核雄性不育植物及其生产方法与恢复可育性的方法

专利名称：：核雄性不育植物及其生产方法与恢复可育性的方法发明所属领域本申请涉及通过用重组DNA转化植物赋予其核雄性不育性，以及在雄性不育系中恢复可育性的方法。不同植物种类的杂交品种的开发依赖于实现亲本间近于全部异花授粉的能力。最简单的方法是通过手工除去花药，或者通过化学或遗传学方法在一个亲本中使用阻止花药和／或花粉发育的细胞质或核基因，从而赋予亲本株系之一雄性不育性，即使其处于无花粉或花粉无功能的状态。对于种子是所收获的产品的杂交植物(如玉米、小麦、籽用油菜)，还必须保证杂交植物的可育性得到恢复。在雄性不育处于遗传控制下的系统内，这需要能恢复雄性可育性的基因的存在和应用。通过遗传修饰开发杂交品种依赖于是否可得到适当而有效的不育和恢复基因。获得植物雄性不育性的另一个目的是保护(亲本株系)种质并防止使用农场自存的种子和／或植物进行育种。如果创造可产生纯合不育植物的种子是可能的话，不可能从其获得种子并进行进一步育种。这样，就可以保持出售这些种子或植物的垄断地位。这对于如花椰菜、禾草等尤其重要，其中生殖器官(如种子)对于种植者来说不是商业目的。然而，为了繁殖雄性不育纯合亲本株系，应该恢复可育性以获得有可育性的花粉。对于大多数可能包含影响雄性可育性的基因的植物种类来说，内源核位点是已知的，通常来说，为了获得雄性不育表型，对于特定的隐性等位基因这些位点必须是纯合的。在这些位点存在显性雄性可育’等位基因，导致雄性可育。近十年来已经知道，通过向植物基因组加入重组DNA序列，在植物中可以诱导显性雄性不育性状，其中的重组DNA序列编码例如具有细胞毒性的产物，并处于在雄性生殖器官的选定组织中具有显著活性的启动子的控制下。在现有技术中，已经阐明了许多诱导雄性不育的DNA序列和特异性启动子。在国际专利申请WO90／08830中，ICI以概括性术语提出了生产可恢复的雄性不育植物的方法，主要包括表达a)编码蛋白质抑制剂的基因或b)所谓的致死基因(其中所述的基因在雄花中表达)，这导致花药及有关组织的细胞死亡。作为例证的致死基因是那些经表达对线粒体代谢有影响的基因。在国际专利申请WO90／08831中，ICI公开了通过表达破坏基因抑制细胞呼吸作用，从而抑制线粒体功能，最终导致表达这些基因的细胞死亡。优选的破坏蛋白质为a)哺乳动物解偶联蛋白(UCP)，b)F1-ATP酶的β-1亚单位的基因的突变形式，这一改变导致亚单位不能装配进有功能的ATP合酶中，c)编码F0-ATP酶的亚单位9的oil1基因的突变的、合成的形式，d)线粒体转运肽的突变形式，以破坏蛋白质转运进线粒体，e)包含来自酵母的β-亚单位(ATP酶)基因和来自大肠杆菌(E．coli)的β-半乳糖苷酶基因的融合体的基因构建体，这导致破坏性融合蛋白的表达。优选地，根据本说明书这样的表达应该在绒毡层或花粉特异性的启动子的控制下进行调节。在国际专利申请WO89／10396中，PGS以概括性术语提出了通过用所谓的雄性不育DNA转化植物核基因组，获得雄性不育植物的方法，其中的雄性不育DNA包含编码能够扰乱正常代谢、行使功能和／或任何雄蕊细胞发育的RNA或多肽，其中在该雄蕊细胞中雄性不育DNA表达，优选地由此导致任何这样的雄蕊细胞死亡。这样的雄性不育DNA的例子是那些编码DNA酶、RNA酶、蛋白酶或植物激素合成的酶(如细胞激动素)的DNA。另外，有人提出从反义DNA中选择雄性不育DNA，该DNA编码与在植物雄蕊细胞中天然转录的DNA链互补的DNA链。’在欧洲专利申请EP-A-0329308中，PalladinHybrid提出了一种提供雄性不育植物的方法，该方法包括通过主要将重组DNA序列插入所述植物的基因组生产遗传转化的母本，其中的DNA序列包含封阻有功能的花粉粒产生的反义DNA，或使正在发育中的花粉粒对可封阻有功能的花粉粒产生的化学试剂或生理逆境敏感的反义DNA。优选地，所述的反义基因在花粉特异性启动子的控制下表达。根据本专利申请的说明书，对有功能的花粉粒产生关键的基因选自在小孢子中特异性表达的基因，优选地位于前减数分裂期。小孢子特异性克隆的例子为来自欧洲油菜(Brassicanapus)的L4和L19。除了对前减数分裂基因和清楚提到的克隆的一般叙述外，关于待封阻的基因的表达性质没有进一步的教导。也曾有人使用类黄酮途径的化合物。EP0513884(MOGEN)涉及查耳酮合酶途径的花药特异性破坏。相似地，有人提出了破坏种子中的花色素苷生物合成(WO95／34634，PGS)。对于可育性的恢复也有描述。WO94／09143(MOGEN)提出了对查耳酮合酶途径的花药特异性破坏的恢复系统。在EP0628635(NUNHEMS)中提供了不育性-可育性系统，其中不育性通过在氨基酸生物合成途径中局部创造缺陷而引起，而构想了恢复可通过浇水或喷雾方式提供缺失的氨基酸或前体实现。在WO89／10396(PGS)中，提出了在通过导入编码barstar(芽孢杆菌RNA酶抑制剂)的基因表达芽孢杆菌RNA酶产生的不育植物中恢复可育性。WO97／13401(Purdue研究基金会)公开了通过使不育植物与表达重组酶的植物杂交，通过位点特异性重组切除对不育性起作用的基因来进行恢复。然而，仍然需要赋予完全雄性不育性并同样易于恢复的系统。本发明的另一部分是包含绒毡层、花粉和／或花药特异性的启动子和编码TPP的基因的重组DNA，其中编码TPP的基因优选地来源于细菌、真菌、动物、植物或人，更优选地来源于大肠杆菌。而且，包含该重组DNA的载体和包含该载体的农杆菌属(Agrobacterium)菌株也构成了本发明的一部分。同样，用这种农杆菌属菌株转化的植物，或通常而言包含上述重组DNA的植物，或根据上述方法培育成的植物构成了本发明的一部分。本发明的另一个实施方案是一种培育植物雄性不育及易于恢复雄性可育性的方法，其是通过用编码TPP的重组DNA转化植物，且该DNA编码侧翼为位点特异性重组酶的靶位点之序列。