在盘基网柄菌属中表达促性腺素的制作方法

文档序号:452888阅读:239来源:国知局
专利名称:在盘基网柄菌属中表达促性腺素的制作方法
技术领域
本发明涉及在盘基网柄菌属(Dictyostelium)中表达的促性腺素或其突变体,含有它们的药物组合物,制备促性腺素的方法以及选择具有超兴奋剂或拮抗剂特性的促性腺素突变体的方法。
促性腺素形成结构相关的糖蛋白激素家族。典型的成员包括绒毛膜促性腺素(CG),促滤泡激素(FSH),促黄体素(LH)和促甲状腺激素(TSH)。大多数脊椎动物中都存在FSH,LH和TSH,它们是由脑垂体合成和分泌的。迄今为止仅在包括人的灵长类动物和马中发现由胎盘组织合成的CG。
这些激素是由普通α-亚单位和激素特异性的β-亚单位非共价结合形成的约30 KD的异二聚体蛋白质。
在种内,促性腺素家族每个成员的α-亚单位基本相同;在种间该α亚单位也是高度保守的。每个成员,即CG,FSH,TSH和LH的β-亚单位不同,但其结构具有相当高的同源性。另外,种与种之间的β亚单位也是高度保守的。人α亚单位由92个氨基酸残基组成,而每个成员的β亚单位大小不同hFSH为111个残基,hLH为121个残基,hTSH为118个残基,hCG为145个残基(Combarnous,Y.(1992),EndocrineReviews,13,670-691,Lustbader,J.W.等(1993),EndocrineReviews,14,291-311)。hCG的β亚单位比其它β亚单位都要大,因为前者的C-末端含有约34个额外的氨基酸,本文称之为羧基末端肽(CTP)。该CTP携有4个丝氨酸相连的寡糖。
促性腺素在包括代谢、温度调节和繁殖过程的多种身体功能中起着重要作用。例如,垂体促性腺素FSH在刺激滤泡发育和成熟方面起着关键作用,而LH可诱导排卵(Sharp,R.M.(1990),Clin Endocrinol.,33,787-807;Dorrington和Armstrong(1979),Recent Prog.Horm.Res.,35,301-342)。最近,将FSH单独或与LH联合应用于临床以刺激卵巢,即超刺激卵巢以进行体外受精(IVF)并诱导不育的不排卵妇女体内排卵(Insler,V.(1988),Int.J.Fertility,33,85-97,Navot和Rosenwaks(1988),J.Vitro Fert.Embryo Transfer,5,3-13)以及用于男性性腺机能减退。人绒毛膜促性腺素(hCG)参与受孕后早期妊娠的维持并具有重要的治疗作用。
异二聚体的两个亚单位呈现出很多保守的亚单位内二硫键α-亚单位中有5个二硫键,β-亚单位中有6个二硫键。在促性腺素家族所有成员中,相应的半胱氨酸残基是完全保守的。最新得到的hCG X-射线结构显示出这些二硫键涉及被称为二硫结的典型三维模式。
促性腺素具有3或4个可以是N-糖基化的天冬酰胺残基,所述残基对其构象和生物活性具有重要影响。另外,hCG的C-末端肽(CTP)在4个丝氨酸的位置可以是O-糖基化的。糖基化CTP的主要作用似乎是延长hCG的循环半寿期。
糖蛋白激素的生物合成是十分复杂的过程。在过去的十年里,人们逐渐清楚地意识到促性腺素的折叠、装配和分泌是由内质网和高尔基体中存在的很多套伴侣分子和折叠酶辅助完成的。由于α-亚单位和β-亚单位都含有所谓的胱氨酸-结,预期蛋白质二硫化物异构酶在促进折叠的过程中起着关键性的作用。另外,已证明hCG的适当折叠、二硫键的形成和分泌需要N-联寡糖侧链(Feng,W.等(1995),生物化学杂志,270,11851-11859)。两个亚单位成功装配成二聚体是二聚体生物活性所必需的。
异二聚体糖蛋白激素功能决定簇的阐明经常被突变对亚单位装配的不希望有的次要作用所阻碍。为了促进结构/功能分析研究,产生了突变体,其中hCGβ-亚单位和共有的α-亚单位的编码区经由肽间隔区或亚单位间二硫键连接。已阐明hCG共价相连的α-和β-亚单位能折叠成具有生物活性的构象。
已在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达了促性腺素,其重组衍生物具有与天然激素差不多的生物活性(Olijve,W.等(1996),Mol.Hum.Reprod.2,371-382)。这表明这些宿主细胞含有装配hCGα-和β-亚单位和进行所有的翻译后修饰所必需的所有伴侣分子和折叠酶,所述修饰是完整的生物活性所必需的。另外,已证实CHO细胞和定点诱变的联合使用是阐明糖蛋白激素中功能决定簇(Puett,D.等H.(1994),糖蛋白激素(Lustbader,J.W.,Puett,D & Ruddon,R.W.编),p59-82,Springer-Verlag,纽约)和设计这些激素潜在的新治疗类似物的有利工具(Fares,F.A.等(1992),Proc Natl Acad SciUSA 89,4304-4308)。
