专利名称：沙蚕激酶及其提取方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis)和多齿围沙蚕(Perinereis nuntia)体内提取出能降解纤维蛋白的可用于治疗血栓性疾病的溶血栓纤溶酶------沙蚕激酶。
心脑血管疾病如脑血栓、心肌梗塞在我国发病率和死亡率仅次于癌症。目前临床上治疗多采用尿激酶、链激酶等溶栓药物来进行治疗。但是由于尿激酶等药物尚存在一些弊端如只能静注，不能口服；易降解血液中纤维蛋白原引起出血；不可长期连续使用等。而且尿激酶需要从尿液中提取，其原材料的收集随着城市化速度的加快愈加困难，质量不能保证，运输过程中容易污染。新近研制出来的蚓激酶虽然有一定的治疗效果，且口服有效，但是，蚓激酶所用的原材料蚯蚓必须通过人工养殖，甚至必须添加一些特殊的营养成分，这就大大提高了药物的生产成本。因而寻找其他更有效、副作用小、价格低的溶栓抗凝药物成为当务之急。
本发明的目的在于提供一种原材料丰富、价格低廉、安全无毒、口服有效的溶栓药物，以弥补尿激酶等药物在生产和治疗方面的不足。
沙蚕系多毛纲环节动物，在我国沿海滩涂地带分布很广，资源十分丰富，绝大多数未得到充分利用，处于自生自灭状态，造成资源的严重浪费。我们首次从沙蚕体内得到能降解纤维蛋白的纤溶酶，并对纤溶酶的性质做了初步研究，发现沙蚕纤溶酶很有可能成为新一代抗血栓药物，并且由于其原料来源丰富、价格低廉，有希望发展成为一种常规治疗药物。同时，利用沙蚕来生产溶栓药还能够充分利用我国的自然资源，促进沿海地区的经济发展。
我们从我国丰产的两种沙蚕中获得纤溶酶，并命名为沙蚕激酶。并且通过实验证实其溶栓活性不低于尿激酶。它既有直接降解纤维蛋白的作用，又能激活纤溶酶原，间接降解纤维蛋白。其分子量在25000-55000之间，等电点在3-7之间，最适反应条件是37℃、pH8.0左右。
与尿激酶相比，沙蚕激酶具有较好的热稳定性，尿激酶在37℃很快失活，故尿激酶不适宜制成口服制剂，只能静脉注射。而沙蚕激酶则有可能研制成适宜口服的新型溶栓药物，沙蚕激酶经60℃一小时后仍然保持90％以上的活性其稳定性甚至超过新近研制的蚓激酶。蚓激酶在50℃时就很快丧失活性。此外，沙蚕激酶在37℃其活性最高，这说明沙蚕激酶非常适合于制成口服药。
沙蚕激酶的制备可分为以下几个步骤(一)预处理和组织的破碎沙蚕尽可能以活的状态应用，否则就应该将其立即冰冻起来。将沙蚕用清水浸泡洗净，用高速组织捣碎机捣碎。
(二)抽提加入0.02mo1/L磷酸盐缓冲液(含0.1mol/L NaCl)抽提液，4℃抽提6小时以上，然后离心，收集上清液。
(三)酶的提纯1．盐析法将研细的硫酸铵固体加入上述上清液中盐析，取20-70％沉淀。再以0.02mol/L磷酸盐缓冲液溶解沉淀。
2．凝胶过滤用Sephadex G-25柱层析或透析法脱盐，G-75或G-100等柱层析进行层析分离，层析柱体积大小为2.6×100cm，洗脱液皆为0.02mol/L磷酸盐(PBS)。用紫外分光光度计测280nm吸光值。收集活性峰，得较纯品。
3．离子交换柱层析选用CM-纤维素和DEAE-纤维素柱将较纯品再进行层析，以0-1mol/LNaCl/PBS梯度洗脱，280nm紫外检测。收集活性峰，透析后冷冻干燥。
4．超滤可将盐析法所得沉淀溶解后直接以超滤方式收集10000-60000之间的蛋白质，然后再进行下一步分离。
5．电泳用10-12％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行制备，可获纯的纤溶酶。
