取所述培养基在-80℃下通过数次冻融以裂解细胞。将含裂解细胞的培养基被铺盖到10％甘油梯度培养基上。用SW40离心机(Beckman Instruments,Pal Alto,CA)将所述梯度培养基在40,000rpm下旋转60分钟。若有的话，形成病毒颗粒的小片。弃去培养基并将小片重悬浮在20微升Nonidet P-40(Sigma化学公司，St.Louis,MO)中。
将一只微量离心管在41℃加热。取5微升样品加入到45微升含45mMTris,pH7.8,2mM2-β巯基乙醇，2mM乙酸锰，0.1％Triton X-100,10μM dATP,dCTP,dGTP各一份(Boehringer Mannheim Biochemical,Indianapolis,IN),2.4微克poly A(Sigma),60ng引物dT12-19(Pharmacia),0.4微居/反应的3H胸苷三磷酸(15,000到28,000cpm/pmole活性，Amersham)的逆转录酶混合液中。
所述反应液在41℃温育1小时。阴性对照使用5微升双蒸水和45微升混合液。在所述测定中包括两个已知的阳性对照。通过加入1毫升10％三氯醋酸(TCA,Columbus化学工业公司，Columbus,WI)终止所述测定。通过Whatman GF/C玻璃0.45微米预过滤器过滤混合物。用5％TCA洗数次。将滤出物转移到含5毫升闪烁计数液的闪烁管中。用050到600窗口设置在Beckman仪器闪烁计数器上对样品记数。数量超过所述混合液本底(阴性对照)三倍的被认为是阳性的。
与本发明中使用的其他细胞一样，所述原代细胞检测为阴性。逆转录酶测定的进一步资料参见(Crittenden等，病毒学，57:128-138,1974)。
实施例5无限增殖化细胞的鉴定将含p53/金属硫蛋白的构建体引入细胞后，当所述细胞在组织培养中经过约25代以上并且每天以群体倍增约0.6到约1.5倍进行倍增时即可以称为无限增殖的。将这个速率与群体倍增速率约为0.1到约0.2群体倍增/天的晚期未处理的(即，未接受p53/金属硫蛋白启动子构建体的细胞)对照比较。接受p53/金属硫蛋白启动子的皮肤细胞目前处于将所述基因构建体引入所述细胞之后的第70代。在所述转染方法中，鉴定出20个以上的无限增殖化克隆。所述细胞形态上是正常的并且是接触抑制型的。胸肌细胞目前在52代，并且形态是正常的，表现为接触抑制的生长并且目前群体倍增速率约为0.72。选出13个克隆用于分析。心细胞目前是在20代，形态正常，是接触抑制的，并且平均群体倍增速率是0.6。数个克隆的群体倍增速率在约0.8和1.1之间。选出10个以上的克隆供进一步研究。
实施例6进行软琼脂菌落形成测定以评估细胞的致瘤潜力为测试致瘤潜力，检测p53/金属硫蛋白启动子转染的细胞在软琼脂中的生长。通过在21.6毫升富含的McCoy’s 5A培养基[BRL/Gibco,120毫升胎牛血清(加热灭活，5毫升丙酮酸钠(2.2％储液)，1毫升L-丝氨酸(21毫克/毫升储液)，5毫升L-谷氨酰胺(200mM储液)，12.5毫升Hepes(1M储液)]中混合12毫升2％琼脂溶液(已进行高压灭菌并冷却到56℃),5.9毫升天冬酰胺(44毫克/毫升过滤的无菌储液)制备软琼脂基质。将7毫升温暖的培养基/琼脂倒在100平方毫米的组织培养皿上并使其于室温下在组织培养橱中固化1小时。
通过胰蛋白酶消化从生长活跃的(约有40到70％铺满)培养物中移出细胞以便在新鲜的含10％胎牛血清(有L-谷氨酰胺和抗生素-抗真菌剂)的DMEM培养基中得到单细胞悬液。加入大约1×106细胞到含10％胎牛血清，0.75毫升1％琼脂，和50微升2β-巯基乙醇的4.2毫升DMEM培养基中。需要小心以确保在加入所述细胞前温暖的培养基/琼脂在42℃下。很快地，把5毫升上述细胞悬液铺在所述琼脂平板上。
细胞在37℃下，在5％二氧化碳和95％空气培养箱中生长并观察35天。用3对-硝基苯基-5-苯基四唑亚氯酸盐(INT染料)对双份平板染色并在第0,5,10,15,20,30，和35天检测菌落的形成和生长。所有大于60微米的染色的菌落被认为是阳性的。
全部细胞检测为阴性。有关软琼脂测定的进一步资料可以从Hamburger等(临床生物学研究进展48:pps43,135,179,1980)获得。
实施例7无限增殖化细胞的致瘤性在明尼苏达大学的动物利用协议中(协议第950300-1号，1995年3月到1996年12月)所概括的准则下，将细胞注射给实验动物以测定所述细胞是否是致瘤的。为测试鸡金属硫蛋白启动子控制下的鸡p53的致瘤潜力，将所述无限增殖化细胞给鸡注射。
从细胞培养板移出生长活跃的细胞并注射给6只SPAFAS品系的成年鸡。把皮下注射4×106细胞置于所述鸡翅的网状组织(web)。在3.5个月内每周检测所述注射部位。对迄今所生产的任意的转染细胞(皮肤，心和肌肉)而言，在所述注射部位没有观察到肿瘤并且全部动物保持健康。