不幸的是,使用如CHO细胞的哺乳动物细胞表达人促性腺素受到一些限制。因此,不可能产生研究所必需的涉及蛋白质结构域随机诱变的大量转化子。蛋白质中选定结构域的随机诱变是鉴定受体结合和生物活性的结构决定簇的有利工具。另外,使用CHO细胞是昂贵的和费力的。因此,需要在更易于生长的表达宿主中表达促性腺素。
得自低等生物的宿主细胞可能符合上述需求,但预期促性腺素的复杂折叠会妨碍这种复杂的重组蛋白的适当表达和分泌。
目前,我们出乎意料地发现盘基网柄菌属能产生高度复杂的糖蛋白激素。
土壤变形虫Dictyostelium discoideum是另一种能异源表达人糖蛋白激素的有吸引力的生物。它象糖酵母一样易于培养和转化,同时又具有类似于哺乳动物细胞的一些复杂特征,如糖基化和趋化性。另外,最近的研究表明盘基网柄菌属可为随机诱变方法提供有用的系统。
然而,已发现盘基网柄菌属产生的蛋白质与CHO细胞产生的蛋白质相比,它们的糖基化是有区别的。已知糖基化对激素功能起着重要作用,而大多数糖基化是由盘基网柄菌属进行的,半乳糖、N-乙酰半乳糖胺或唾液酸不与寡糖侧链结合(Slade,M.等(1997),Biotech.Genet.Eng.Rev,14,1-35)。尽管翻译后的修饰与高等真核生物的不同,但盘基网柄菌属产生的促性腺素也是有生物活性的。已发现该蛋白质能与其受体结合并刺激表达人LH/CG受体的细胞产生cAMP。
所表达的糖蛋白的不均一性大大降低,产生更加均一的同工激素制品。因此,相对于更复杂的由CHO产生的促性腺素而言,由盘基网柄菌属产生的促性腺素的化学定义更完善。这对维持和分析证实批与批之间的一致性较为有利。由于糖基化是促性腺素的体内半寿期的很重要的决定因素,在盘基网柄菌属中产生促性腺素提供了产生具有较确定的体内半寿期的未突变促性腺素的工具。另外,将盘基网柄菌属中的表达与蛋白质工程联合便于产生几个临床应用所用的特制促性腺素。
由于两个亚单位复杂的分子间和分子内折叠,大量二硫键,二硫结和翻译后修饰的存在,很显然盘基网柄菌属可表达活性促性腺素,根据本发明可以制备适当折叠的分子。在功能性促性腺素的折叠和成熟过程中,适当二硫键的形成是至关重要的事件。β亚单位中的二硫键形成尤其重要所有二硫键都是有效连接和折叠所需的。对hCG折叠的详细研究揭示出分子的折叠不是通过简单的连续途径进行,而是在分子的不同结构域独立地进行。因此,据认为低等生物的细胞不能分泌适当折叠的促性腺素。
本发明提供了由盘基网柄菌属表达的促性腺素。
使用已被深入研究的Dictyostelium discoideum是有利的。营养期的变形虫在纯性培养物中或革兰氏阴性细菌上都能容易地和便宜地生长。另外,已描述了几个能介导外源蛋白质表达的转化载体。
本发明的促性腺素可以是二聚体,即由两个非共价结合的亚单位组成。优选促性腺素是hCG或FSH。然而,促性腺素可含有本领域已知的修饰。
在本发明促性腺素的一个优选的修饰中,一个亚单位氨基酸序列的C-末端任选通过接头组成成分与另一个亚单位氨基酸序列的N-末端相连。优选接头组成成分是完整的或部分的CTP单位或其变体,或是重复的寡肽,如5次重复的Ser-Gly肽。
本发明促性腺素的另一个修饰是用完整的或部分的CTP单位或其变体延伸α和/或β亚单位各自的N-或C-末端。延伸可含有单一或多倍形式的各个CTP单位。或者,可将完整的CTP单位或部分CTP单位或其多倍形式插入所述亚单位的N-或C-末端。另一个修饰是导入一个或多个非天然的二硫键。
另外,本发明的促性腺素可以是糖基化的或部分糖基化的。通过定点诱变可得到本发明的部分糖基化的促性腺素,所述定点诱变除去了促性腺素中的一个或多个糖基化识别位点。或者,可通过导入其它的糖基化识别位点,和任选除去一个或多个糖基化识别位点来修饰本发明促性腺素的糖基化模式,导致所述促性腺素的被修饰的糖基化。本文所用的一个糖基化识别位点由氨基酸序列Asn-X-Ser/Thr组成,其中X可以是任何氨基酸。
本文所用的CG,FSH,LH和TSH的α和β亚单位以及异二聚体形式的定义一般是其常规的定义,指的是本身具有本领域已知的氨基酸序列的蛋白质或其等位基因变体,而不论其表现出的糖基化模式如何。
这些蛋白质的“天然”形式是具有分离自相关脊椎动物组织的氨基酸序列且本身具有这些已知序列的蛋白质,或其等位基因变体。
这些“变体”指的是相对于天然蛋白质而言,其氨基酸序列具有故意的改变的蛋白质。改变可包括单个或多个缺失,插入,取代及其组合,可通过例如位点特异性诱变产生这些改变。
本文所用的“CTP单位”指的是存在于hCGβ亚单位羧基末端,从C末端的氨基酸112-118延伸至残基145的氨基酸序列,或其部分。根据CTP的N-末端,“完整的”CTP单位含有28-34个氨基酸。“部分”CTP单位是第112-118至145(包括端点值)位出现的氨基酸序列,但它从可能的最短的完整CTP单位(氨基酸118-145)中缺失了至少一个氨基酸。“多个”CTP单位被理解为包含完整CTP单位或部分CTP单位或两者组合的串联排列。