在根据这种方法所培育的雄性不育植物中恢复可育性的相关方法的特征在于通过用可表达位点特异性重组酶的重组DNA转化所述植物或通过杂交，以除去编码TPP的重组DNA。本发明的另一个实施方案是一种培育植物雄性不育及易于恢复雄性可育性的方法，其是通过用可在绒毡层、花粉和／或花药中表达的重组DNA转化这种植物，其特征在于重组DNA包含编码海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)的基因和编码海藻糖磷酸合酶(TPS)的基因、或者抑制TPP作用的其它基因，如反义海藻糖酶或反义TPP，其中后一基因处于诱导型启动子控制之下。在根据这种方法所培育的雄性不育植物中恢复可育性的相关方法的特征在于TPS通过诱导型启动子的诱导表达。本发明的另一个实施方案是一种培育植物雄性不育及易于恢复雄性可育性的方法，其是通过用可在绒毡层、花粉和／或花药中表达的重组DNA转化这种植物，其特征在于重组DNA包含编码海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)的基因，该基因的表达由通过诱导型启动子控制的基因编码的抑制基因分子控制。在根据这种方法所培育的雄性不育植物中恢复可育性的方法的特征在于抑制基因通过诱导型启动子的诱导表达。本发明的另一个实施方案是通过向所述植物(更具体的说是向花蕾)施用赤霉酸溶液，恢复通过表达海藻糖磷酸磷酸酶培育的雄性不育植物的方法。本发明的另一个实施方案是通过上述方法生产的雄性不育植物和通过相关方法生产的相应雄性可育-恢复植物。本发明还包括生产雄性不育纯合系的方法，其是通过使根据本发明的方法获得的雄性不育植物与同样根据本发明的方法获得的恢复的雄性可育植物杂交。通过这种方法生产的雄性不育纯合系也构成了本发明的一部分。本发明的最后一个实施方案是生产可育杂种植物的方法，其是通过a．用可表达位点特异性重组酶的重组DNA转化植物；b．使所述植物与通过上述任一方法生产的雄性不育植物杂交。通过这种方法生产的可育杂交植物也构成了本发明的一部分。图2在基于TPP表达、通过表达TPS恢复和位点特异性重组的核雄性不育系统内生产可育杂种的流程图。图3在基于TPP表达、通过表达抑制物恢复和位点特异性重组的核雄性不育系统内生产可育杂种的流程图。图4质粒pvdh403的限制性位点图，该质粒含有处于Tap1启动子控制下的大肠杆菌TPP基因与组成型表达的hpt选择性标记。图5构建pvdh403的克隆示意图。图6构建pvdh417的克隆示意图。图7来自tap-TPP转化的和野生型SamsunNN烟草植物的花粉的花粉活力荧光染色。图8在用tap-TPS再转化后tap-TPP烟草SamsunNN植物可育性的恢复。左图显示了在花内花药中花粉的发育。右图分别显示了转基因植物系结籽。图9用赤霉酸(GA)处理的tap-TPP烟草SamsunNN植物可育性的恢复。左上图显示了花冠的发育和花药中花粉的发育。右上图显示了在花药中花粉发育的细节，下图显示了结籽。发明详述本发明提供了培育雄性不育植物的方法、雄性不育植物自身、在所述植物中恢复可育性的方法、恢复的可育植物以及培育可育杂种的方法。雄性不育性是指无或不能产生有功能的或有活力的花粉。雄性不育性可通过缺损产生，该缺损导致花粉不能形成或花粉形成后缺乏功能。因此，花粉不能形成，或者即使形成在正常条件下也是无活力的或不能有效受精。本发明的雄性不育植物是雌性可育的。这说明这种植物不产生可育花粉，但是能够接受所需父本的花粉，导致受精和种子产生。仅为了定义用途，转化植物的通常定义是植物全体或植物群体。该术语包括广义的植物和植物种类，并不限制于特定的种类。在下述事实中可以找到本发明的基础已令人惊奇的发现TPP的表达，具体地说是在雄性生殖组织(如绒毡层、花药或花粉)中的表达可导致雄性不育。TPP为在海藻糖合成途径中有活性的酶，尚不知该酶存在于生殖组织中。然而，最近发现(WO97／42326)酶TPS和TPP能够剧烈改变表达这些酶的组织中的碳水化合物代谢和光合能力。另外还发现TPP和TPS的作用是相反的，即可以观察到同时发生等摩尔的表达对植物生理和表型没有显著影响。另外还观察到参与海藻糖生化途径中的其它酶(如海藻糖酶、海藻糖-6-磷酸水解酶(Trec，Rimmele，M．和Boos，W细菌学杂志(J．Bact．)176，5654-5664，1994)和磷酸-α-(1，1)-葡糖苷酶(Shoeck，F．等，基因(Gene)，170，77-80，1996)也可用于产生本申请所述的作用。通常而言，雄性不育植物通过在启动子的控制下表达TPP获得，其中的启动子特异性地启动在植物雄性生殖系统中的表达。显示出这种特异性的启动子是周知的。尤其有用的是Nachen等人(分子基因遗传学(Mol．Gen．Genet．)，229，129-136，1991)描述的绒毡层特异性启动子Tap1、绒毡层特异性启动子A9(WO92／11379)、在WO92／18625、WO90／08826和欧洲专利申请EP93810455．1中描述的花药特异性启动子、绒毡层特异性启动子MFS14(WO97／04116)。几个其它的启动子在本领域是已知的(参见，例如McCormick等人，“花药特异性基因转基因植物中的分子特性和启动子分析”，植物生殖从花诱导到授粉，Lord等人，128-135页，1989；Scott等人，植物细胞(PlantCell)，4，253，1992)，只要其在雄性生殖系统中特异性表达，启动子的选择对本发明不是关键。然而，必须记住花药或绒毡层特异性表达的效果不同于花粉特异性表达的效果。当利用抑制有活力花粉形成的基因之花药或绒毡层特异性表达时，在植物中根本就没有形成花粉，这是有效的雄性不育。然而，通过花粉特异性表达，仅有一半花粉没有活力，其它的一半仍然有活力，这样杂合植物仍然可育(但是只有50％)。要获得真正纯合的具有花粉特异性的启动子的不育系，赋予不育性的基因应该处于诱导型启动子的控制之下，以便在最初基因还没有表达时，可以培育出对所述的可诱导基因来说是纯合的植物。