专利名称：耐盐植物的育种方法
技术领域：
本发明涉及耐盐植物的育种方法，是利用一种新的外源DNA导入手段，提高受体植物的耐盐性，进而育成能在盐碱地生育的耐盐性作物。它属于生物工程技术领域，也属于农业生物技术领域。
土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的重要因素之一。据统计全世界的盐碱地约占陆地总面积的三分之一(Epsteint,1983)，我国有盐碱地约一亿亩，沿海洼地约5500万亩，且有逐年增加的趋势(中国海洋高技术研究开发专题报告，1992)。在人口不断增加，耕地日趋减少和淡水资源不足的压力下，选育适于盐碱地种植，并能耐受海水倒灌或海水浸渍的耐盐作物品种，是开发利用大面积盐碱土的重大课题，也是生物科学技术急需解决的重大课题。
用传统的方法进行耐盐作物的选育，至今尚未选育出真正的耐盐品种。随着分子生物学技术的发展，人们寄希望于基因工程育种，目前不少实验室从糖、氨基酸、甜菜碱等可以调节细胞渗透压的低分子有机化合物出发，将其合成途径中有关的重要酶基因转移到作物中，以提高作物的耐盐性(Serrano,R.et al,Critical Reviews inPlant Sciences,1994,13(2):121-138；McCue,K.F.et al,Plant MolecularBiology,1992 18:1-11)。如陈受宜等已将黑麦脯氨酸合成酶基因(ProA)导入烟草和百脉根中，将甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)导入到草莓和烟草，转基因植物的耐盐性有明显提高(陈受宜等中国科学1991,2:127-145；张劲松等中国科学1995,11:1172-1177)；美国北卡罗来纳大学发现0.25-0.4M NaCl能促进水稻内源性ABA增加和Em基因的表达(Qratrano R.S.et al,Plant Physiol.1992 98 1356-1363)；Nomura等将大肠杆菌合成甜菜碱的bet基因簇导入到淡水兰藻，在0.4M NaCl条件下，细胞内积累的甜菜碱提高到约80mM，而对照在这种条件下不能生长(Nowura M.et al,PlantPhysiol.1995 107:703-708)；与抗渗透胁迫有关的基因还有CAM酶、PEP羧化酶、丙酮酸磷酸双激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶等基因(Mitchll C.T.et al,Science 1993259(22):508-510)。研究表明除了这些低分子有机化合物在细胞内的积累可以提高植物的抗盐性之外，某些蛋白质也有类似作用。1987年Singh首次报导了一种调渗蛋白(Osmotin,OSM)(Singh N.K.et al,Plant Physiol.1987,85:529-536)，并很快成为研究的热点；最近美国和伊朗有人从生活在死海中的H.marismortui分离到一种铁氧还蛋白(ferredoxin)，并对其结晶构造进行分析，由于其结构的特异性而对水分子有异常高的结合能力，因而能在高盐条件下生存(Nat.Struce.Biol.3,452 1966)。虽然这类的研究报告不少，也克隆了一些蛋白质基因，然而由于生物学功能和调节背景尚不清楚，目前还难于利用。
由于植物耐盐机制十分复杂，涉及到一系列形态结构和代谢过程的变化，目前尚不清楚植物的耐盐性究竟涉及多少基因，这也是目前通过转移单个基因只能部分提高耐盐性的原因。
本发明的目的是为选育适于盐碱地种植，并能耐受海水倒灌或海水浸渍的耐盐作物品种，确立有效、安全、实用的耐盐植物分子育种方法。