构建本发明的促性腺素基因的方法是本领域技术人员众所周知的(Sambrook等,分子克隆实验室手册,冷泉港实验室出版社,冷泉港,最新版)。目前,有关定点诱变,连接另外的序列,PCR和构建适当表达系统的技术都是本领域技术人员众所周知的。可使用标准的固相技术合成构建编码所需蛋白质的部分或全部DNA,优选在其中包括限制性位点以易于连接。可为DNA编码序列提供用于所包含编码序列的转录和翻译的适当控制元件。
本发明还提供了在盘基网柄菌属中表达促性腺素或其变体的方法。本发明的所述方法包括下列步骤-用含有编码促性腺素基因或突变基因的DNA序列的重组质粒载体转化盘基网柄菌属菌株,所述DNA序列受盘基网柄菌属调节序列的控制,-在允许所述DNA序列表达的条件下培养重组菌株,以及-分离所表达的蛋白质。
优选所表达的蛋白质是单链蛋白质,即亚单位通过间隔分子共价相连。更优选促性腺素是单链的hCG。
本发明的另一方面提供了易于筛选突变的促性腺素的方法。所述方法包括-随机诱变促性腺素基因-将突变基因插入盘基网柄菌属质粒载体-用所述重组质粒载体转化盘基网柄菌属菌株-在允许DNA序列表达的条件下培养克隆-测定受体结合/信号转导的比率和-分离比率与野生型促性腺素的比率不同的克隆。
优选突变的促性腺素显示出与天然蛋白质与其受体结合相等的受体结合。更优选突变蛋白质与其受体的亲和性高于其天然的对应物。信号转导至少应比天然蛋白质高或低2倍。优选信号转导的差异相当于系数10。
表现出高比率的蛋白质可用作拮抗剂,而低比率的蛋白质可用作超级激动剂。
测定受体结合的方法以及测定促性腺素生物活性的体外和体内试验是众所周知的。
随机诱变无需对完整的促性腺素基因进行,而只需对单个亚单位基因或明确限定的区域,如决定簇环进行。
为了在促性腺素基因中导入随机的点突变,可使用Taq DNA聚合酶扩增所需的区域。由于Taq DNA聚合酶缺乏3’→5’核酸外切编辑活性,该酶是易错DNA聚合酶,所测定的错误比率为每个合成的核苷酸10-5-10-4个错误。因此,在基本上标准的反应条件下使用Taq DNA聚合酶进行PCR可导入突变(Zhou,Y.等(1991),核酸研究,19,52)。然而,使用这些条件的突变频率对于诱变较大的序列而言是足够的,但对于小的DNA片断(<500bp)来说却不够。加入Mn2+和使用较高浓度的dNTP和Mg2+会使Taq DNA聚合酶出错误的机会增加(Leungh,D.W.等(1989),技术1,1-15)。调节突变频率,同时也会提供影响突变类型的机会的另一种方法是联合使用dITP和有限量的4种dNTPs之一(Spee,J.H.等(1993),核酸研究,21,777-778)。为了诱变短的靶DNA(<50bp),使用简并的寡核苷酸似乎是可行的方法(Kirchhoff,F.和Desrosiers,R.C.(1996),分子生物学方法,57,323-333)。通常,此方法有四个步骤。第一步,通过(经改良的)PCR扩增所需区域。第二步,用切割所需DNA序列两端的一对限制性内切核酸酶消化扩增的DNA。第三步,将含有所需DNA序列的DNA片断与经限制性内切核酸酶消化的载体DNA连接。第四步,通过转化或电穿孔将所得的重组DNA分子导入细胞。
编码本发明任一促性腺素的DNA载体也包括在本发明的范围中。通过将编码天然促性腺素或其变体的DNA与含有盘基网柄菌属调节序列的DNA可操作地相连可得到本发明的DNA载体。任选地,这些载体也可含有含复制起点和/或便于染色体外复制的多肽编码序列的区域。该载体的优点是可在盘基网柄菌属宿主细胞中进行染色体外复制。
如上文所解释的,根据突变位点的不同,本发明的促性腺素变体可以是激动剂或拮抗剂。突变位点可导致分子构象发生微妙的变化。例如,如果在与受体结合和/或信号转导相关的蛋白质部位选择突变位点,本发明的分泌蛋白质可导致信号转导活性的部分或完全丧失。这种保留了受体结合特性的经改变的促性腺素可用作拮抗剂。也可选择具有改善的结合和信号转导活性的促性腺素。
本发明的激动剂促性腺素可用于与天然促性腺素相同的临床目的。另外,该蛋白质可用作诊断工具以检测生物样品中与天然蛋白质相关的抗体存在与否。它们也可用作检测试剂盒中的对照试剂以评估多种样品中的促性腺素激素水平。拮抗剂可用于例如治疗促性腺素依赖型肿瘤;LH/hCG拮抗剂在控制卵巢超刺激的过程中可预防LH波动,FSH拮抗剂可用于男性避孕。
本发明的适当的药物组合物含有一种或多种本发明的促性腺素和药物可接受的载体。
药物可接受的载体是本领域技术人员众所周知的,包括例如无菌盐水,乳糖,蔗糖,磷酸钙,明胶,糊精,琼脂,果胶,花生油,橄榄油,芝麻油和水。
另外,本发明的药物组合物可含有一种或多种稳定剂,例如包括山梨糖醇,甘露醇,淀粉,蔗糖糊精和葡萄糖的碳水化合物,如白蛋白或酪蛋白的蛋白质和如碱性磷酸盐的缓冲液。
适当的给药途径是肌内注射,皮下注射,静脉内注射或腹膜内注射,口服和鼻内给药。
下列实施例阐明了本发明,但不应将其解释为以任何方式限制本发明的范围。


