专利名称：一种转基因羊的制备方法
技术领域：
本发明涉及转基因动物制备，特别是关于转基因羊的制备方法。
转基因羊研制是基因工程技术与农牧科学技术交叉产生的生物高新技术，是获得转基因目的蛋白的重要途径。通俗地说，转基因羊就是通过转基因技术，将外源目的基因导入羊受精卵。如果导入的外源目的基因整合进羊受精卵的细胞基因组内，由其发育、成熟后的个体就是转基因羊。若导入的外源目的基因，其启动子区载有控制目的基因在羊乳腺组织特异表达的序列，该转基因羊就有可能在其乳腺组织内特异表达目的蛋白(如药物蛋白等)。这种转基因羊也称为羊乳腺生物反应器。它好比一座“制药厂”，在其源源不断分泌的乳汁中，含有珍贵的药物蛋白。由于分泌的药物蛋白是经过羊乳腺细胞内复杂的生化加工以及空间构象改造的，这座“药厂”生产的药品往往是用一般制药技术所不能制造的。
目前，常用的转基因羊的制备方法是从一头母羊(供体)取得受精卵或卵子，卵子在体外受精，然后挑选状态良好的受精卵，在显微操作仪下，将外源目的基因显微注射进入受精卵雄原核。注射后的受精卵可直接移植给经处理而同步发情的母羊(受体)输卵管内；或者受精卵经体外短期培养，挑选成活的注射受精卵移植到受体母羊的输卵管或子宫内。在怀孕的受体最终产下的子代羊中，就可能有外源目的基因整合，并在乳腺组织中特异表达该基因蛋白。该成熟羊个体就是期望的转基因羊。
降低成本，提高转基因羊的成功率，可以从多方面着手。一些具有重要经济开发价值的哺乳动物(如羊、牛等)，其受精卵的原核结构很不清楚。外源目的基因显微注射时，往往不能百发百中地将目的基因注入雄原核中，加之外源目的基因在受精卵内的整合存在很大的随机性，因而绝大部分注射的受精卵没有外源基因的整合。将所有(成活的)注射受精卵进行移植，其结果是在很大部分的受体母羊产下的子代中，其基因组内无外源目的基因整合，更不用说目的基因的表达了。这势必造成大量浪费，同时饲养、管理等费用剧增。
因此，注射后的受精卵在移植前要经过筛选，选择有外源基因整合的羊胚胎进行移植，以提高受孕率。在进行筛选试验时，先将注射受精卵体外培养使其发育至多细胞期的胚胎，然后从胚胎内取出部分细胞用于检测外源目的基因是否整合，有外源基因整合的胚胎称整合胚。目前国内外可应用于整合胚筛选的方法大多是建立在聚合酶链式反应(PCR)基础之上的。例如，有文献报道将外源目的基因先甲基化处理，然后注射到羊受精卵内，在整合胚检测时，先用甲基化敏感的酶处理待测标本，这样标本内未整合的外源基因就有可能被酶切破坏，标本酶解反应后，再用PCR方法检测胚胎细胞内是否存在整合的外源目的基因(参见wo-A-9222657，1992年)，这种方法比较繁琐、不实用。另有报道将待检测标本细胞用固定、洗涤方法，降低细胞内未整合的外源基因，然后用PCR方法检测(参见wo-A-9514376，1995年)，此法虽简单，但影响因素较多。
整合胚筛选能把大部分未整合的胚胎剔除掉，其益处自不待言。但是整合胚筛选技术要求快捷、准确，这是转基因羊研制中急待解决的技术问题。
转基因羊制备的另一个技术关键是羊胚胎的移植技术。胚胎移植方法好，受体动物怀孕率高，获得转基因羊的几率高，这样不仅大幅度降低了成本，还节省了宝贵的时间。常用的羊胚胎移植方法是手术移植。接受胚胎移植的受体羊经麻醉并在严格无菌条件下剖腹，暴露出子宫、输卵管。通过穿刺子宫角或输卵管将胚胎移入。显然该方法对受体组织损伤较大，直接影响受体母羊怀孕率的提高。另一种胚胎移植方法是应用腹腔镜移植技术。该方法仍有一定的组织损伤，并且腹腔镜设备昂贵，手术操作复杂。
常用的手术或腹腔镜胚胎移植技术存在对受体组织损伤大、受体怀孕率低的缺点。因而必须探索一种新的对受体母羊无组织损伤的胚胎移植技术。研究表明，羊的阴道组织结构非常特殊。其肌环结构形成五个狭窄的入口。同时，其阴道黏膜皱折形成口袋状结构，使得外来物不易通过。羊的子宫呈双角状，而且母羊个体间，双角子宫间的夹角变异较大。有些呈180度对角水平状，有些极不规则。本发明通过大量的解剖研究后，创造了一种可以经羊阴道方便地进行羊胚胎移植的技术。
