专利名称：异源双链突变载体及其在细菌中的应用的制作方法
1．发明领域本发明涉及双链寡核碱基化合物(下文中为“双链突变载体”)的应用，以在某一细胞内的一段DNA序列上特异性地产生变化。在一个实施例中，本发明涉及化合物及它们的使用方法，以在靶原核细胞的基因组和游离体(质粒)上产生特异性的遗传变化。在进一步的实施例中，本发明涉及使用细菌细胞以发展更有效的双链突变载体的方法。设计双链突变载体(duplex mutational vector,DMV)的结构以在DMV和靶基因之间发生遗传交换，即，一段包含在DMV内的序列取代了靶基因上的序列。在又进一步的实施例中，本发明涉及DMV的特定遗传结构。
2．发明背景专利号5,565,350,1996年10月15日出版，和编号5,731,181,1998年3月24日出版的美国专利(E.B.Kmiec)，描述了嵌合突变载体(chimeric mutational vectors,,CMV)，该载体具有DNA型及RNA型核碱基以将遗传变化引入原核细胞的载体。这些CMV的特点是具有至少3个连续的碱基对，其中DNA型和RNA型的核碱基彼此为Watson-Crick配对的，以形成杂合双链。一种设计用于修复编码肝脏/骨骼/肾脏类型的碱性磷酸酶的基因上的一个突变的CMV如Yoon,K.等所报道，1996年3月，Proc.Natl.Acad.Sci.93,2071.碱性磷酸酶基因通过一种质粒被过渡引入到CHO细胞内。六小时以后引入CMV。在引入到CMV内的24小时以后回收质粒并分析。结果显示大约30至38％的碱性磷酸酶基因被CMV修复。
一种设计用于修正引起镰状细胞病的人类β-球蛋白基因上突变的CMV及其成功的应用如Cole-Strauss等所描述，1996，科学273:1386。一种设计用于在一种大鼠肝细胞内的大鼠凝血因子Ⅸ基因上制造一个突变的CMV如Kren等所公布，1998，自然药物(Naturemedicine)4,285-290。一种具有第一条链上的一个碱基与第二条链上的一个非互补的碱基配对的CMV的一个例子如Kren等所提供，1997年6月，肝脏病学25,1462。
系列编号为08/640,517的美国专利申请于1996年3月1日递交，E.B.Kmiec,A.Cole-Strauss和K.Yoon，发表为WO97/41141,1997年10月6日，及系列编号08/906,265的申请，1997年8月5日递交，公布了在治疗造血细胞中的遗传疾病中有用的方法和CMV，如镰状细胞病、珠蛋白生成障碍性贫血和葡萄糖脑苷脂酶缺乏症。
以上所引用的Yoon,Cole-Straauss和Kren的科学出版物，描述了具有被一段插入的DNA片段隔开的两段2’-O-甲基RNA片段的CMV，其位于与具有5’末端核苷的链相对链上。美国专利5,565,350描述了一种具有单链的2’-O-甲基化RNA片段，其位于具有5’末端核苷的链上。一段位于与具有5’末端核苷的链相对的链上、具有互补的脱氧核糖核苷酸和一段未修饰的核糖核苷酸的连续片段的寡核苷酸如Kmiec,E.B等所描述，1994，分子和细胞生物学，14:7163-7172。该链的序列来自抗菌素M13mp19。
使用单链的寡核苷酸以在酵母中引入特定突变如Yamamoto,T.等所描述，1992，遗传学131,811-819。这些寡核苷酸在大约30到50个碱基之间。类似的结果如Campbell,C.R.,等所报道，1989,新生物学家，l,223-227。全长大约160个碱基对的双链DNA片段已经被报道将特定的突变引入哺乳动物细胞中，Hunger-Bertling,K.,等，1990，分子和细胞生物化学92,107-116。