然后在诱导后，基因得到表达，植物变成雄性不育。这样，该系统在任何时候都能够保持可培育为雄性不育的品系。必须清楚的是可诱导的雄性不育是一种属性，如果与诱导型启动子联合，这种属性可以用任何雄性生殖系统特异性启动子获得。TPP基因编码海藻糖磷酸磷酸酶。已知编码该酶的几个基因，其可在所有生物体中找到(PCT／EP97／02497)。在支持本发明的试验中使用来自大肠杆菌的基因，但是编码TPP的其它基因，如来自酵母或植物的基因同样有用。在本发明的其它实施方案中，使用了海藻糖磷酸合酶(TPS)。该基因也来自大肠杆菌，但是它也同样可以来自其它生物体，如酵母、植物或甚至人(WO97／42326)。应该记住在WO97／42326中显示在不甚有特异性的启动子的控制下表达TPP也可以产生雄性不育植物。这在烟草和拟南芥中得到了证明，其中在烟草中TPP是在35S启动子的控制下和质体蓝素启动子的控制下表达，在拟南芥中TPP是在质体蓝素启动子的控制下表达(分别参见WO97／42326实施例2和实施例20)。根据本发明可以使用许多不同的位点特异性重组酶系统，包括但不限于噬菌体P1的Cre／lox系统、酵母的FLP／FRT系统、噬茵体Mu的Gine重组酶、大肠杆菌的Pin重组酶与pSR1质粒的R／RS系统。两个最常用的位点特异性重组酶系统是噬菌体P1的Cre／lox系统和酵母的FLP／FRT系统。在这些系统中，重组酶(Cre或FLP)分别与其位点特异性重组序列(分别为lox或FRT)特异性相互作用，以转化或切除间插序列。这两个系统的每一个的序列相当短(lox为34bp，FRT为34-47bp)。在植物中使用这样的位点特异性重组酶在，例如，US5，527，695中有描述。位点特异性重组位点的同向重复序列可以处于要切除的DNA的侧翼，重组酶活性的随后导入可以切除所述DNA(这样就恢复了可育性)。已经证明FLP／FRT系统可在植物细胞中有效地起作用。尽管位点特异性重组序列必须连接到要切除或转化的DNA序列的末端，编码位点特异性重组酶的基因可以位于其它地点，这样就可以通过标准转化方法或与已包含重组酶基因的植物异花授粉，分别将其导入植物细胞。本发明涉及以最简单的方式(参见图1)生产可育杂种，其是通过导入重组DNA，其中重组DNA包含选择性标记(例如，除草剂抗性)并能特异性地在雄性生殖系统中表达TPP，以及通过将所述雄性不育系与表达可中和TPP不育性诱导效果的基因的品系杂交。完成这种方法的可能性在于与表达海藻糖磷酸合酶(TPS)的植物杂交、与表达反义TPP基因的植物杂交、与表达可抑制TPP表达的抑制基因的植物杂交、与使用定点重组系统的植物杂交。本发明不限于这些方法，本领域技术人员知道有几种方法阻止表达(在转录、翻译或翻译后水平上)或阻止TPP基因起作用。雄性不育系(因为其仍然是杂合体)可通过可育等基因处理(与非转基因系，即可育系杂交)与选择加以维持。使用转基因系对其具有抗性的试剂进行选择，如抗生素(例如卡那霉素和潮霉素)或除草剂(如Basta和草甘膦)。适合的标记的选择应该属于一般技术人员的范围；一些经常使用的标记基因的例子是赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶基因(EP-A256223)、来自大鼠肝脏并赋予来自除草剂的谷胱甘肽抗性的谷胱甘肽-S-转移酶基因(EP-A256223)、赋予经过量表达对谷氨酰胺合成酶抑制剂(如phosphinotrycin)具有抗性的谷胱甘肽合成酶(WO87／05327)、来自产绿色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)并赋予选择性试剂phosphinotrycin抗性的乙酰转移酶基因(EP-A275957)、赋予耐N-磷酸甲基甘氨酸的编码5-烯醇莽草酸-3-磷酸酶合酶(EPSPS)的基因、赋予氨基腈抗性的cah基因、赋予潮霉素抗性的hpt基因、赋予Bialaphos抗性的bar基因(如WO91／02071)等。标记的实际选择不是关键，只要它与所选植物组合时是有功能的(即有选择性的)。然而，大多数时候纯合雄性不育系是优选的。这就提出了保持这样的品系的问题。在本发明中这可通过几种方法解决。如果目标是提供纯合雄性不育系，为了使其能够进行杂交，应该克服TPP在雄性不育系中的作用。这可以通过几种方法做到，其中有几种方法在本文中明确提到。本发明不限于这些例子，本领域的技术人员可以容易地发现其它达到相同目标的方法。恢复可育性的第一个系统是紧接着TPP基因导入编码中和TPP作用的分子的基因。这样的基因的一个例子是TPS，其能够克服由TPP引起的不育性作用。为了防止TPS的组成型表达，可以使TPS的表达处于诱导型启动子控制下。诱导型启动子包括任何在与诱导剂接触时可增加给定基因产生的基因产物的量的启动子。在无诱导剂时，不转录DNA序列。特异性地与诱导型启动子结合以激活转录的因子一般以非活性形式存在，该形式可被诱导剂直接或间接转变成活性形式。诱导剂可以是化学试剂(如蛋白质、代谢产物(糖、醇等)、生长调节剂、除草剂、酚类化合物)或生理逆境，所述生理逆境可以直接由热、盐、创伤、有毒元素等施加，或间接地通过病原体或致病物(如病毒)的作用施加。可以通过在外部向细胞施用诱导剂(通过如喷雾、浇水、加热或相似的方法)使包含诱导型启动子的植物细胞接触诱导剂。诱导型启动子对于熟悉本领域的人是周知的，存在几种可以用于启动TPS基因的表达。根据本发明适合使用的可诱导启动子包括但不限于热激启动子、哺乳动物类固醇受体系统和任何化学的诱导型启动子。诱导型启动子的例子包括可诱导的果蝇(Drosophilamelanogaster)70kD热激启动子(Freeling，M．等人，遗传学年评(Ann．Rev．Genet．19，297-323)和由乙醇诱导的醇脱氢酶启动子(Nagao，R．T．等人，Miflin，B．J．(编辑)植物分子和细胞生物学之牛津纵览，第3卷，384-438页，牛津大学出版社，1986)。