为此，本发明的目的是提供一种转基因羊制备方法。包括在羊受精卵原核结构清晰时注射外源基因，整合胚检测先用“打洞压迫法”取出部分胚胎细胞，然后用巢式PCR技术对整合胚进行检测，同时采用羊多细胞胚胎移植器，经阴道将胚胎移植入羊子宫，从而大大提高转基因羊制备的工作效率。
本发明一种转基因羊的制备方法，包括分离出羊卵子，体外培养，体外受精；羊受精卵在培养过程中出现清楚的原核结构时，显微注射外源基因进入受精卵雄原核，继续体外培养；进行整合胚的检测先采用“打洞压迫法’取出部分胚胎细胞，再采用巢式PCR技术进行检测；胚胎移植是采用羊多细胞胚胎移植器，经阴道将羊多细胞胚胎移植入受体母羊子宫，受体怀孕。
本发明转基因羊制备方法中，羊卵子体外受精后，在连续培养期间。经过多次实验观察证实，有一短暂时期受精卵的原核结构较清晰，这时显微注射外源基因，非常有利于提高显微注射的成功率，也就是有利于提高胚胎的整合。
本发明显微注射的外源基因可以是人血清白蛋白基因，人凝血FVIII、FIX因子基因，人乳铁蛋白基因，α-抗胰蛋白酶基因，促血小板生成素基因，促红细胞生成素基因，转铁蛋白基因等。
本发明转基因羊的制备方法中，山羊和绵羊都适用。
在羊胚胎移植前均经过整合胚检测。本发明转基因羊制备方法中，采用一种快速、灵敏、准确的外源基因整合羊胚胎的检测方法(已申请发明专利)。该法先采用“打洞压迫法”即取桑椹期和囊胚期的羊胚胎，在羊胚胎的透明带上打洞，再挤压胚胎，挤出部分胚胎细胞，然后用巢式PCR技术进行筛选，设计合适的引物，进行二次PCR扩增外源目的基因。第一次PCR扩增，加入的第一对引物位于待检测外源基因的最外侧或其附近区域，第二次PCR扩增，加入的第二对引物位于第一对引物的内侧，同时设置多组重复试验，并加入内对照基因，以降低未整合的外源基因及有时由于PCR技术本身的错误对检测的影响，提高转基因整合胚检测的准确性，进一步提高转基因羊研制的效率。
本发明转基因羊制备方法中，胚胎移植是采用羊多细胞胚胎移植器(已申请实用新型专利)经阴道将羊多细胞胚胎移植入受体母羊子宫，该移植器结构包括，有一头端为光滑圆形封口的中空插导管；一可弯曲的胚胎移植管装于插导管中，通过位于插导管头端下方一呈长圆形的侧开口向外伸出，在插导管引导下进入羊子宫腔，其长度比插导管长，长度足以使移植管的头端平开口到达羊子宫角，侧开口能随插导管向右或向左旋转180°；在插导管的尾端有一持手块，其上还有一个方向标记，用以控制插导管的插入和方向转动等，距头端约10厘米处开始有一约5厘米长的刻度标记，以便控制插导管插入的深度。当插导管经阴道插入右侧子宫时，侧开口转向右侧，可引导移植管进入受体母羊右侧子宫，进行右侧子宫胚胎移植，同样，将插导管插入左侧子宫时，侧开口转向左侧，可引导移植管进入受体母羊左侧子宫，进行左侧移植；在胚胎移植管的尾端有一能与医用注射器乳头连接的接口，移植时通过注射器将移植管内少量羊胚胎培养液和胚胎，注入羊子宫腔内。
实验结果表明，应用本发明技术移植42枚胚胎，使用13只受体母羊，结果9只母羊怀孕，受孕率为70％。
本发明优点本发明转基因羊的制备方法，建立了一条综合体外受精，显微注射外源基因，胚胎培养，从胚胎中取出部分细胞，整合胚检测及胚胎移植等转基因羊制备的一条新技术路线，使转基因羊的成功率大大提高。
首先实验观察证实，有一短暂时间受精卵的原核结构较清晰，此时显微注射外源基因，可提高显微注射的成功率。其次提出了一个快速、灵敏、准确的外源基因整合羊胚胎的检测方法，用“打洞压迫法”从羊胚胎中取出部分胚胎细胞，胚胎损伤小，胚胎成活率可达90％，并用巢式PCR技术检测整合胚，该技术快速灵敏，准确性高。又提供一种羊多细胞胚胎移植器可方便快捷地经阴道将羊多细胞胚胎移植入受体母羊子宫，对母羊无组织损伤，提高母羊的受孕率可达70％。