图1质粒和克隆策略。(1A)质粒MB12n和MB12n/PsA的图谱。两个质粒都由4个主要的片断组成,含有大肠杆菌维持序列(bluescript),受Dd启动子控制的杀稻瘟素抗性基因(BSR),具有Dd启动子(act15)和终止子(2H3)的克隆盒,和用于盘基网柄菌属染色体外维持的序列(G4/D5,G5/D6)。MB12n/PsA含有插入MB12n唯一的BglII位点的PsA接头序列(表1)。(1B)JV158的克隆图。所用寡核苷酸由水平箭头表示。寡核苷酸b20aarev中所示的xxx表示已进行了序列取代使序列最优化以成为盘基网柄菌属偏爱的密码子。(1C)JV10PSA的克隆图。所有的寡核苷酸序列示于表1。
图2野生型hLH、hCG和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或Dictyosteliumdiscoideum(Dd)产生的单链hCG(sc hCG)与稳定表达人LH/CG受体的CHO细胞膜的结合活性。在有或没有多种浓度未标记的野生型hLH,hCG或单链hCG的条件下,将膜与经125I-标记的hCG保温。置换曲线被表示为每个剂量的未标记激素的最大结合的百分比。
图3野生型hLH、hCG和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或Dictyosteliumdiscoideum(Dd)产生的单链hCG(sc hCG)的体外生物活性。刺激稳定表达人LH/CG受体的CHO细胞之后,通过特异性的RIA测定细胞外的cAMP。
图4中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或Dictyostelium discoideum(Dd)产生的野生型hCG的体外生物活性。37℃保温4小时并刺激稳定表达人LH/CG受体和报道基因构建体的CHO细胞之后,测定萤光素酶的产生。
图5中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或Dictyostelium discoideum(Dd)产生的野生型FSH的体外生物活性。37℃保温4小时并刺激稳定表达人FSH受体和报道基因构建体的CHO细胞之后,测定萤光素酶的产生。
图6得自CHO细胞的野生型hCG和Dictyostelium discoideum(Dd)产生的选定hCG突变体的体外生物活性。37℃保温4小时并刺激稳定表达人LH/CG受体和报道基因构建体的CHO细胞之后,测定萤光素酶的产生。
实施例实施例1设计表达构建体一个促性腺素突变体被选择用于在盘基网柄菌属中表达,该突变体由通过含有5个Ser-Gly重复的肽十聚体与仅缺乏C-末端肽的β-链连接的一个十分完整的α-亚单位组成。
产生了两个构建体,它们的前导序列有所不同。第一个含有hCGβ-亚单位的天然前导序列。为了杜绝因大量(在hCG β-亚单位中约为40%)不常用密码子的存在可能导致的mRNA翻译问题,改变编码序列的前30个碱基使其成为盘基网柄菌属偏爱使用的密码子。为了构建第二个构建体,据认为在不同物种之间,参与哺乳动物细胞经由ER和高尔基体的分泌途径的蛋白质可能不是保守的。为了便于在盘基网柄菌属中运输,用盘基网柄菌属糖蛋白,即通过质膜运输的前孢子蛋白质A(PsA)的前导肽替换人β-亚单位的前导肽。以前曾用此前导肽表达过分泌的异源蛋白质(Dittrich,W.等(1994),Bio/Technology 12,614-618)。
表达载体被称为JV158(与β-亚单位前导肽相适应的密码子)和JV10PSA(具有PsA前导肽),它们衍生自MB12n。
MB12n是在染色体外维持的8.25kb Dictyostelium discoideum(Dd)质粒,在Dd启动子和终止子之间含有唯一的限制性位点。MB12n由p155d1(Hughes,J.E.等(1994)分子细胞生物学,14,6117-6124)中含有Dd复制起点和复制所需的两个Dd基因(G4/D5和G5/D6)的2.9kb片断(ClaI-HincII部分消化的片断),pBluescript(Strategene)中用于在大肠杆菌中增殖的2.95kb片断,在Dd Actine 15启动子和Dd Actin 8终止子之间含有杀稻瘟素抗性基因的1.35kb片断(得自pBsr2,Sutoh,K.(1993),质粒30,150-154),和含有Dd Actin15启动子、唯一的BglII限制性位点和Dd 2H3终止子的1.05 kb克隆盒(得自BS18.2H3,Kumagai A.等(1989)细胞57,265-275)组成。通过诱变除去杀稻瘟素抗性基因中的BglII位点。图1A显示出MB12n中这些组分的相对位置。质粒MB12n/PsA含有编码19个氨基酸长的PsA前导肽的接头序列(Early,E.A.等(1988)分子细胞生物学,8 3458-3466;Dittrich等(1994)Bio/Technology 12,614-618),该序列被克隆于唯一的BglII位点。质粒在PsA序列的3’部分具有唯一的NdeI位点,在2H3终止子的5’部分具有唯一的BglII位点以便于“框内”定向克隆。在克隆的过程中除去了与Dd Actin 15启动子相邻的BglII位点(见表1)。
