专利名称：筛查葡萄糖－6－磷酸脱氢酶缺陷症用的诊断盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种筛查葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺陷症的药物及其载体，特别是直接应用于现场，简便、快速筛查G6PD缺陷症的诊断盒及其制备方法。
G6PD缺陷症是一种遗传性疾病，它的遗传方式为X染色体连锁不完全显性遗传。由于G6PD缺陷症患者的红细胞内缺乏或缺少G6PD，使红细胞在很多诱因下，如服用蚕豆，磺胺类药物，解热止痛类药物，或患上疟疾后服用伯喹等会导致红细胞的破裂，发生溶血，严重者可发生溶血性贫血，溶血性黄疸的发生，有的甚至可出现死亡率极高的黑尿热。
由于G6PD缺陷症是一种遗传性疾病，本病未有药物治疗，只有在确诊后给以预防，避免出现溶血。尤其是，目前在抗疟治疗中伯喹仍为第一线抗疟药物，在进行治疗中，常有因服用伯喹发生G6PD缺陷症患者溶血，有的可引起相当严重的溶血性贫血，甚至需抢救和输血才能挽回生命。因此，在疟疾流行区对人群施用伯喹时预先筛查出G6PD缺陷症患者，以避免他们服用伯喹导致溶血是非常必要的。
为了达到筛查G6PD缺陷症这一目的，前人相继研究出了11种检测G6PD活性的方法。既有定量筛查的也有定性筛查的方法。其中以Fairbanks等Blood 1962；20(5)591-601.中公开了一种定性测定的方法(以下简称定性法)和杜传书等中华血液学杂志1981；2(3)188-192中，公开了一种测定红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的四氮唑蓝定量测定法(以下简称定量法)的方法特异性较强。这11种方法各有其优缺点，但它们都只能在实验室内进行，不能够用在抗疟现场，尤其是在无电的农户家中进行，这样务必使这些方法在推广上受到一些局限，另外，不能简便、快速、准确地完成筛查工作，对预防和治疗工作极为不利，以至影响预防工作的开展。
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处，提供一种可应用在抗疟现场，尤其是在无电的农户家中，实现简便、快速、准确地筛查出G6PD缺陷症患者的筛查G6PD缺陷症的诊断盒及其制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的本发明基于医学界对G6PD缺陷症的认识，以及导致G6PD缺陷症患者的红细胞破裂发生溶血的多种诱因的研究。提出一种简便、快速、准确筛查G6PD缺陷症的诊断盒，该诊断盒包括(1)纸片1定性圆滤纸片若干纸片2经NADP、G6PNa、MgCL2和NaN3的混合药液浸透，并已冻干的定性圆滤纸片若干(2)分别装有溶血剂、MTT溶液、PMS溶液的带滴嘴的三个黑色软塑料试剂瓶(3)有盖尖底无色塑料离心管多支，离心管架一个。
筛查G6PD缺陷症的诊断盒的制备方法，包括以下步骤及工艺条件步骤一纸片2的制备(1)各成份的比值为NADP∶G6PNa∶NaN3∶5mMol MgCl2＝1(重量)∶2(重量)∶1(重量)∶1(体积)，重量单位为g时，体积单位为l，制备成混和药液(2)将定性圆滤纸片放入混和药液中充分浸透；(3)用冷冻干燥机冷冻干燥后分装，4℃冰箱内干燥保存；步骤二试剂瓶药剂的配制瓶1的溶血剂配方2％Triton X-100+0.1％β-MP瓶2的MTT溶液配方MTT∶NaN3∶0.1Mol Tris-HCl buffer pH8.0＝1(重量)∶1(重量)∶0.5(体积)，重量单位为g时，体积单位为l，制备成原液，再用0.1Mol