本发明通过以下附图和实施例进一步阐述，但并不限制本发明的范围。
图1是用巢式PCR技术鉴定整合羊胚胎的凝胶电泳图。
M1、M2是标准分子量，第1泳道为阳性对照；第2泳道为内对照；第3、4、6泳道为阳性整合胚；第5泳道为未整合胚。
图2是羊多细胞胚胎移植器结构示意图。
图中符号表示1—插导管，2—移植管，3—侧开口，4—持手块，5—平开口，6—接口，7—方向标记，8—刻度标记。
本发明实施例中所用的试剂均为Gibco和Sigma公司生产的胚胎培养级试剂。
实施例1 羊卵子体外受精及人凝血FIX因子基因的显微注射取健康母羊(我国南方的海门山羊)卵巢，立即送往实验室。带有7号注射针头注射器预先吸有约1ml的胚胎培养液(TCM199培养液，含5％胎牛血清及0.12微克丙酮酸钠)。注射器穿刺卵巢上的卵泡，并抽吸，将带有卵子的卵泡液吸入注射器。然后将含有卵子的卵泡液移入一个盛有0.5ml的胚胎培养液的小皿内，选择形态好的卵子放入39℃、5％二氧化碳、饱和湿度的培养箱内培养26小时。选择至少有5层颗粒细胞的羊卵子进行体外受精。受精卵继续在上述条件下培养。大约在受精后18个小时，可见培养的受精卵出现较清晰的原核结构，此时显微注射人凝血FIX因子基因5Pg进入受精卵雄原核。
实施例2 巢式PCR技术鉴定试验实施例1的注射受精卵在体外培养6天，发育至囊胚后期。在多细胞羊胚胎透明带上打两个洞，并挤压胚胎，以从胚胎中取出部分胚胎细胞。挤出的细胞小心移入一支0.5mL无菌离心管内。以冻融法破碎细胞。融破的细胞溶液直接作为PCR扩增用的DNA模板。然后加入第一次PCR引物各6pmol(A和B，引物序列见表1)及1.5个单位Tag酶和标准10×PCR反应缓冲液1微升，反应体系总体积为10微升。在PE-9600循环仪上，按下述条件94℃变性1分钟后，以55℃退火45秒，72℃延长1分钟为条件经15个PCR循环扩增。扩增结束后，试管在台式离心机上离心。分别吸取2微升反应产物作为第二次PCR反应的模板，加入到3个新的0.5mL无菌离心管，然后加入第二次PCR引物各10pmol(C和D，引物序列见表1)，作为内对照的羊β珠蛋白基因片段引物10pmol(GB1和GB2，引物序列见表1)，1.5单位的Tag酶及标准10×PCR反应缓冲液2.5微升，反应体系总体积为25微升，按下述条件进行PCR扩增，94℃变性1分钟后，以55℃退火45秒，72℃延长1分钟为条件经40个循环扩增后终止反应。从各反应管内取反应产物5微升进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。分析结果见图1，第1泳道为阳性对照，可见205bp的条带(人FIX基因)；第2泳道为内对照，可见121bp的条带(羊β珠蛋白基因)；第3、4、5、6泳道为胚胎细胞巢式PCR检测结果，其中第3、4、6泳道可见有205bp和121bp扩增产物条带，可确定为整合胚，其中第5泳道仅见121bp扩增条带的，则为未整合胚。
表1
以该巢式PCR技术对动物胚胎进行鉴定，符合要求的整合胚进行受体移植。结果表明，出生的子代动物百分之百与整合胚的结果相符合。