实施例8p53/金属硫蛋白细胞系中的病毒繁殖检测上述细胞支持病毒生产的能力。用滴度为8.2TCID50/毫升的呼肠孤病毒的WSS-Reo1733株感染含所述p53/金属硫蛋白启动子构建体的2.5×108细胞。以感染复数为0.005,0.001或0.0005感染性病毒颗粒/细胞的量感染细胞。在滚瓶中培养被感染的细胞并在感染后48,64和72小时检测，并确定生产性病毒的增殖。
另外在滚瓶中以2.0×104细胞/平方厘米接种细胞。在一个滚动架装置上所述滚瓶以0.4到0.5 RPM在37℃下培养8天。用火鸡的疱疹病毒(HVT病毒，毒株R2/23)感染细胞。当所述滚瓶中约有1.33×107细胞时，以0.001的感染复数感染细胞。在约90到约96小时，当约有40％所述单层细胞有与感染相关的细胞病理症状时收获细胞。在有10％Hyclone的γ辐射的FBS,2.5g/L TPB,2mM L-谷氨酰胺，100U/毫升青霉素，0.10毫克/毫升链霉素，0.25微克/毫升两性霉素B，1.6毫克/升胰岛素和1.6毫克/升运铁蛋白的DMEM中培养和维持细胞。初步研究证明所述细胞产生约1.4×104pfu/ml。
细胞还能支持Marek’s病病毒的复制。
实施例9使用受感染的皮肤细胞作为细胞底物本发明的细胞可用做支持原代细胞中病毒复制的底物。在这些实验中，将p53无限增殖化的皮肤细胞与原代细胞混合。在一项研究中，所述原代细胞被感染并与无限增殖化细胞混合和置于培养中，而在另一项研究中，原代细胞被感染并置于所述无限增殖化细胞上，其中所述无限增殖化细胞已经在所述组织培养瓶中被排成一层菌苔。在一个实施例中，所述病毒是Egg Drop Syndrome病毒，而原代细胞为原代鸡胚肝细胞。在第二个实施例中，所述原代细胞是内皮细胞，优选肾内皮细胞，而所述病毒是感染性支气管炎病毒。优选原代细胞与无限增殖化细胞的比例是约1∶5到约1∶20，并更优选约为1∶10。来自生长在所述混合细胞群中的原代细胞的病毒效价高于来自单独在培养中的原代细胞的病毒效价。所述无限增殖化细胞使所述原代细胞可以用于商业条件下的病毒繁殖。
当已详细地描述本发明的具体实施方案时，熟悉本领域的人员将明白这些实施方案是举例，而不是限制，而本发明的真正范围是下列权利要求中所限定的。
权利要求
1．转化原代非啮齿类动物细胞的一种方法，包括步骤在一种能指导p53表达的基因载体中定位编码p53的核酸于金属硫蛋白启动子控制下；将所述基因载体引入原代非啮齿类动物细胞；和筛选群体倍增时间为每天约0.6到约1.5群体倍增的细胞灶，其中所述细胞是逆转录酶阴性并且是非致瘤的。
2．权利要求1的方法，其中所述原代非啮齿类动物细胞是禽源的。
3．权利要求1的方法，其中所述原代非啮齿类动物细胞是人源的。
4．权利要求1的方法，其中所述细胞是皮细胞。
5．权利要求1的方法，其中所述细胞是胸肌细胞。
6．权利要求1的方法，其中所述细胞是心肌细胞。
7．含能指导处于金属硫蛋白启动子控制下的p53表达之基因载体的无限增殖化细胞。
8．权利要求7的细胞，其中所述细胞是成纤维细胞。
9．权利要求7的细胞，其中所述细胞是禽源的。
10．一种繁殖病毒的方法，包括步骤将至少一种感染性病毒颗粒与一种无限增殖化细胞培养的至少一个细胞接触，其中所述细胞培养的细胞含处于金属硫蛋白启动子控制下表达p53的基因载体；并且通过所述细胞收集所产生的病毒。
11．权利要求10的方法，其中所述病毒是呼肠孤病毒。
12．权利要求10的方法，其中所述病毒是HVT。
13．权利要求10的方法，其中所述病毒是禽痘病毒。
14．一种繁殖病毒的方法，包括步骤至少一种感染性病毒颗粒与原代细胞接触；在细胞培养中，将原代细胞和含在金属硫蛋白启动子控制下表达p53之基因载体的无限增殖化细胞一起生长；并且从所述细胞收集所产生的病毒。
15．含所述金属硫蛋白启动子控制下p53和含能在所述细胞中指导重组蛋白质表达的至少一种载体的无限增殖化，非转化细胞。
16．权利要求15的细胞，其表达重组蛋白质。
17．权利要求16的细胞，其中所述载体编码至少重组病毒的一部分。
18．权利要求15的细胞，其中所述载体是逆转录病毒载体。
全文摘要
本发明涉及将金属硫蛋白启动子控制下的p53引入原代细胞以生成无限增殖细胞系。所述细胞可用做病毒繁殖的底物，用做生产重组蛋白质、生产重组病毒的无污染物来源，和用做支持原代细胞并在病毒繁殖期间提高病毒产率的细胞底物。
文档编号C12N7/00GK1228122SQ97197323
公开日1999年9月8日 申请日期1997年8月13日 优先权日1996年8月13日
发明者D·N·福斯特, J·A·法里斯, L·K·福斯特 申请人:明尼苏达大学评议会