为实现本发明目的所采取的技术措施是将盐生植物(红树、盐藻等)作为耐盐基因供体，培育耐盐作物的重要种质资源库，将其总DNA片段，通过花粉管通道导入到蔬菜作物如豇豆、茄子、辣椒中，经GUS基因表达检测、核酸BAPD分析、蛋白质SDS-PAGE等检测，证明外源DNA导入后，在受体植物中能够表达；通过细胞学、生理学、遗传学分析，DNA导入后的受体植物发生了一定的变化，并能稳定遗传；进一步通过供体植物cDNA文库的建立，识别与分离有关耐盐基因。同时，在盐生植物红树、盐藻的总DNA片段导入到受体植物后，后代的筛选和培育是后代在一定的盐胁迫条件下筛选，选育出能在海滩种植、用1∶3海水或直接用海水浇灌，并能正常开花结实的高耐性植物。
在以蔬菜为研究模型植物的基础上，逐步扩大到水稻、粮油、花卉等植物。
本发明与已有技术相比已达到的技术效果本发明将外源DNA片段导入蔬菜作物中，得到耐盐性显著提高的蔬菜作物，这在国内外是首次报导。具有如下特点1．保持了DNA导入的受体植物的品种特性，即导入外源DNA后的茄子、豇豆等还是茄子、豇豆；2．导入外源DNA后的植物的耐盐性显著增加，能在海滩种植和用海水浇灌，而对照植株则不能在这种盐胁迫条件下生存；3．外源DNA供体一红树、盐藻的DNA是采用CTAB法进行提取的，而我们选用的这一种红树的果实和盐藻是可以食用的，安全无毒；4．外源DNA导入材料的筛选方法简单易行，只需在一定的盐胁迫条件下种植，就可筛选到耐盐的植物。
国内外有一些导入单个基因提高植物耐盐性的报导，但没有看到通过这种方法得到转基因植物并能在海滩种植和用海水浇灌的报导，在国际上我们的研究工作是首创，1995年国家科委基础研究高技术司组织专家鉴定认为“耐盐豇豆分子育种技术的建立，这一成果在耐盐植物分子育种方面居国内外同类研究的先进水平”。
实施例一、耐盐茄子分子育种方法1．材料和方法1.1供体海岸植物红树(Rhizophora apiculata，红树科，乔木)受体日本富士紫长茄(Solanum melongena)1.2红树DNA的提取按照本实验室建立的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法进行，制得的DNA，紫外检测其A260/A280≥1.8，分子量约50Kb。
1.3外源DNA导入茄子的方法基本上按照周光宇的方法(Methods in Enzymology,1983,101:433-481)，略加改进。关键是需要摸索受体植物在自花授粉或人工授粉后导入外源DNA的最佳时间和方式，以保证一定的导入率。
1.4后代的耐盐性筛选导入外源DNA获得的当代种子称为D1代种子，用其培育的植株称为D1代植株，依次类推。种子先在盆中用淡土育苗，待株高约10-12cm，有5-6个叶片时，移至海滩地，生长稳定后，用海水直接浇灌。海滩地沙质土壤基础含盐量为0.3-0.4％,pH值为7.0-7.2，海水含盐量约2.5-3.0％。
1.5植株生长情况测定平均株高、存活率、叶面积、结实率、单株产量等。
1.6若干生理指标检测测定叶片的Na+、K+、Ca++含量、叶片蒸腾速率、光合速率、渗透势等。
1.7光镜、电镜观察2．结果2.1 DNA导入后的结实情况在茄子开花当天上午8-9时进行人工授粉，授粉后10-24小时导入外源DNA,132朵花获得78个果实，结实率为59.1％。果实与种子的形态特征与对照植株基本相同。
2.2若干生理生化特性变化对D1代植株叶片的蒸腾速率、光合速率、Na+含量进行了测定。在0.8％NaCl盐水浇灌条件下，白天的蒸腾速率、光合速率均比盐水浇灌和淡水浇灌的对照植株低。叶片的Na+含量，D1代植株比淡水对照植株高，但比盐水对照植株低24.4％，表明D1代植株通过降低蒸腾和光合作用速率，使叶片内的Na+含量下降，达到一定的拒盐能力。