申请者们知道随后包括指导关于重组诱发剂寡核苷酸的使用和传递系统的临时申请由Steer等，系列编号60/045,288,1997年4月30日归档；系列编号60/054,837,1997年8月5日归档；系列编号60/064,996,1997年11月10日归档；以及由Steer & Roy-Chowdhury等，系列编号60/074,497,1998年2月12日归档，标题为“通过改变APOB和APOE基因进行预防和治疗的方法。”3．附图简述
图1．一种双链发夹型重组诱发剂寡体构象的一个例子。特征为a，第一条链(strand)；b，第二条链；c，第二条链的第一段(chain)；1，最5’端核碱基；2,3’末端核碱基；3,5’末端核碱基；4，最3’端核碱基；5，第一末端核碱基；6，第二末端核碱基。
图2．一种具有一个突出端的单链发夹型重组诱发剂核碱基构象的一个例子。其特征如以上，加上d，突出端部分。注意第二条链上最5’端核碱基和5’末端核碱基是相同的核碱基。
4．定义本发明将依据以下定义进行理解。
一种寡核碱基是核碱基的聚合体，该聚合体可以通过Watson-Crick碱基配对与一段具有互补序列的DNA杂交。
核碱基包括一种碱基，其是嘌呤、嘧啶、或它们的衍生物或类似物。核碱基包括肽核碱基(肽核酸的亚单位)、和吗啉核碱基以及含有一个戊糖呋喃糖基部分的核碱基，如一种可选择性替代的核糖核苷或2’-脱氧核糖核苷。核苷是含有戊糖呋喃糖的核碱基，其通过磷酸二酯键连接。其它含有戊糖呋喃糖的核碱基可以通过替代的磷酸二酯键连接，如硫代磷酸酯或磷酸三酯。
一个寡核碱基化合物具有单个的5’和3’末端核碱基，它们是该聚合体的最末端核碱基。核碱基为脱氧核糖型或核糖型。核糖型核碱基是含有戊糖呋喃糖的核碱基，其中2’碳是被羟基、取代的氧或卤素取代的亚甲基。脱氧核糖型核碱基是除了核糖型核碱基之外的核碱基，包括所有不含有戊糖呋喃糖基部分的核碱基，如肽核酸。
一条寡核碱基链通常包括寡核碱基化合物的区域或片段，其基本上与具有相同长度的互补链的所有核碱基杂交。一段核碱基链具有一个3’末端核碱基和一个5’末端核碱基。一条链的3’末端核碱基与其互补链5’末端的核碱基杂交。如果一条链上的两个核碱基是直接共价连接的，或者它们与互补链上直接共价连接的核碱基杂交，则它们是毗邻的核碱基。一条核碱基链可以包括连接的核碱基，其中该链上的每个核碱基是与其毗邻的核碱基共价连接的。可选的，当两个毗邻的核碱基是非连接时，则一条链可以被分为两段。一条链的5’(或3’)末端核碱基可以在其5’-0(或3’-0)与接头连接，该接头进一步与第二条寡核碱基链的3’(或5’)末端连接，第二条链与第一条链互补，籍此两条链形成一条单一的寡核碱基化合物。该接头可以是一段寡核苷酸、寡核碱基或其它化合物。一条寡核碱基化合物的5’末端和3’末端核碱基的5’-0和3’-0可以被一个保护该寡核碱基链的保护基团取代。然而，例如，封闭的环状寡核苷酸不含有3’或5’末端核苷。注意当一条寡核碱基化合物含有一条分开的链时，3’和5’末端核碱基不是一条链的末端核碱基。