Tris-HCl buffer pH8.0稀释原液至8％的浓度；瓶3的PMS溶液配方PMS∶NaN3∶0.1Mol Tris-HCl buffer pH8.0＝1(重量)∶1(重量)∶0.5(体积)，重量单位为g时，体积单位为l，制备成原液，再用0.1Mol Tris-HCl buffer pH8.0稀释原液至8％的浓度；步骤三装盒(1)诊断盒内装有两个包装袋，分别装有纸片1，纸片2；(2)装有溶血剂、MTT溶液、PMS溶液的三个带每滴约50μl的滴嘴、黑色软塑料试剂瓶；(3)有盖尖底无色塑料离心管多支，离心管架一个；步骤四保存将筛查G6PD缺陷症的诊断盒置于4℃冰箱内保存，保存期6个月。
本发明与现有技术相比具有如下突出的优点
1.解决了现有技术的诊断方法均只能在实验室完成而不能应用于条件艰苦的抗疟现场的关键问题，本发明能在抗疟现场使用，尤其是在无电农户家中使用，能简便、快速、准确地筛查出G6PD缺陷症患者。同时也可应用在其他学科中，如内科中的溶血性贫血，产科中的新生儿黄疸等，用以筛查G6PD缺陷症患者。有极好的社会效益，有利于疟疾预防工作的开展。
2.将NADP、G6PNa、MgCl2和NaN3按配方混和后，用圆滤纸片浸透后冻干。在4℃冰箱内干燥保存可达6个月，避免了在使用时临时配制。
3.采血量用圆滤纸片控制，可避免采血量过多而出现假阴性，血片在特殊的溶血剂中溶血，可提高G6PD酶活力。红细胞中只要有少许G6PD就可使纸片2变蓝，容易观察结果。
4.瓶2、瓶3的试剂已预先配制，在暗处保存可达6个月，临时混和手续容易。
5.反应液放在有盖尖底无色塑料离心管内。在条件不足时，如该诊断盒在现场使用时，若没有照明用电，完全可以用铝锅代替恒温水浴箱，使实验照常进行。也易观察管内液体颜色的变化。
6.纸片2和瓶2、瓶3中均加有NaN3，可显著增加它们的保存期限，为制成诊断盒打下基础。
7.本发明与现有技术的定量法、定性法比较7.1.材料人全血标本来源于志愿健康献血员，抽取2ml血，肝素抗凝，或取自本市各医院送来作G6PD定量测定的抗凝血，共70名。
7.2方法抗凝全血标本按下面三种方法分别定量和定性测定G6PD活性。
7.2.1.本法定性检测G6PD活性模拟疟疾防治发药现场，应用本法，按试剂诊断盒及操作方法进行。
7.2.2.定量法测定G6PD总酶活力值抗凝血标本按定量法测定G6PD总酶活力值。
7.2.3.定性法定性检测G6PD活性将抗凝血混匀后滴在小圆滤纸片上(血纸片)，在室温(15～20℃)下自然晾干、保存，并且在晾干后即刻、4h、8h、24h、48h、72h共六次分别按定性法定性测定G6PD活性。
本法的结果判断酶活性正常者，管2内的溶液及纸片2呈紫蓝色(-)；酶活性为中间值者，溶液呈淡红色，纸片2呈淡紫蓝色(±)；缺陷症者，溶液及纸片2均呈淡红色(+)。
三种方法比较结果本组70份(男36份，女34份)抗凝血标本分别按照上述三种方法定量或定性作G6PD测定，其结果如下表。
表1 三种方法测定人红细胞G6PD活力比较
对三种方法进行比较时，根据上表可见本法与定性法的血纸片晾干后即刻、4h、8h的结果相一致，也与定量法测定结果基本相符。血纸片在室温下放置时间超过24h后，放置时间愈长，(+)和/或(±)的结果愈多。说明在室温条件下血纸片的红细胞G6PD活力失活较快，容易出现假阳性。也说明用定性法测G6PD时，血纸片在室温下只能保存较短的时间，保存在较长时间内不能实际反应测试者的G6PD活性程度。定性法作者一再强调应将血纸片密封保存在0-4℃条件下，以使它在较长时间内仍能准确测出G6PD活力。这在抗疟现场，尤其在边远山区，难以做到。