可由简单化学物质诱导的启动子尤其有用。最后一类的例子是在WO90／08826、WO93／21334、WO93／031294、WO96／37609中描述的启动子。这样，纯合雄性不育系中的可育性可以通过用诱导剂处理恢复，这些恢复的雄性不育系可用于与其自身或仍然是雄性不育的品系杂交，以使纯合性得到保持。在不育系优选地用于市场用途的情况下，可以获得并出售从恢复的可育性品系与雄性不育系杂交得到的种子。在寻求杂种优势效果的情况下，应该产生可育杂种，可以使用在简单系统中的与如上所述的位点特异性重组相似的方法。因此，位点特异性重组位点应该插入TPP基因的侧翼，也优选地但不是必须包含TPS编码序列，可育杂种的生产可以通过使纯合雄性不育系与能表达位点特异性重组酶的品系杂交获得。描述上述方法的流程图如图2所示。对抗TPP作用以恢复可育性的分子的另一个例子是通过导入编码抑制基因蛋白质的DNA，所述抑制基因能够抑制TPP的表达，而抑制基因的表达处于诱导型启动子的控制下。这样的抑制可以例如通过使用tet-阻遏物系统完成，其中将可以被阻遏物识别的特异性结合位点导入待抑制表达的基因的RNA聚合酶结合位点附近。如果tet阻遏物存在，该阻遏物将与特异性序列结合，从而通过位阻阻止RNA聚合酶启动转录。编码tet-阻遏物的基因可以与待控制表达的基因相邻，但这并不是必须的。当阻遏物的基因置于诱导型启动子的控制下时，阻遏物分子的表达以及TPP基因的抑制可以通过施用外源诱导剂诱导。这样就不产生TPP效果，最后得到了正常的可育植物。这样，可以通过使雄性不育植物与恢复的可育植物杂交使纯合雄性不育系的保持成为可能。为了生产可育杂种，也可以使用如上所述的位点特异性重组的系统。第三个通过对抗TPP的作用提供恢复的方法是紧接着TPP基因导入诱导型启动子控制下的反义TPP基因。在使用相应的诱导剂诱导后，反义TPP将结合到由有义TPP基因产生的mRNA上，这样就阻止了进一步翻译和不育结作用。反义TPP的基因可以与有义TPP基因相邻，但这并不是必须的。令人惊奇的是，提供恢复的第四种方法是通过向花蕾喷雾直接施用或通过浇水间接施用赤霉酸(GA)溶液。很明显，GA可以克服TPP表达的抑制效果。优选地在花蕾发育过程中施用GA，因为如果不这样，TPP表达的效果就不可逆转。本发明的重组DNA构建体可以使用本领域技术人员已知的重组DNA技术构建。重组基因构建体可以插入市售的载体中，具体地说该载体适合于植物的转化以及在转化的细胞内表达基因产物。通过使用可选择标记从未转化的细胞中选择转化的细胞(那些包含插入宿主细胞DNA的重组DNA的细胞)，其中的可选择标记作为导入的重组DNA的一部分。关于本发明在不同植物种类上的适用性，必须提到本发明的一个特定的实施方案仅用转基因烟草作为例子加以说明，事实上，实际的适用性不限于该植物种类。任何植物种类都可以使用根据本发明的重组DNA序列。尽管本发明的某些实施方案目前是不可实行的，例如，因为某些植物种类还不能进行遗传转化，本发明在这些植物种类上的应用仅仅是时间问题，而不是原则问题，因为进行如此的遗传转化的可行性与本发明的实施无关。目前植物种类的转化对于许多植物种类(包括双子叶植物和单子叶植物)来说是常规的。原则上任何转化方法都可用于将根据本发明的重组DNA导入适合的祖细胞，只要该细胞能够再生成为整株植物。方法可适合地选自用于原生质体的钙／聚乙二醇方法(Krens，E．A．等人，1982，自然(Nature)，296，72-74；NegrutiuI．等人，1987年6月，植物分子生物学(PlantMol．Biol．)，8，363-373)、原生质体的电穿孔法(ShillitoR．D．等人，1985，生物技术(Bio／Technol．)，3，1099-1102)、植物材料显微注射法(CrosswayA．等人，1986，分子基因遗传学，202，179-185)、用于各种植物材料的(DNA或RNA包被的)粒子轰击(KleinT．M．等人，1987，自然，327，70)、用(非整合性)病毒感染等。根据本发明的优选的方法包括农杆菌介导的DNA转移。尤其优选的是使用在EPA120516和美国专利4，940，838描述的所谓的二元载体技术。番茄的转化可以基本上如VanRoekel等人(VanRoekel，J．S．CDamm，BMelchers，L．SHoekema，A．(1993)．影响番茄(Lycopersiconesculentum)转化频率的因子)，植物细胞报道(PlantCellReports)，12，644-647)所述优选地进行。在甜菜上的转化使用其保卫细胞进行，这在PCT／GB93／211837中有描述。通常，在转化后，依据一个或多个由植物可表达的基因编码的标记选择植物细胞或细胞群体，其中的标记基因与编码根据本发明的蛋白质的核酸序列共转移，其后将转化的材料再生成整株植物。尽管考虑到某些种类更难于进行遗传转化，单子叶植物较易进行转化，可育转基因植物可从转化的细胞或胚或其它植物材料中再生。目前优选的转化单子叶植物的方法是微粒子轰击胚、外植体或悬浮细胞、直接DNA吸收或电穿孔(Shimamoto等人，1989，自然，338，274-276)和颈须技术。更具体地说，转基因玉米使用碳化硅纤维介导的转化技术转化(颈须)如下将在BMS培养基中的无菌的、高压灭菌的颈须悬浮液与细胞悬浮液和DNA混合并涡旋搅拌。然后在选择培养基(如在WO97／04116中所述的)上获得转基因愈伤组织。转基因玉米植物也通过微粒子轰击将编码phosphinothricin乙酰转移酶(使除草剂phosphinothricin失活的酶)的吸水链霉菌bar基因导入玉米胚发生细胞的悬浮培养物中获得(Gordon-Kamm，1990，植物细胞(PlantCell)，2，603-618)。将遗传物质导入其它单子叶作物(如小麦和大麦)的糊粉粒原生质体也有报道(Lee，1989，植物分子生物学，13，21-30)。