如本说明书中所用到的，术语3’和5’具有它们通常的意义。术语“最3’端的核碱基”、“最5’端的核碱基”、“第一个末端核碱基”和“第二个末端核碱基”具有特定的定义。如以上所定义的，最3’端的和第二个末端核碱基是重组诱发剂寡核碱基互补链上的3’末端核碱基。类似的最5’端的和第一个末端核碱基是重组诱发剂寡核碱基互补链上的5’末端核碱基。5．发明概述本发明基于意外的发现，即在以前的技术中所描述的嵌合突变载体在原核细胞内是有功能的。本发明进一步基于意外的发现，即杂合双链的存在不是突变载体的活性所必需的。意外地发现，缺少杂合双链上三个连续的碱基对的双链突变载体能够有效地将特定的遗传变化引入到细菌内。这些载体的术语为非嵌合型突变载体(non-chimeric mutational vectors,NCMV)。NCMV在原核细胞中也可以被用于取代CMV。
本发明进一步以意外的发现为基础，即一种嵌合突变载体，其在与具有5’末端核碱基和3’末端核碱基的链相对的链上具有一段单一的核糖型核碱基片段，其优于具有两条核糖型核碱基片段的嵌合突变载体。
本发明又进一步以一种双链突变载体的效率提高这以意外的发现为基础，其中一条链的序列包括靶基因的序列，第二条链的序列包括想要的序列，即，使用者想在靶基因的位置引入的不同序列。这些双链载体的术语为异源双链突变载体(heteroduplex mutationalvectors,HDMV)。一种HDMV可以是嵌合型的或非嵌合型的。
在HDMV的一个实施例中，包括不同的所想要序列的链是一条具有一个3’末端和一个5’末端的链。在一个可选的实施例中，含有不同的、想要序列的链由非核糖型核碱基组成。
本发明又进一步基于发现活性的显著提高可以通过构建DMV以保护DMV的链免受3’外切酶的作用而实现。在一个实施例中，3’外切酶的防护是通过使DMV抗单链DNA酶作用而提供的。
DMV可以被用于将特定的遗传变化引入到原核细胞和真核细胞或它们的游离体内的靶DNA序列上。这些变化可以被用于作为一种治疗或预防的插入，及作为一种研究工具，在患者体内产生在自然界中没有发现的新的显型特征。6．发明详述6.1.嵌合突变载体的遗传结构双链突变载体(DMV)由核碱基的聚合体组成，该聚合体与具有合适序列的DNA杂交(即，形成嘌呤和嘧啶的Watson-Crick碱基对)。每个DMV被分为至少12核碱基及不超过75个核碱基的第一条链和第二条链。在一个优选的实施例中，链的长度在20到50个核碱基之间。这些链含有彼此互补的区域。在一个优选的实施例中，这两条链在每个核碱基上彼此互补，除了靶序列和想要的序列在其中不同的核碱基。优选的是至少有两段含有至少5个核碱基的非重叠区域。
核碱基包括一种碱基，其是嘌呤或嘧啶或它们的类似物或衍生物。存在两种类型的核碱基。核糖型核碱基是具有2’-羟基、取代的2’-羟基或2’-卤素-取代的核糖的核糖核酸。所有除了核糖型的核碱基以外的核碱基都是脱氧核糖型核碱基。因此，脱氧型核碱基包括肽核碱基。
在一个实施例中，其中的链在每个核碱基上都彼此互补，第一条和第二条链的序列包括至少两个与靶基因同源的区域、以及一个或多个与靶基因不同的区域(“突变区域”)，并将遗传上的变化引入到靶基因上。该突变区域在3’和5’方向直接与同源区域毗邻。在本发明特定的实施例中，这两个同源区域全长至少有3个核碱基、或至少有6个核碱基或至少有12个核碱基。所有同源区域的全长优选的是至少有12个核碱基，优选的是16个，更优选的是全长有20个核碱基到约60个核碱基。又更优选的是同源和突变区域一起的全长是25到45个核碱基之间，更优选的是在30到45个核碱基之间或大约35到40个核碱基之间。每个同源区域的长度可以是8到30个核碱基，更优选的是8到15个核碱基，最优选的是12个核碱基。