6．亲和层析用Benzamidine-Sepharose 4B进行亲和层析。
7．经过柱层析的样品，用HPLC纯化，可得纯酶。
经上述各种方法分离纯化，沙蚕激酶得率在0.4-0.6‰(占活沙蚕重)之间，500克沙蚕可获得约4000-50000U沙蚕激酶。
沙蚕激酶可用于生产治疗脑血栓、心肌梗塞等引起的血栓性疾病的口服药。沙蚕激酶活性的测定采用平板法及体外血块溶解法，具体做法如下(一)平板法因平板法灵敏度较高且既可定性又可定量，故本研究多采用平板法。
试剂血纤维蛋白原0.25％(W/V)溶液溶解液为17份生理盐水、1份0.03mol/L、pH7.8磷酸缓冲液。纤维蛋白原为Sigma公司产品。
牛凝血酶中国药品生物制品检定所出品。用生理盐水配成每m160NIH单位(2.2NIH单位=1BP单位)。
磷酸盐缓冲液0.03mol/L、pH7.8。
沙蚕激酶样品用磷酸盐缓冲液配成一定浓度。
操作在直径为10.5cm平皿里，加入17ml纤维蛋白原溶液，再加入0.4ml凝血酶溶液，快速摇匀，静置30min，凝结后平板基本透明无色，用微量注射器点样20ul(定量检测时，同时点上稀释成不同浓度的尿激酶标准品)，复以玻盖，于37℃箱中保温18h后取出，用卡尺测出溶圈垂直两直径，相乘得一积。以溶圈直径乘积作纵坐标，尿激酶标准品的浓度为横坐标作图，即可在图上查出样品的活力单位。
(二)体外血块溶解法取人新鲜血液，待其凝固成块用纸吸去血清，制成相同大小的血凝块(直径8mm，高5mm的园柱状)，放入编号的试管中，加入纤溶酶提取液，同时用不加纤溶酶的缓冲液作对照，置37℃观察血块溶解情况。加入沙蚕激酶的试管中的血块一般在18小时左右基本溶解，而对照管无任何变化。此方法可用来作定性实验。
纤溶酶的性质研究(一)温度对酶的活性的影响用0.02mol/L，pH7.8磷酸盐缓冲液将沙蚕激酶配成2mg/ml的溶液，分成6份，分别在10℃、20℃、37℃、50℃、60℃、70℃放置1小时，然后用平板法测定剩余活性。18小时后测定结果，(见附图1，温度对沙蚕激酶活性的影响)，37℃左右有最大活力。
(二)pH对酶活性的影响用磷酸盐配成一系列不同pH的缓冲液，将沙蚕激酶溶于其中(2mg/ml)，然后在不同pH下用平板法测定酶的活力，结果发现其最适pH在8.0左右。(见附图2,PH对沙蚕激酶活性的影响)。
又将酶溶于不同pH的磷酸盐缓冲液中，37℃保温1小时，然后调pH至8.0，测定剩余活力，结果(见附图3，不同PH对沙蚕激酶稳定性的影响)。沙蚕激酶在pH8.0左右稳定性最好。(三)纤维蛋白溶酶原激活活性测定分别从几份不同的沙蚕激酶样品中取出15ul，再分别加入15ul浓度为10单位/ml的纤维蛋白溶酶原，使最终浓度为含5mg/ml样品，5单位/ml纤溶酶原，对照用15ul缓冲液代替纤溶酶原，然后用平板法测定活性。结果发现，加入纤溶酶原的样品在平板上的溶圈明显大于对照。由此说明沙蚕激酶既有直接纤溶作用，又有间接激活作用。
图1，温度对沙蚕激酶活性的影响。
图2，PH对沙蚕激酶活性的影响。
图3，不同PH对沙蚕激酶稳定性的影响。