通过仅选择老化而紧凑的小瘤状胚发生愈伤组织建立胚悬浮培养物，从胚发生的悬浮培养物再生小麦植株(Vasil，1990，生物技术，8，429-434)。用于这些作物的转化系统的组合可以使本发明应用到单子叶植物上。单子叶植物(包括商业上重要的作物，如水稻和玉米)也可以通过农杆菌属的菌株进行DNA转移(参看WO94／00977；EP0159418B1；GouldJ，MichaelD，HasegawaO，UlianEC，PetersonG，SmithRH，(1991)，植物生理，95，426-434)。在DNA转移和再生之后，可以评价推定的转化植物(例如，使用Southern分析)是否存在根据本发明的重组DNA、拷贝数和／或基因组结构。另外，或者作为替代，新导入的DNA的表达水平可以使用本领域普通技术人员熟知的Northern和／或Western分析进行。在最初的分析(该分析是任选的)后，对于显示出根据本发明的新导入的重组DNA之所需拷贝数和表达水平的转化植物，测定其雄性不育性或可育性恢复。作为替代，选择的植物可以经历另一轮转化，例如导入其它基因，如TPS基因或抑制剂基因。为了获得能够组成型表达一个以上嵌合基因的转基因植物，可以使用许多替代方法，这些方法包括A．使用DNA(例如在二元质粒中的T-DNA)，其带有与许多物理性地偶联的选择的标记基因的修饰基因。这种方法的优点是嵌合基因物理性地偶联，因此作为单个孟德尔位点移动。B．使已经可表达一个或多个嵌合基因(优选地偶联到选择性的标记基因上)的转基因植物与来自另一种转基因植物的花粉异花授粉，其中该植物包含一个或多个偶联到另一种选择性标记上的嵌合基因。然后，可以基于所述两个选择性标记的存在与否或基于嵌合基因自身的存在与否选择通过杂交获得的种子。随后，将从所选择的种子获得的植株用于进一步的杂交。原则上嵌合基因不位于单个位点，从而基因可以作为独立的位点分离。C．使用多个多重嵌合DNA分子，例如质粒，其中每个都含有一个或多个嵌合基因和可选择标记。如果共转化频率高，仅基于一个标记选择就足够了。在其它情况下，基于一个以上标记的选择是优选的。D．用新嵌合DNA连续转化已包含第一种、第二种等等的嵌合基因的转基因植物，其中的新嵌合DNA任选地包含选择性标记基因。如在方法B中一样，嵌合基因原则上不位于单一位点，因此嵌合基因可以作为独立的位点分离。E．上述策略的组合。在获得雄性不育亲本系后，应该与另一个亲本系(该亲本必须是雄性可育的)杂交以获得杂种。如果目标是提供雄性不育杂种，雄性不育亲本系应该是纯合的，可育亲本系可以是任何品系，包括野生型植物。该方法对于不必生产种子的作物(如莴苣、花椰菜、胡萝卜等)是理想的。如果目标是提供可育杂种，雄性不育系中的TPP作用应该得到克服。这可以通过几种方法解决，其中一些方法在本文中提到。本发明不限于这些例子，本领域技术人员可以容易地找到达到相同目标的其它方法。获得雄性不育杂种的第一个方法是使雄性不育系与表达位点特异性重组酶的品系杂交。为了此目的，应该给雄性不育系提供位于编码TPP的基因之侧翼的位点特异性重组酶。通过使显性的雄性不育系与表达重组酶的亲本系杂交，切除了TPP基因，后代就可育。获得雄性不育系的另一个方法是使显性的雄性不育系与用编码TPS并超量表达该酶的基因转化的亲本系杂交。TPS能够中和TPP的作用，同时表达TPP和TPS的植物是雄性可育的。优选地TPS也在雄性生殖系统内特异性表达。另一个方法是使显性的雄性不育系与用反义TPP基因转化的亲本系杂交。通过杂交，由反义TPP基因产生的mRNA与有义TPP基因的mRNA结合，从而阻止mRNA的翻译。因此，该酶不能形成，产生的杂种是可育的。也可能使用阻遏物系统，其中通过使之含有阻遏物结合的位点使显性雄性不育系对抑制敏感，从而阻止编码TPP的DNA序列转录。与雄性不育系杂交的亲本系应能够表达阻遏物。最后一种获得可育杂种的方法是在花蕾发育过程中用赤霉酸(GA)处理雄性不育植物的部分。这些植物就变成可育的并可与雌性可育植物杂交。本发明在已知可通过杂种的形成产生杂种优势的植物和寻求阻止用农户自留的种子进行育种的植物上非常有用。这样的植物是高粱、芥属植物、水稻、小麦、黑麦、玉米、番茄、胡椒、黄瓜、甜瓜、园艺植物和大田作物如胡萝卜、洋葱、leak、向日葵、禾草、莴苣和甜菜。本领域技术人员可以认识到此清单是不完全的，其它植物也可以从本发明受益。下述提供的实施例仅为了说明用途，绝不意味着限制本发明的范围。试验部分DNA分离、操作和扩增的标准技术以及复制重组DNA的适合载体、适合的细菌菌株、选择性标记、培养基等都在，例如，Sambrook等人的手册中有描述(Sambrook，JFritsch，E．F与Maniatis，T．(1989)，分子克隆，试验指南。冷泉港试验室出版社，冷泉港，纽约)。实施例1烟草、莴苣和拟南芥的转化莴苣(Lattucasativacv．Evola)的转化根据Curtis等人((1994)试验植物学杂志(J．Exp．Bot．)，45，1441)的方法进行。拟南芥(Arabidopsisthaliana)的转化通过Clarke等人描述的方法((1992)植物分子生物学报道(Plant．Mo1．Bio1．Rep．)，10，178)或Valvekens等人描述的方法(1988)美国国家科学院学报(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)，85，5536)进行。将烟草(Micotianatabacum)SamsunNN的体外幼芽生长在基本MS20培养基上(包含Murashige和Skoog基本盐和维生素、20g蔗糖、无激素)，生长4周直至其长出充分生长的叶片。对于体外将烟草SamsunNN幼芽和农杆菌属的菌株一起生长在基本转化培养基上，保存在-80℃下的35％甘油母液中。在使用前，将农杆菌在含RTK的固体LLC培养基上于29℃下培养3天。将菌株置于20ml含RTK的液体LLC培养基中，以300转／分震荡培养过夜。第二天菌株就充分生长(O．D＞＞1．5)，可以使用。