实施例3 羊胚胎的移植实验采用羊多细胞胚胎移植器(结构示意图见图2)经阴道将羊多细胞胚胎移植入受体母羊子宫。受体母羊在无任何麻醉情况下，取仰卧位固定。用阴道窥器扩开阴道，然后将羊多细胞胚胎移植器的插导管头端的侧开口转向右侧，经阴道口沿阴道到达子宫颈口。据经插导管尾端的持手块，将其插入右侧子宫颈口。越过子宫颈肌环后进入右侧子宫。将预先按实施例2经整合胚鉴定的2枚桑椹后期的羊胚胎及少量羊胚胎培养液吸入移植管内，然后将移植管顺着插导管徐徐导入，最后通过侧开口到达右侧子宫底部。当移植管触及羊子宫底遇到阻力时，将移植管向外拔出0.5厘米，以保证移植管在子宫腔内，并且移植管开口不被子宫组织阻挡。推动移植管尾端连接的医用注射器针心，缓慢地把胚胎注入受体母羊右侧子宫。完成右侧子宫胚胎移植后，拔出移植管。然后，将插导管略拔出，使其头部的侧开口转向左侧。用同样方法将插导管插入左侧子宫，并以同样方法通过移植管将另2枚羊胚胎注入左侧子宫。胚胎移植结束后，受体母羊可立即下地行走，进食。50～60天后，超声波检查受体母羊已怀孕。
权利要求
1.一种转基因羊的制备方法，包括分离出卵子、体外培养、体外受精；羊受精卵体外培养，显微注射外源基因；整合胚检测；多细胞羊胚胎移植入受体母羊子宫，受体怀孕，其特征在于该方法中整合胚检测先取桑椹期和囊胚期的羊胚胎，在羊胚胎的透明带上打洞，挤出部分胚胎细胞，然后用巢式PCR技术鉴定羊胚胎细胞内整合的外源基因，即进行二次PCR扩增外源基因，该方法中羊多细胞胚胎移植是采用羊多细胞胚胎移植器经阴道移植入受体母羊子宫。
2.按权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述巢式PCR技术检测时，第一次PCR扩增，加入的第一对引物位于待检测外源基因的最外侧或其附近区域，第二次PCR扩增，加入的第二对引物位于第一对引物的内侧，同时设置多组重复试验，并加入内对照基因。
3.按权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于显微注射时的外源基因是人凝血FIX因子基因时，所述第一对引物的序列如下引物A5’GATCATGGCAGAATCACCAG3’引物B5’GTATCCCGGTATGTCAACTG3’
4.按权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于显微注射的外源基因是人凝血FIX因子基因时，所述第二对引物的序列如下引物C5’ATTCTGTGGAGGCTCTATCG3’引物D5’CAACCATGACATTGCCCTTC3’
5.按权利要求1所述的制备方法，其特征在于该方法中所采用的羊多细胞胚胎移植器，它的结构包括有一头端为光滑圆形封口的中空插导管；一可弯曲的胚胎移植管装于插导管中，通过位于插导管头端下方一呈长圆形的侧开口向外伸出，其长度比插导管长，侧开口能随插导管向右或向左180°旋转，胚胎移植管的头端为一光滑的平开口；在插导管的尾端有一持手块；在胚胎移植管的尾端有一能与医用注射器乳头连接的接口。
6.按权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述胚胎移植器结构中，胚胎移植管长度足以使移植管的头端平开口到达羊子宫角。
7.按权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述胚胎移植器结构中，距插导管头端10厘米处开始有一5厘米长的刻度标记。
8.按权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述胚胎移植器结构中的持手块上有一方向标记。
全文摘要
一种转基因羊的制备方法,是一条综合体外受精,在受精卵的原核清晰时注射外源基因,用“打洞压迫法”从胚胎中取出部分胚胎细胞,再用巢式PCR技术鉴定整合胚,及使用一种羊多细胞胚胎移植器经阴道将羊多细胞胚胎移植入受体母羊子宫等一条新技术路线,使转基因羊的成功率大大提高,受孕率可达70%。
文档编号C12N15/89GK1203021SQ98110829
公开日1998年12月30日 申请日期1998年5月8日 优先权日1998年5月8日
发明者黄淑帧, 曾溢滔 申请人:上海市儿童医院上海医学遗传研究所