使用引物b20aarev和alphater(表1),通过PCR由含有hCG突变体1[β-(1-111)-(Ser-Gly)5-α-(1-92)]的质粒(Heikoop,J.C.等(1997),欧洲生物化学杂志,245,656-662)扩增单链hCG。用BglII消化后,将所得片断克隆至MB12n中。引物b20aarev被设计为使β链的前10个氨基酸最优化,使其成为盘基网柄菌属偏爱使用的密码子。用引物bmature(表1)和alphater扩增相同的模板以产生产物,用NdeI和BglII消化之后克隆至MB12n/PsA。所得质粒分别被称为JSV158和JV10PSA(见图1B和1C)。使用下列循环参数,用Expand HighFidelity(Boehringer Mannheim)系统进行PCR94℃变性3分钟,然后94℃30秒,37℃30秒和72℃60秒共25轮循环。通过凝胶电泳分离PCR产物,切下并用Qiaex II(Qiagen)纯化,然后进行限制性消化和克隆。通过双脱氧测序分析并证实所有的DNA序列。
表1寡核苷酸和PsA接头的DNA序列。PsA序列也显示出PsA前导肽的序列以及唯一的限制性位点BglII和NdeI。
Oligo ID序列PsA(BglII) NdeI BglIIagatcatgaa attccaacat acatttattg cattattatc actattaaca tatgcaaatg cagatctM K F Q H T F I A L L S L L T Y A N Ab20aarevgcagatctat ggagatgttc caaggtctcc tccttttatt actcctcagc atgggtggtacatgggcatc caagalphaterccagatctaa acatttaaga tttgtgbmaturegctatcgaca tatgcaaatg catccaagga gccgcttcg实施例2在盘基网柄菌属中表达单链hCG电穿孔之前,在纯种培养基中将盘基网柄菌属菌株AX3培养至密度为2×106个细胞/ml。使用1微克质粒DNA电穿孔107个细胞,电穿孔的条件基本上如文献所述(Mann S.K.O.等(1994)细胞生物学实验室手册,J.E.Celis编,Academic出版社,Vol 1,pp412-452)。
用质粒JV158和JV10PSA以及MB12n对照质粒转化盘基网柄菌属。电穿孔之后,将一个小池中的细胞接种于10cm平板上。电穿孔之后12小时,加入杀稻瘟素至终浓度为5μg/ml。电穿孔之后24小时,吸出含有死细胞的培养基,通过吸移到含杀稻瘟素的培养基中以重新悬浮细胞,将细胞分布于96孔微滴板的24个孔中。将24个孔各连续稀释10,100和1000倍。每3天换1次含杀稻瘟素的培养基。接种后5至9天鉴定阳性孔,由稀释系列估计转化频率。每微克DNA一般可得到1×104至6×104个集落。然后选择单个孔用于进一步的实验。单个孔含有200微升培养基,足以进行与hCG有100%交叉反应性的DELFIAhLH试验。该试验是以直接的夹心技术为基础的,其中固定了针对β-亚单位上特异性抗原位点的单克隆抗体。完整的(单链)hCG与固相抗体结合之后,结合并定量经铕标记的针对α-亚单位上特异性抗原位点的抗体。按厂商(Wallac Oy,Turku,芬兰)的描述进行试验。
结果清楚地表明两个表达构建体而不是对照质粒产生了具有免疫活性的单链hCG。另外,JV158产生的单链hCG的量(267 mU/ml)看上去比JV10PSA产生的量(4.9 mU/ml)高很多,这表明此时人β-hCG前导肽比PsA中的盘基网柄菌属前导肽更加有效。
对经JV158转化的细胞的单链hCG产生的动力学进行研究。将不同密度的经转化细胞接种于含纯种培养基的平板中,培养至铺满并维持几天,不用换培养基。每24小时取出等量的培养基,分析其中单链hCG的存在。细胞达到铺满后的4至5天,表达水平达到最高(数据未显示)。由于达到铺满后约6至7天细胞开始从平板上脱离,故在达到铺满后的第5天收获培养基。实施例3盘基网柄菌属中表达的单链hCG的活性通过用异二聚体hCG进行竞争性结合试验以测定盘基网柄菌属单链hCG与人LH/CG受体结合的能力。将表达人LH/CG受体的CHO细胞(Jia,X.-C.等(1991),Mol.Endocrinol,5,759-768)同时与125I-hCG和盘基网柄菌属细胞培养物上清液的纯化物质保温。