将包含质粒pVDH403(Tap1-TPP)的菌株命名为Hat1403，包含质粒pVDH417(Tap1-TPS)的菌株命名为Hat1417。将充分生长的烟草叶片无菌切割成1×1cm的小块。将这些外植体放入过夜生长的农杆菌培养物中5至10分钟以开始共培养。将外植体从悬浮液中取出，放置在无菌滤纸上以降低细菌的浓度。然后将外植体颠倒放置在共培养培养基上，于20℃下在暗处培养2-3天。随后，将外植体放进无菌水中以洗去细菌。然后将外植体放在无菌滤纸上以吸去多余的水分。把外植体转移到反选择培养基上，于22℃和16／24小时的光照下培养3天以完全杀死细菌。将外植体转移到再生培养基上于22℃和16／24小时的光照下培养大约4-6周以产生转基因幼芽。为了达到良好的再生，将外植体颠倒放在再生培养基上。当转基因幼芽大约1cm时，将其转移到生根培养基上。如果幼芽在含100mg／l的卡那霉素的生根培养基上培养2-4周后能够产生幼芽分生组织，更换生根培养基。在使独立的转基因幼芽生根后，将植物转移到温室的土壤中。在温室中生长6-10周后，植物开始开花，培养基的组成如下MS20培养基(体外幼芽增殖)MS盐和维生素(Murashige和Skoog)4．61g／l蔗糖20．0g／lMES(吗啉乙烷磺酸)0．3g／l琼脂(纯化的，Sigma)8．0g／lpH5．8高温蒸汽灭菌(20分钟，121℃)共培养培养基MS盐和维生素4．61g／l蔗糖20．0g／lMES0．3g／l琼脂8．0g／lPH5．8高温蒸汽灭菌(20分钟，121℃)反选择培养基MS盐和维生素(Murashige和Skoog)4．61g／l蔗糖20．0g／lMES(吗啉乙烷磺酸)0．3g／lBAP(6-苄基氨基嘌呤)1．0g／lCx(头孢噻肟)(过滤除菌)100mg／lpH5．8高温蒸汽灭菌(20分钟，121℃)再生培养基MS盐和维生素4．61g／1蔗糖20．0g／lMES0．3g／lBAP1．0g／lCx(头孢噻肟)(过滤除菌)100mg／lKm(卡那霉素)(过滤除菌)100mg／lpH5．8高温蒸汽灭菌(20分钟，121℃)生根培养基MS盐和维生素4．61g／1蔗糖20．0g／lMES0．3g／lCx(头孢噻肟)(过滤除菌)100mg／lKm(卡那霉素)(过滤除菌)100mg／l琼脂8．0g／lpH5．8高温蒸汽灭菌(20分钟，121℃)LLC培养基Bacto-胰胨10．0g／l酵母提取物5．0g／lNaCl5．0g／lTris-HCl(1．0M，pH7．5)1．0ml／l高温蒸汽灭菌(20分钟，121℃)pH7．0固体LLC也包含Bacto-琼脂15．0g／l抗生素(RTK)(过滤除菌)固体LLCRifampycine100mg／l四环素5mg／l卡那霉素50mg／l液体LLCRifampycine40mg／l四环素2mg／l卡那霉素50mg／l为了构建pVDH512(含有处于质体蓝素启动子控制下的海藻糖磷酸水解酶，PC-TreC=pMOG1301)，合成了两个寡核苷酸引物Tre-TreC-46(包含BamHI位点的正向引物)和Tre-TreC-47(包含BamHI位点的反向引物)，该引物与Rimmele，M．和Boos，W．(1994，大肠杆菌的海藻糖-6-磷酸水解酶，细菌学杂志，176．5654-5664)描述的大肠杆菌TreC基因互补。Tre-TreC-465′CTCGGATCCGTAATGACTCATCTTCCCCAC3′Tre-TreC-475′CTCGGATCCGATTTACTTCTGTAACCACC3′与PCTPP表达构建体的构建类似(WO97／42326)，生成了含有连接到大肠杆菌TreC基因上的豌豆质体蓝素启动子的二元载体。与pVDH417的构建类似，构建了含有在绒毡层特异性启动子控制下的大肠杆菌TPS基因和在T-DNA上的卡那霉素植物选择性标记的二元载体。将该构建体命名为pVDH517。实施例3种子产生的评价Hat1403产生了20个独立的转化体，Hat1417产生了5个。将这些植物转移到温室中，在花期用0．01％FDA(荧光素二乙酸酯)测定花粉的活力(图7)。将不育植物与未转化的SamsumNN花粉回交以检查转化体是否仅是雄性不育而非雌性不育。开花后，对种子产生进行评价。也收获具有非常低的自花授粉种子的植物，再次播种以确定S1种子是否有活力。评分如表1所示。为了分析TPP基因的存在和雄性不育性之间的相关性，按照表2的示意图将tap-TPP转基因烟草植物系与野生型植物回交。使用PCR技术并通过表型评价分析后代中TPP基因的存在(表3)。表1．包含Tap-TPP(1403)或Tap-TPS(147)的烟草SamsumNN的表型-=0种子／果实，+／-=1-5个种子／果实，+=10-100个种子／果实，++=在某些果实中有正常结籽，+++=正常结籽<tablesid="table1"num="001"><table>植物#花粉活力(％)花的形态种子(自交)F1种子(Wt)1403-015wt+++++1403-02＜1wt++ND1403-0330wt++++++1403-04＜1wt+++++1403-05＜1wt++ND1403-060wt+／-ND1403-070wt+／-ND1403-08＜1wt+++++1403-090wt+++++1403-10＜1wt-+++1403-110wt+／-ND1403-1275wt+++ND1403-130wt-ND1403-1475wt+++ND1403-15＜1wt-+++1403-160abb．花药-ND1403-170wt+／-ND1403-180wt++ND1403-195wt+++++1403-200abb．花药+／-NDSamsunwt75wt+++ND1417-08＞10wt+++ND1417-12＞10wt+++ND1417-13＞10wt+++ND1417-19＞10wt+++ND1417-20＞10wt+++ND</table></tables>表2．