DMV的一条或两条链可以选择性地含有核糖型核碱基。在一个优选的实施例中，仅当DMV的第二条链由脱氧核糖型核碱基组成时，第一条链才由核糖型核碱基组成。在一个可选的实施例中，第一条链含有一段单一的、插入两个核糖型核碱基片段之间的脱氧核苷型核碱基片段。在上述可选的实施例中，插入的片段含有突变区域或者，在HDMV的情况下，该插入区域与两条链中的一条内的突变区域互补。
优选的，该突变区域由20或更少的碱基，更优选的是6个或更少的碱基以及最优选的是3个或更少的碱基组成。该突变区域可以与间隔靶基因(该靶基因与DMA的同源区域同源)中区域的序列具有不同的长度，以至可以导致靶基因上的一个插入或删除。当DMV被用于在靶基因上引入一个删除时，在突变区域内没有可鉴别的碱基。而且，突变通过在靶基因内被隔开的两段同源区域并列而完成。为了本发明的目的，在靶基因上引入一个删除的一种DMV的突变区域的长度被认为是所删除的长度。在一个实施例中，突变区域是从6到1个碱基的删除，或更优选的是3到1个碱基。可以通过单一的DMV引入多个独立的突变，在这种情况下多个突变区域在相同的DMV上。可选地，可以同时使用多个DMV以将多个遗传变化引入到单个基因上或者，可选地，将多个遗传变化引入到相同细胞的多个基因上。在本说明书中，突变区域也称为异源区域。当所想要的不同序列是一个插入或删除时，两条链的序列具有该想要的不同序列的序列。
DMV是一条在24和150个核碱基之间的单一的寡核碱基化合物(聚合体)。因此，DMV含有单一的3’末端和单一的5’末端。第一条和第二条链可以通过核碱基或非寡核碱基接头共价连接。如本说明书中所用到的，这些接头不被认为是这些链的一部分。因此，存在一个限制，如一条不合有核糖型核碱基的链不排除在接连到上述链中的接头中含有核糖型核碱基。如本说明书中所用到的，嵌合型、非嵌合型和异源双链突变载体是各种类型的DMV并具有以上特性。
在一个优选的实施例中，各条链的3’末端核碱基被保护免受3’外切酶的攻击。这种保护可以通过几种目前本工艺的熟练人员了解的技术或任何将被发展的技术实现。在一个实施例中，保护免受3’外切酶攻击是通过将一条链的最3’端的(末端)核碱基与二者选一条链中的最5’端的(末端)核碱基通过核酸酶抗性的共价接头连接，这些接头如聚乙二醇、聚-1,3-丙二醇或聚-1,4-丁二醇。本工艺的熟练人员了解适于连接两段杂交的核酸链的各种接头的长度。一段具有六到三个乙烯单元和末端磷酰基基序的聚乙二醇接头是合适的。Durand,M.等，1990，核酸研究18,6353；Ma,M.Y-K.,等，1993，核酸研究21,2585-2589。一种优选的可选接头是二-磷酰基丙基-反式-4,4’-茋二甲酰胺(stilbenedicarboxamide)。Letsinger,R.L.,等，1994,J.Am.Chem.Soc.116,811-812；Letsinger,R.L.等，1995,J.Am.Chem.Soc.117,7323-7328，其作为参考结合于本说明书中。这些接头可以采用常规的固相合成的方法被插入到DMV内。可选地，DMV的链可以分别合成，然后再杂交，链间连接的形成是采用了如专利出版物WO97/05284,1997年2月13日，Letsinger R.L.等中所描述的含有硫代磷酰基(thiophoryl)的茋二甲酰胺(stilbenedicarboxamide)。
在进一步可选的实施例中，该接头可以是一条由抗核酸酶的核碱基(如2’-O-甲基、2’-O-烯丙基或2’-F-核糖核苷酸)组成的单链寡核碱基。四核苷酸序列TTTT、UUUU和UUCG以及三核苷酸序列TTT、UUU或UCG是尤其优选的核苷接头。包括一个三或四胸腺嘧啶寡核苷酸的接头不是由核酸酶抗性的核碱基组成的，这种接头不能够提供对3’外切酶攻击的防护。