对分离自指数生长细胞的膜组分进行放射性配体受体置换试验以定量检测纯化的单链hCG的受体结合活性。室温下,在总体积为0.5ml的缓冲液(最终组成为10mM Tris-HCl,5mM MgCl2,0.1%牛血清白蛋白,pH7.4)中,将固定量的膜蛋白与125I-hCG(20,000cpm,约12pM)和量逐渐增加的竞争蛋白质一起保温18小时。经125I-标记的hCG(NEX-106)得自Du Pont de Nemours。特异性结合是所加入的总放射性的10-12%。保温后通过离心分离结合的和游离的激素。将高度纯化的、重组的促性腺素用作标准物。
为了纯化盘基网柄菌属细胞培养物中的hCG,从大(22×22cm)培养板中收获培养基。借助于使用对照和层析超分辨系统UNICORN(Pharmacia,Roosendaal,荷兰)的可编程FPLC系统(Pharmacia,Roosendaal,荷兰)进行纯化。联合使用疏水作用和用LH/CGβ-亚单位特异性的单克隆抗体进行的免疫层析来纯化单链hCG。为此,产生了150ml培养基,经DELFIA测定出其中的单链hCG含量为0.372个单位/ml。使用此培养基得到约3个单位纯化的单链hCG(得率约为5%)。所有步骤都在4℃进行。
与多种浓度的野生型hCG、野生型hLH或单链hCG的共保温以依赖于剂量的方式置换125I-hCG结合(图2)。置换曲线表明由盘基网柄菌属产生的物质实际上能与人LH/CG受体结合。对受体的亲和性与CHO细胞产生的单链hCG的亲和性差不多,与hCG异二聚体相比,后者置换125I-hCG结合的效力差得多。因此,与CHO细胞相比,由盘基网柄菌属产生的单链hCG的结合能力没有什么显著差别。
通过检查其刺激表达人LH/CG受体的CHO细胞中cAMP产生的能力,分析盘基网柄菌属产生的单链hCG的生物活性。在0.1mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的存在下,将细胞与浓度渐增的激素保温4小时。通过RIA(Immunotech)测定细胞外的cAMP。
结果表明由盘基网柄菌属产生的单链hCG实际上能激活人LH/CG受体,导致cAMP的产生。与CHO细胞中产生的物质相比,由盘基网柄菌属产生的单链hCG的效力仅稍有差别(IC50值约低5倍)。实施例4异二聚体hCG在盘基网柄菌属中的表达及生物活性我们的目标是在盘基网柄菌属中表达异二聚体hCG。为了表达hCG的α-和β-亚单位,产生了两个质粒。它们的结构和全部组成与实施例1中描述的MB12n基本上相同。为了便于在Dd中表达两个独立的质粒,我们用p155d1(Hughes,J.E.等(1994),分子细胞生物学,14,6117-6124)中含有新霉素盒的2.4kb KpnI-XbaI片断取代MB12n中的杀稻瘟素抗性盒,产生了MB12neo。为了构建α亚单位的表达载体,使用在片断的5’和3’末端都导入BglII限制性位点的引物,经PCR产生其天然的cDNA序列,以使其能被克隆至MB12neo中。为了构建hCGβ-亚单位的表达载体,修饰MB12n以使BglII克隆位点的3’端含有另一个唯一的限制性位点(SphI)[见实施例1]。使用导致编码序列的前30个碱基发生变化而成为盘基网柄菌属偏爱使用的密码子的5’引物扩增hCGβ-亚单位的cDNA[见实施例1]。引物还在片断的5’(BglII)和3’(SphI)末端导入了适当的限制性位点以便于定向克隆。
同时用两个表达质粒转化盘基网柄菌属。转化后,将细胞铺于培养板中进行克隆稀释。然后选择克隆的转化子,继续培养供分析时用。使用与hCG有100%交叉反应性的DELFIAhLH试验(Wallac Oy,Turku,芬兰),按厂商的描述测定盘基网柄菌属分泌的hCG的量。结果清楚地表明具有免疫活性的hCG实际上是由盘基网柄菌属产生的。
尽管通过表位检测的方式证明了培养基中异二聚体hCG的存在,仍必需进行其它实验以确定由盘基网柄菌属产生的hCG是否具有生物活性。定量检测是以免疫-反应性为基础的。通过在萤光素酶报道分子试验中检查其激活人LH/CG受体的能力来分析由盘基网柄菌属产生的异二聚体hCG的生物活性。结果表明由盘基网柄菌属产生的异二聚体hCG实际上能激活人LH/CG受体(图4)。另外,其生物活性与CHO细胞产生的野生型hCG的生物活性差不多(IC50值约高2倍)。实施例5异二聚体FSH在盘基网柄菌属中的表达及生物活性为了研究盘基网柄菌属是否也能产生其它复杂的糖蛋白激素,我们研究了该生物中FSH的产生。根据hCG所用的策略(实施例4),产生两个表达质粒。为了构建FSHβ-亚单位的表达载体,使用导致编码序列的前27个碱基发生变化而成为盘基网柄菌属偏爱使用的密码子的5’引物扩增cDNA,按与hCGβ-亚单位相同的方法进行克隆。转化盘基网柄菌属后,将细胞铺于培养板中进行克隆稀释。然后选择克隆的转化子,继续培养供分析时用。