Tap-TPP与野生型烟草植物回交的计数Tap-TPP转基因烟草植物系1403-201403-101403-61403-71403-17野生型FBHDJ表3后代的PCR数据及表型分析Tap-TPP杂交植物号PCR不育性1403-20F1+SF2-FF3+SF4-FF5+SF6+S1403-10B1+SB2-FB3-FB4+SB5+SB6-F1403-6H1-FH2+SH3+SH4+NDH5+NDH6+ND1403-7D1+SD2+SD3+SD4+SD5+SD6+S1403-17J1-FJ2-FJ3-FJ4+SJ5+SJ6+SND未测定S植物不育F植物可育实施例4通过表达PC-TreC产生不育烟草植物生成了在绿色-特异性质体蓝素启动子(pMOG1301)的控制下表达来自细菌的海藻糖-6-磷酸水解酶(Rimmele和Boos)的转基因烟草植物。与表达来自大肠杆菌的TPP基因的烟草植物(WO97／42326)类似，表达TreC的植物发育成脉间组织变白的大叶片。在形成花蕾后，这些花蕾发生早熟凋落，形成了完全不育的植物。实施例5通过表达Tap-TPP产生不育莴苣植物生成了在绒毡层特异性启动子(pVDH403)控制下表达大肠杆菌TPP基因的转基因莴苣植物。在126个独立的原代转化体中，33株植物被证明是雄性不育的。选择雄性不育植物与野生型植物回交(表4)，以及随后对后代不育性与TPP基因存在的相关性分析表明100％相关。表4Tap-TPP与野生型莴苣植物回交的计数以及回交后代的PCR数据母本X父本回交Tap-TPP3A-01X野生型4E-02X野生型植物代码PCRTPP／PCR表型后代HPT3A-01-01-／-F3A-01-02-／-F3A-01-03-／-F3A-01-04+／+S3A-01-05+／+S4E-02-01+／+S4E-02-02+／+S4E-02-03-／-F4E-02-04-／-FF可育S不育实施例6通过用pVDH517(Tap-TPS)再转化恢复烟草Tap-TPP植物的可育性将用Tap-TPP(pVDH403，T-DNA含有潮霉素植物选择性标记)转基因并表现出雄性不育表型的烟草植物用Tap-TPS(pVDH517，T-DNA含有卡那霉素植物选择性标记)再转化，分析再转化体的可育性(表5)。当同时表达Tap-TPS和Tap-TPP时，选择用于再转化的五个雄性不育系中的四个被证明重新获得了可育性，如图8所示。表5Tap-TPS(pVDH517)转化成雄性不育Tap-TPP(pVDH403)烟草植物植物号1403-201403-101403-61403-71403-17A1B1C1D1O11FF*SF2FFFSF3FFFS*4FFF**5FFFSF6F**SF7FSFSF8FFFNDF9FFFSND10FFFNDF11FSFSF12FSF*F13FFF*F14NDFFNDF15NDNDFSF16NDNDFNDF17NDNDFNDF18NDNDFNDS19NDNDFNDF20NDNDFND*ND未测定*尚未开花S植物不育F植物可育F植物产生少量种子另外，产生了32株仅用Tap-TPS转化的烟草植物。所有植物都可育，确实产生种子，且不显示出不同于野生型的特异性表型。实施例7通过用赤霉酸(GA)处理恢复烟草Tap-TPP植物的可育性用包含GA4和GA7的Berelex溶液(Abbott)处理由Tap-TPP(pVDH403)转基因的雄性不育烟草植物，其中的Berelex溶液稀释至GA浓度为20mg／l，使用常规植物喷雾装置喷雾到正在发育的花蕾上。从花蕾形成开始到授粉，每两天对植物喷雾一次。使用该处理方法，在Tap-TPP植物系上产生了正常的可育花粉，使该植物能够自花授粉并导致结籽(图9)。当用Berelex溶液喷雾时，与实施例6相比，选择用GA处理的五个雄性不育系中的四个被证明重新获得了可育性(表6)。表6通过GA处理恢复Tap-TPP烟草植物的可育性用Tap-TPP(pVDH403)转化的植物系403-20403-10403-06403-07403-17植物号A1B1C1D1O1*尚未开花S植物不育F植物可育F植物产生少量种子带阴影和下划线的得分是经GA处理的，其它得分没有用GA处理。实施例8用赤霉酸(GA)处理恢复烟草PC-TreC植物的可育性用包含GA4和GA7的Berelex溶液(Abbott)处理由PC-TreC(pMOG1301)转基因的雄性不育烟草植物，其中的Berelex溶液稀释至GA浓度为20mg／l，使用常规植物喷雾装置喷雾到正在发育的花蕾上。从花蕾形成开始到授粉，每两天对植物喷雾一次。使用该处理方法，防止了花蕾的早熟凋落，形成了产生可育花粉的花，使该植物能够自花授粉并导致结籽。实施例9通过表达PC-TPP产生不育烟草植物生成了在绿色特异性质体蓝素启动子(pVDH321)控制下表达海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因(WO97／42326)的转基因烟草植物。表达TPP的植物发育成脉间组织变白的大叶片。在形成花蕾后，这些花蕾发生早熟凋落，形成了完全不育的植物。实施例10用赤霉酸(GA)处理恢复烟草PC-TPP转基因植物的可育性用包含GA4和GA7的Berelex溶液(Abbott)处理由PC-TPP(pVDH321)转基因的雄性不育烟草植物，其中的Berelex溶液稀释至GA浓度为20mg／l，使用常规植物喷雾装置喷雾到正在发育的花蕾上。从花蕾形成开始到授粉，每两天对植物喷雾一次。使用该处理方法，防止了花蕾的早熟凋落，形成了产生可育花粉的花，使该植物能够自花授粉并导致结籽。实施例11通过表达PC-TPP产生不育拟南芥植物生成了在绿色特异性质体蓝素启动子(pVDH321)控制下表达海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因(WO97／42326)的转基因拟南芥植物。表达TPP的植物发育成脉间组织变白的大叶片。