实验还发现用定性法定性测定G6PD活力时，血纸片的血溶解在双蒸水后，溶血液的血色较深，加入反应试剂后，(-)与(±)有时不易区分，即使在溶血后弃去血纸片，也难以避免。而用本法时，将纸片1沾上血后溶解在溶血剂中，再用纸片2沾取溶血液，转入管2内观察结果，可避免出现此现象，结果观察比较容易而准确。因此，本法可用在疟疾防治发药现场(甚至在无电的农户家中)作定性筛查G6PD缺陷症患者。它不仅能客观地反映测试者G6PD活力水平，而且容易准确地观察出结果。在这两点上均优于定性法。
为了验证本法对筛查G6PD缺陷症的效果，我们对一疟疾流行区中的一个村子内151人在农户家中进行了筛查。结果为(-)111人(男50人、女61人)，占73.5％；(±)为13人(全部为女性)，占8.6％；(+)27人(男21人、女6人)，占17.9％。
从本组结果显示(+)结果中，男性多于女性，男性为半合子，女性为纯合子；(±)结果中，全部为女性，为杂合子。符合G6PD为X显性连锁遗传规律的特点。
在151人中，其中10人过去曾因服用疟疾预防药--伯喹后导致溶血，并经住院治疗的患者，这次普查时均为阳性，说明本法及诊断盒对筛查G6PD缺陷症的结果可靠。
实施例诊断盒的组成如下(1)纸片1为Φ5mm大小的定性圆滤纸片。小塑料袋包装，每袋50张。
纸片2大小、质地均同纸片1，含有NADP、G6PNa、MgCl2和NaN3的混和药液，并冻干，小塑料袋包装，每袋50张。
(2)三个有螺旋盖的黑色软塑料试剂瓶，瓶口为滴嘴状，可直接从试剂瓶滴出试剂，每滴约50μl。
瓶1内装溶血剂6ml；瓶2内装MTT溶液3ml；瓶3内装PMS溶液3ml。
(3)0.5ml有盖尖底无色塑料离心管二十个；泡沫塑料离心管架一个。
诊断盒置于4℃冰箱内保存，保存期6个月。
诊断盒制备方法包括；(1)纸片2的制备配方NADP 3mg+G6PNa 6mg+NaN33mg+5mMolMgCl23ml，用Φ5mm定性圆滤纸片浸透药液，再用冷冻干燥机冷冻干燥后分装。
(2)带每滴约50μl滴嘴的黑色软塑料三个试剂瓶中的药剂配方分别为瓶1的溶血剂配方Triton x-100 2ml+β-MP 100μl+D.W.97.9ml，瓶2 MTT溶液的配方MTT 10mg+NaN310mg+0.1Mol Tris-HClbuffer pH8.0 5ml为原液，原液200μl+0.1Mol Tris-HCl buffer pH8.0 2.5ml；
瓶3PMS溶液的配方PMS 10mg+NaN310mg+0.1Mol Tris-HClbuffer pH8.0 5ml为原液，原液200μl+0.1Mol Tris-HCl buffer pH8.0 2.5ml。
筛查G6PD缺陷症的诊断盒使用方法如下设备眼科直镊一把；三用恒温水浴箱一个。如在现场的农户中使用，可用100℃温度计一支、铝锅一个代替。
方法取上述的有盖塑料离心管两个，在管1内滴两滴瓶1.试剂，管2内滴瓶2.瓶3.试剂各一滴，备用。
用纸片1汲取受检者耳垂(或指尖)血，浸透即可(约5μl左右)，置于管1内，使成溶血液。
将纸片2置入管1的溶血液内浸透，立即转入管2内，避光置37℃水浴中15分钟，取出后观察结果。
G6PD缺陷症者，管2的溶液及纸片2均呈淡红色(+)。
结果判断酶活性正常者(-)，管2内的溶液及纸片2呈紫蓝色；酶活性为中间值者(±)，溶液呈淡红色，纸片2呈淡紫蓝色；缺陷症者(+)，溶液及纸片2均呈淡红色。后两者均可诊断为G6PD缺陷症。
权利要求