通过夹心免疫测定法[SS-artikel]测定盘基网柄菌属分泌的FSH的量。结果表明免疫活性的FSH是由盘基网柄菌属产生的。另外,由盘基网柄菌属产生的异二聚体FSH也能激活人FSH受体(图5)。实施例6在盘基网柄菌属中随机诱变hCG的选定区域由于我们已证实盘基网柄菌属能产生生物活性的促性腺素,我们的目的是开发随机诱变的方法。为此,我们选择hCG决定簇环中的两个氨基酸,已经证实这两个氨基酸参与受体结合和信号转导。
通过位点特异性诱变并按上述使用标准的PCR条件组合序列重叠的PCR片断以导入特异性的碱基取代。引物被设计为改变了hCGβ-亚单位的氨基酸94和95。两个密码子的前两个核苷酸的变化完全是随机的(A,C,T或G),而第三个碱基仅限为G或T以使导入的终止密码子的百分比最小。分离PCR片断,将其亚克隆至pCR2.1(Invitrogen,Leek,The Netherlands)。选择引物以使亚克隆的PCR片断的5’末端含有BglII位点,3’末端含有SphI位点。PCR和克隆之后,用pCR2.1构建体的集合物转化大肠杆菌。随后,从200个转化子的集合物中分离DNA,经限制性消化之后,将BglII/SphI突变的片断亚克隆至含有BglII和SphI位点的MB12n中。将含有随机突变片断的MB12质粒的大肠杆菌转化子铺平板之后,收集400个菌落并制备DNA。
通过电穿孔同时用α-亚单位的表达载体转化盘基网柄菌属。电穿孔之后5小时,用杀稻瘟素(10μg/ml)进行选择。第2天,在96孔培养板中使用4倍稀释对细胞进行克隆稀释并启动新霉素选择(10μg/ml)。每3-4天更换1次培养基,保持选择条件不变。电穿孔后11-14天鉴定阳性孔,由稀释系列估计转化效力。用1微克hCGα和hCGβ载体电穿孔107个细胞一般可得到约500个转化子。然后选择单个孔用于进一步的实验。单个孔含有200微升培养基。从大(22×22cm)培养板中收获纯化用的较大量的培养基。
分析85个盘基网柄菌属克隆的上清液中免疫活性和生物活性的存在。作为对照,96孔培养板中存在几个产生野生型hCG的克隆和未经转化的盘基网柄菌属克隆。使用与hCG有100%交叉反应性的DELFIAhLH试验(Wallac Oy,Turku,芬兰)测定野生型和突变的hCG的浓度。随后,测定对人LH/CG受体的体外生物活性。分析过的85个突变体中的一半显示出B/I比例在0.35-1.05之间变化。考虑到2次单独分析的偏差,可以认为这些突变体的活性与野生型hCG差不多。约40%的突变体显示出降低的B/I比例。这是能够预期的,因为已证明突变的氨基酸94和95参与受体结合和激活。11个克隆之所以未显示出任何hCG产生可能是因为改变的氨基酸受突变β-多肽的适当折叠和/或与α-亚单位的结合的干扰,或不是所有克隆都同时含有α-和β-亚单位表达构建体的缘故。选择20个B/I比例不同的克隆以进行详细的分析。
在6孔培养板中进一步培养选择的克隆直至铺满,4天后收集细胞培养物上清液。20个克隆中有4个不产生任何可测的hCG。这与初次筛选出的克隆的结果一致。在其它克隆中,所产生的hCG的量也变化很大(116-2118mU/ml)。分析细胞培养物上清液中一定浓度范围的hCG的体外生物活性的存在。当更详细地分析时,显示出的B/I比例位于初次筛选的野生型hCG范围之内的所有突变体也显示出野生型的体外生物活性。未显示出任何免疫活性的4个上清液也不能激活LH/CG受体。因此,我们得出结论这些克隆不产生任何hCG。另外,在初次筛选时B/I比例降低的所有突变体实际上都显示出明显的IC50增加。它们的B/I比例比盘基网柄菌属产生的野生型hCG低2倍至>100倍。8个突变体的剂量/反应曲线示于图6。
为了使观察到的生物活性与β-亚单位中存在的突变相联系,测序突变的表达载体。从选定的盘基网柄菌属克隆中分离总DNA,并用此DNA转化大肠杆菌。对每个盘基网柄菌属克隆而言,通过菌落-PCR分析大量转化子中α-亚单位质粒或β-亚单位质粒的存在。随后,从含有β-亚单位质粒的几个转化子中分离DNA,使用自动化的测序仪(Pharmacia)对突变的区域进行序列分析。
因此,大多数盘基网柄菌属克隆在hCGβ表达载体中仅含有1种类型的突变。这些克隆产生单一类型的突变体。另外,我们的结论是所分析的大多数盘基网柄菌属克隆在β-亚单位的第94和95位含有不相关的序列,这表明诱变实际上是随机的。实施例7得自Dictyostelium discoideum的rec hCG的质谱分析通过随后的疏水作用层析和使用与LH和hCG共有表位反应的MoAb119A进行的免疫层析从培养物上清液中分离盘基网柄菌属产生的重组hCG。将抗体固定于NHS-Sepharose上。将经酸洗脱的纯化rec hCG对着50%乙腈透析并冻干。将蛋白质溶解于0.1%的TFA中,使用superDHB作为基质,用MALDI-TOF进行质谱分析。将由CHO细胞产生并用相同的纯化方法分离的纯的rec hCG用作参照。