2.3气孔开放特性对照植株在淡水和海水浇灌条件下，叶片的气孔在白天都是开放的。而D1代植株在海水浇灌下，在白天气孔却几乎全部关闭，这一特性对于降低蒸腾，减少水分损失是有作用的。
2.4后代植株的耐盐性在普通土壤地育苗，待幼苗长到10-12cm、5-6片叶片后，移植到海滩试验地，生长稳定后用海水浇灌。结果表明浇海水50天，对照植株死亡80％，仅有少数植株存活，虽有结实，但发育不正常；D1代植株在海水浇灌50天后，存活率达65％，株高和每株叶片数均比对照植株高，单株产量显著高于对照植株，D1代单株平均产量达到对照植株的2.4倍。
本试验结果表明，通过花粉管通道导入耐盐植物的DNA能够提高受体植物的耐盐性。这种耐盐性的提高与植物的气孔关闭、蒸腾、呼吸作用等一系列生理过程的改变有关。由于植物的耐盐机制十分复杂，这方面的工作有待进一步深入。
我们得到的导入红树DNA的茄子，D1代植株能种植在基础含盐量0.38％的海滩地，用含盐2.8％的海水浇灌50天后存活率高达65％。这充分表明D1代植株的耐盐能力明显增强，说明这种方法是一种有效的耐盐植物分子育种的方法。二、红树DNA导入辣椒及RAPD和SDS-PAGE分析以海岸耐盐植物红树Rhizophora apiculata，红树科，木本)作为供体，用相同的上述方法将红树DNA通过花粉管通道直接导入栽培辣椒，获得了耐盐能力明显增强的后代。在1∶3海水或含盐0.8％的条件下，约50％的后代植株能开花、结果，而普通蔬菜的生长极限盐度一般在0.06-0.2％之间。对该组合的受体、供体及转化后代进行随机扩增多态性分析(Random Amplified Polymorphic DNA，简称RAPD)，在近30个引物中，发现Operon K01(5’-CATTCGAGCC-3’)引物得到的后代(D2)扩增产物有一条1.1Kb的特异性DNA谱带，该谱带是受体中没有的，而与供体DNA的扩增产物的一条谱带相同。对导入外源DNA的后代和受体(对照)株的叶片可溶性蛋白质进行SDS-PAGE分析，发现在盐胁迫条件下，导入外源DNA的辣椒后代(D2)产生了一条新的17.5KD蛋白质谱带。经RAPD和SDS-PAGE分析，分别获得DNA特异谱带和新的蛋白质谱带，表明外源DNA已进入辣椒转化株的基因组。
权利要求
1．一种利用生物技术将外源DNA片段导入到作物体内的耐盐植物育种方法，其特征在于从耐盐性高的盐生植物红树、盐藻提取总DNA，经花粉管通道导入到包括蔬菜、水稻的作物中，经包括GUS基因表达检测、核酸RAPD分析、蛋白质SDS-PAGE检测，证明外源DNA导入后，在受体植物中能够表达；通过细胞学、生理学、遗传学分析，DNA导入后的受体植物发生了一定的变化，并能稳定遗传；进一步通过供体植物cDNA文库的建立，识别与分离有关耐盐基因。
2．按权利要求1所述的耐盐植物育种方法，其特征在于盐生植物红树、盐藻的总DNA片段导入到受体植物后，后代的筛选和培育技术，它是后代在一定的盐胁迫条件下筛选，选育出能在海滩种植、用1∶3海水或直接用海水浇灌，并能正常开花结实的高耐盐性植物。
全文摘要
本发明是利用一种新的外源DNA导入手段,提高受体植物的抗盐性,进而育成能在盐碱地生育的耐盐植物的育种方法。它是将盐生植物红树、盐藻的总DNA片段通过花粉管通道导入如豇豆、茄子、辣椒等蔬菜作物,经耐盐筛选和培育,首次得到能在海滩种植,可以用1∶3海水或直接用海水浇灌的茄子、辣椒。这是首创、快速有效的耐盐植物分子育种方法,表明通过DNA(基因)重组,受体植物可以获得DNA供体植物的某些特性。它具有显著的经济效益和社会效益。
文档编号C12N15/82GK1230593SQ9812168
公开日1999年10月6日 申请日期1998年12月1日 优先权日1998年12月1日
发明者林栖凤, 李冠一 申请人:海南大学