表达TPP基因的植物不形成花序，不能产生种子。权利要求1．一种培育植物雄性不育的方法，该方法通过用能够在绒毡层、花粉和／或花药中表达蛋白质的重组DNA转化所述植物，其特征在于所述蛋白质是海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)。2．根据权利要求1的方法，其特征在于包含编码TPP的基因的重组DNA来自细菌、真菌、动物、植物或人，优选地来自大肠杆菌。3．重组DNA，其包含绒毡层、花粉和／或花药特异性启动子及编码TPP的基因，优选地所述基因来自细菌、真菌、动物、植物或人，更优选地来自大肠杆菌。4．包含根据权利要求3的重组DNA的载体。5．包含根据权利要求4的载体的农杆菌属的菌株。6．用权利要求5的农杆菌属的菌株转化的植物。7．雄性不育植物，其特征在于该植物包含根据权利要求3的重组DNA。8．雄性不育植物，其特征在于该植物是根据权利要求1或权利要求2的方法培育的。9．一种用于培育植物雄性不育及易于恢复雄性可育性的方法，其是通过用可在绒毡层、花粉和／或花药中表达的重组DNA转化所述植物，其特征在于重组DNA包含编码海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)的基因，而且位点特异性重组酶的靶位点位于编码TPP的重组DNA的侧翼。10．一种用于恢复根据权利要求9的方法培育的雄性不育植物之可育性的方法，其特征在于通过转化所述植物或通过使所述植物与可表达位点特异性重组酶的重组DNA杂交，以除去编码TPP的重组DNA。11．一种用于培育植物雄性不育及易于恢复雄性可育性的方法，其是通过用可在绒毡层、花粉和／或花药中表达的重组DNA转化所述植物，其特征在于重组DNA包含一种编码海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)的基因和第二种编码可中和TPP作用的分子的基因，其中第二种基因处于诱导型启动子控制之下。12．根据权利要求11的方法，其特征在于第二种基因编码海藻糖磷酸合酶(TPS)。13．根据权利要求11的方法，其特征在于第二种基因编码反义TPP序列。14．一种用于恢复根据权利要求11-13任一项所述的方法培育的雄性不育植物之可育性的方法，其特征在于第二种基因通过诱导型启动子的诱导表达。15．一种用于培育植物雄性不育及易于恢复雄性可育性的方法，其是通过用可在绒毡层、花粉和／或花药中表达的重组DNA转化所述植物，其特征在于重组DNA包含编码海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)的基因，该基因的表达由通过诱导型启动子控制的基因编码的抑制基因分子控制。16．一种用于恢复根据权利要求15的方法培育的雄性不育植物之可育性的方法，其特征在于所述抑制基因通过诱导型启动子的诱导表达。17．根据权利要求11-16任一项所述的方法，其特征在于诱导型启动子是可化学诱导的启动子。18．一种恢复通过表达海藻糖磷酸磷酸酶培育的雄性不育植物之可育性的方法，其特征在于用赤霉酸处理所述雄性不育植物。19．根据权利要求18的方法，其特征在于用赤霉酸溶液向所述植物的花蕾喷施。20．根据权利要求18或19的方法，其特征在于赤霉酸溶液包含GA4和／或GA7。21．通过权利要求9、11、12、13或15的方法产生的雄性不育植物。22．通过权利要求10、14、16、18、19或20的方法产生的雄性可育植物。23．用于产生雄性不育纯合系的方法，其是通过根据权利要求11、12或13的方法产生的雄性不育植物与根据权利要求14的方法产生的雄性可育植物杂交。24．用于产生雄性不育纯合系的方法，其是通过根据权利要求15的方法产生的雄性不育植物与根据权利要求16的方法产生的雄性可育植物杂交。25．一种用于产生雄性不育纯合系的方法，其是通过根据权利要求1或2的方法产生的雄性不育植物与根据权利要求18、19或20的方法产生的雄性可育植物杂交。26．一种通过权利要求23、24或25的方法产生的雄性不育纯合系。27．一种用于产生可育杂种植物的方法，其是通过a．用可表达位点特异性重组酶的重组DNA转化植物；以及b．使所述植物与根据权利要求9的方法产生的雄性不育植物杂交。28．一种用于产生可育杂种植物的方法，其是通过a．用能够中和TPP作用的重组DNA转化植物；以及b．使所述植物与根据权利要求1或权利要求2的方法产生的雄性不育植物杂交。29．根据权利要求28的方法，其特征在于能够中和TPP作用的重组DNA选自包含编码TPS的基因的重组DNA、包含编码抑制基因的重组DNA，其中该抑制基因可结合到TPP基因的转录起始位点，以及包含反义TPP序列的重组DNA。30．通过根据权利要求27-29任一项所述的方法产生的可育杂种植物。全文摘要本发明涉及通过给植物提供一种重组DNA以生产雄性不育植物,其中的重组DNA可在植物的雄性生殖系统内特异性表达海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)。可育性的恢复可以通过给所述的雄性不育植物提供在诱导型启动子控制下可表达海藻糖磷酸合酶(TPS)的重组DNA,或通过提供可表达抑制蛋白的重组DNA实现,其中的抑制基因蛋白在诱导型启动子控制下抑制TPP的表达。这种可诱导的恢复的可能性使纯合雄性不育系的保持成为可能。恢复也可以通过向雄性不育植物喷洒赤霉酸实现。对于杂种或杂种的种子的生产,本发明提供了一种位点特异性的重组系统,方法是通过插入位于重组DNA侧翼的两个位点特异性重组位点,其中重组DNA编码TPP且使雄性不育系与表达相应的重组酶的株系杂交。通过杂交重组酶将切除编码TPP的基因,从而生产出了可育的杂种。文档编号C12N1/21GK1280625SQ98811751公开日2001年1月17日申请日期1998年10月30日优先权日1997年10月30日发明者C·M·P·范邓恩,O·J·M·古德迪恩申请人:莫根国际股份有限公司