盘基网柄菌属物质的α-和β-亚单位的分子量比得自CHO细胞的相应亚单位的低,盘基网柄菌属亚单位的峰中位值为11578和17351 D,而CHO多肽的相应值为14013和23284 D。这一观察结果表明盘基网柄菌属产生的激素上存在较少和/或较短的碳水化合物链。另外,相应亚单位的峰宽有很大不同,即盘基网柄菌属α-为11110-12452 D(1342D),而CHOα-链为12959-15591 D(2632 D),盘基网柄菌属β-为17006-18104D(1098 D),而CHO β-链为20674-25208 D(4534 D)。这表明盘基网柄菌属产物的糖基化较为简单。
序列表(1)一般资料(i)申请人(A)名称AKZO NOBEL N.V.
(B)街道Velperweg 76(C)城市Arnhem(E)国家荷兰(F)邮政编码(ZIP)6824 BM(G)电话0412 666379(H)电传0412 650592(ii)发明题目在盘基网柄菌属中表达促性腺素(iii)序列数5(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC可兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0,Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度67个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置6..62(xi)序列描述SEQ ID NO1AGATC ATG AAA TTC CAA CAT ACA TTT ATT GCA TTA TTA TCA CTA TTA47Met Lys Phe Gln His Thr Phe Ile Ala Leu Leu Ser Leu Leu1 5 10ACA TAT GCA AAT GCA GATCT67Thr Tyr Ala Asn Ala15(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度19个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Lys Phe Gln His Thr Phe Ile Ala Leu Leu Ser Leu Leu Thr Tyr1 5 10 15Ala Asn Ala(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特征(A)长度74个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3GCAGATCTAT GGAGATGTTC CAAGGTCTCC TCCTTTTATT ACTCCTCAGC ATGGGTGGTA60CATGGGCATC CAAG 74(2)SEQ ID NO4的资料(i)序列特征(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4CCAGATCTAA ACATTTAAGA TTTGTG 26(2)SEQ ID NO5的资料(i)序列特征(A)长度39个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5GCTATCGACA TATGCAAATG CATCCAAGGA GCCGCTTCG 39
权利要求
1.可以通过在盘基网柄菌属宿主中进行异源表达而得到的促性腺素或其突变体。
2.权利要求1的突变的促性腺素,其特征在于亚单位是共价连接的。
3.权利要求1或2的促性腺素,其用作治疗物质。
4.权利要求1至3中任一项的促性腺素,其特征在于所述促性腺素是hCG或FSH。
5.含有权利要求1或2的促性腺素和药物可接受的载体的药物组合物。
6.产生促性腺素或其突变体的方法,所述方法包括下列步骤-用含有编码促性腺素基因或突变基因的DNA序列的重组质粒载体转化盘基网柄菌属菌株,所述DNA序列受盘基网柄菌属调节序列的控制,-在允许所述DNA序列表达的条件下培养重组菌株,以及-分离所表达的蛋白质。
7.选择具有超级激动剂或拮抗剂特性的促性腺素突变体的方法,所述方法包括下列步骤-随机诱变促性腺素基因-将突变基因插入盘基网柄菌属质粒载体-用所述重组质粒载体转化盘基网柄菌属菌株-在允许DNA序列表达的条件下培养克隆-测定所表达蛋白质的受体结合/信号转导比率-分离比率与野生型促性腺素的比率不同的克隆。
全文摘要
本发明涉及在盘基网柄菌属中表达的促性腺素。发现促性腺素以生物活性形式被分泌。促性腺素在盘基网柄菌属中的表达为选择促性腺素突变体提供了简单的方法。
文档编号C12N15/09GK1269834SQ98808921
公开日2000年10月11日 申请日期1998年9月2日 优先权日1997年9月8日
发明者P·D·J·格鲁坦辉斯, J·C·海库普, M·H·K·林斯肯斯, P·J·M·范哈斯特特, M·布劳 申请人:阿克佐诺贝尔公司
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