1.筛查葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症用的诊断盒，其特征在于诊断盒包括(1)纸片1定性圆滤纸片若干，纸片2经NADP、G6PNa、MgCL2和NaN3的混合药液浸透，并已冻干的定性圆滤纸片若干(2)分别装有溶血剂、MTT溶液、PMS溶液的三个带滴嘴、黑色软塑料试剂瓶(3)有盖、尖底无色离心管多支，离心管架一个。
2.根据权利要求1所述的筛查葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症用的诊断盒，其特征在于用滤纸片来控制取血量的多少，纸片1、纸片2定性圆滤纸片为Φ5mm大小。
3.根据权利要求1所述的筛查葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症用的诊断盒，其特征在于带滴嘴黑色软塑料试剂瓶的滴嘴为每滴50±5μl。
4.根据权利要求1所述的筛查葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症用的诊断盒，其特征在于瓶1内装配方为2％ Triton X-100+0.1％β-MP溶血剂6ml；瓶2内装配方为MTT∶NaN3∶0.1Mol Tris-HCl buffer pH8.0＝1(重量)∶1(重量)∶0.5(体积)，重量单位为g时，体积单位为l，制备成原液，再用0.1Mol Tris-HCl buffer pH8.0稀释原液至8％的浓度，MTT溶液3ml；瓶3内装配方为PMS∶NaN3∶0.1Mol Tris-HCl buffer pH8.0＝1(重量)∶1(重量)∶0.5(体积)，重量单位为g时，体积单位为l，制备成原液，再用0.1Mol Tris-HCl buffer pH8.0稀释原液至8％的浓度，PMS溶液3ml。
5.筛查G6PD缺陷症的诊断盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤及工艺条件步骤一纸片2的制备(1)各成份的比值为NADP∶G6PNa∶NaN3∶5mMol MgCl2＝1(重量)∶2(重量)∶1(重量)∶1(体积)，重量单位为g时，体积单位为l，制备成混和药液；(2)将定性圆滤纸片放入混和药液中充分浸透(3)用冷冻干燥机冷冻干燥后分装，4℃冰箱内干燥保存；步骤二试剂瓶药剂的配制瓶1的溶血剂配方2％Triton X-100+0.1％β-MP瓶2的MTT溶液配方MTT∶NaN3∶0.1Mol Tris-HCl buffer pH8.0＝1(重量)∶1(重量)∶0.5(体积)重量单位为g时，体积单位为l，制备成原液，再用0.1Mol Tris-HCl buffer pH8.0稀释原液至8％的浓度瓶3的PMS溶液配方PMS∶NaN3∶0.1Mol Tris-HCl buffer pH8.0＝1(重量)∶1(重量)∶0.5(体积)重量单位为g时，体积单位为l，制备成原液，再用0.1Mol Tris-HCl buffer pH8.0稀释原液至8％的浓度；步骤三装盒(1)诊断盒内装有两个包装袋，分别装有纸片1、纸片2；(2)装有溶血剂、MTT溶液、PMS溶液的三个带每滴约50μl的滴嘴、黑色软塑料试剂瓶；(3)有盖尖底无色塑料离心管多支，离心管架一个；步骤四保存将筛查G6PD缺陷症的诊断盒置于4℃冰箱内保存，保存期6个月。
全文摘要
本发明公开了一种筛查葡萄糖－6－磷酸脱氢酶缺陷症用的诊断盒及其制备方法。诊断盒包括定性圆滤纸片及经NADP、G6PNa、MgCl
文档编号C12Q1/32GK1243163SQ9911621
公开日2000年2月2日 申请日期1999年6月2日 优先权日1999年6月2日
发明者聂崇兴, 赵双星 申请人:暨南大学