实施例11．取500克活沙蚕，用清水浸泡，洗去泥沙污物，然后将水沥干，用组织捣碎机捣碎。2．加入1000ml 0.02mol/L磷酸盐缓冲液(含0.1mol/L NaCl)抽提液，4℃抽提6小时以上，pH值控制在7-8。然后8000rpm，4℃离心15min，收集上清液。3．将硫酸铵充分研细，称取硫酸铵加入上述上清液中使成20％饱和度。静置2小时左右，离心收集上清液。再加硫酸铵至70％饱和度，静置，离心收集沉淀。再用0.02mol/LPBS溶解沉淀。4．以Sephadex G-25柱层析脱盐(柱体积大小为2.6×100cm)，加样量为100ml左右，洗脱液为0.02mol/L磷酸盐(PBS)。将去盐后的粗提物冷冻干燥，-20℃保存备用。5．称取50mg上述冻干品，以0.02mol/L PBS溶解，用Sephadex G-100柱层析(柱大小为2.6×100cm)进行初步分离，用紫外分光光度计测280nm吸光值，收集活性峰，得较纯品。6．将上述较纯品用DEAE-Sephadex A柱(2.6×30cm)进一步分离，以0-1MNaCl/PBS梯度洗脱，280nm紫外检测，收集活性峰。透析后冷冻干燥。7．最后用10-12％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行制备，获得纯的纤溶酶。得率为0.4‰，每500克沙蚕可得8000-40000U沙蚕激酶。实施例21．同实施例1。2．同实施例1。3．同实施例1。4．透析脱盐，冷冻干燥，-20℃保存备用。5．取上述冻干品50mg，以0.02mol/L PBS溶解，用Sephadex G-75柱层析(2.6×100cm)进行初步分离，收集活性峰。6．将上述活性组分用CM-纤维素进行柱层析(2.6×30cm)，梯度洗脱，收集活性峰。透析去盐。7．再用DEAE-纤维素柱层析(2.6×30cm)进一步分离上述活性组分，0-1MNaCl/PBS梯度洗脱，收集活性峰，超滤浓缩。8．最后以HPLC(FPLC)层析获纤溶酶纯品。得率为0.5‰，每500克沙蚕可得4000-35000U沙蚕激酶。实施例31．同实施例1。2．同实施例1。3．同实施例1。4．用不同截留分子量的超滤膜超滤，收集分子量在10000-60000之间的蛋白质。5．将上述组分加入Benzamidine-Sepharose 4B亲和柱，先用0.02mol/L pH7.8的PBS洗脱，将非特异性杂蛋白质洗下，再用含1mol/L尿素与0.5mol/L精氨酸的PBS洗脱，收集活性峰，超滤浓缩。6．再以HPLC(FPLC)层析获纯的纤溶酶。得率为0.6‰，每500克沙蚕可得30000-50000U沙蚕激酶。
权利要求
1．一种溶血栓纤溶酶，其特征是从双齿围沙蚕和多齿围沙蚕体内提取出的溶血栓纤溶酶一沙蚕激酶，沙蚕激酶的分子量在25000-55000之间，等电点在3-7之间，最适反应条件是37℃，pH8.0左右。
2．一种溶血栓沙蚕激酶的生产方法，其特征是将沙蚕用高速组织捣碎机捣碎成匀浆，并加抽提液抽提，以硫酸铵盐析，取20-70％沉淀，再以Sephadex G-25、Sephadex G-75或透析或超滤法脱盐，然后用葡聚糖凝胶、离子交换纤维素或亲和层析以及电泳或HPLC等方法进一步纯化。
3．根据权利要求1所述的沙蚕激酶，其特征是沙蚕激酶可用于生产治疗脑血栓、心肌梗塞等引起的血栓性疾病的药物。
全文摘要
本发明从沙蚕体内提取溶血栓纤溶酶—沙蚕激酶,属于生物制药技术领域。其目的在于提供一种原料丰富、价格低廉、安全无毒、口服有效的溶栓药物。沙蚕激酶的分子量在25000—55000之间,等电点在3—7之间。沙蚕激酶可用于生产治疗脑血栓、心肌梗塞等引起的血栓性疾病的口服药。
文档编号C12N9/64GK1234443SQ98111280
公开日1999年11月10日 申请日期1998年5月5日 优先权日1998年5月5日
发明者陈颢, 张伟云, 谭仁祥, 夏仲豪, 汪水娟 申请人:南京大学