在一个可选的实施例中，3’外切酶保护可以通过修饰3’末端核碱基达到。如果一条链的3’末端核碱基是一个3’末端，则一个空间保护基团可以籍3’-OH、2’-OH或对2’或3’磷酸酯的酯化作用而连接。一种合适的保护基团是一种1,2-(ω-氨基)-烃基二醇或可选的是1,2-羟甲基-(ω-氨基)-烃基。可以进行的修饰包括使用一种烯烃或带支链的烷烃或烯烃，以及ω-氨基的取代或用ω-羟基替代ω-氨基。其它合适的保护基团包括一种3’末端磷酸甲酯，Tidd,D.M.,等，1989Br.J.Cancer,60,343-350；以及3’氨基己基，Gamper H.G.,等，1993，核酸研究，21,145-150。可选的，3’或5’末端羟基可以通过与一种取代的磷(如磷酸甲酯或硫代磷酸酯)结合被衍生。
在又进一步可选的实施例中，3’末端核碱基的防护可以通过使该链的最3’端的核碱基为核酸酶抗性核碱基来实现。核酸酶抗性核碱基包括肽核碱基和2’取代的核糖核苷酸。合适的取代包括由美国专利编号5,731,181、和由美国专利编号5,334,711及Sproat(Sproat)*的编号5,658,731所教导，它们作为参照结合于本说明书中，以及专利出版物EP629387和EP679657(其称为，Martin申请)中所教导的替代，其作为参照结合于本说明书中。如本说明书中所用到的，一种如Martin申请或Sproat中所描述的一种核糖核苷酸的2’氟、氯或溴的衍生物或一种具有一个替代的2’-O的核糖核苷酸的术语为一种“2’-取代的核糖核苷酸”。特定优选的2’-替代的核糖核苷酸的实施例是2’-氟、2’-甲氧基、2’-丙氧基、2’-烯丙氧基、2’-羟基乙氧基、2’-甲氧基乙氧基、2’-氟丙氧基和2’-三氟丙氧基取代的核糖核苷酸。在2’-取代的核糖核苷酸的更优选的实施例中，是2’-甲氧基、2’-甲氧基乙氧基、和2’-丙烯氧基取代的核苷。
术语“核酸酶抗性的核糖核苷酸”包括含有2’-取代的核糖核苷酸以及也含有除了核糖核苷酸之外的所有2’-羟基核糖核苷，如通过非磷酸酯键或替代的磷酸二酯键连接的核糖核苷酸。核酸酶抗性的脱氧核糖核苷酸被类似地定义。在一个优选的实施例中，DMV优选的是包括至少三个、更优选的是六个核酸酶抗性的核糖核苷。在一个优选的实施例中，CMV仅含有一个核酸酶抗性的核糖核苷和脱氧核糖核苷酸。在一个可选的优选实施例中，每隔一个核糖核苷均为核酸酶抗性的。
每个DMV具有一个3’末端和一个5’末端。在一个实施例中，这些末端是一条链的末端核碱基。在一个可选的实施例中，一条链被分为两段，它们通过可选的链共价连接，但彼此没有直接连接。在一个实施例中，其中一条链被分为两段，3’和5’末端与可选的链上毗邻的核碱基是Watson-Crick碱基配对的。在这些链上，3’和5’末端不是末端核碱基。一种不是一条链的末端核碱基的3’末端或5’末端能够如以上所描述地、选择性地被一种空间保护剂取代以避开核酸酶的活性。在又一种选择性的实施例中，一条链的一个末端核碱基与一个核碱基相连，该核碱基不与相应链上的相应核碱基配对并且不是一种链间接头的一部分。该实施例具有一个带有3’或5’“突出端”的“发夹”构象。“突出端”部分中的未配对核碱基和其它成分不被认为是一条链的一部分。该突出端部分可能包括自杂交的核碱基或非核碱基部分，如亲和配基或标记。在DMV的一个尤其优选的实施例中具有一个3’突出端，含有5’核碱基的链仅由脱氧型核碱基组成，它们同相对链上的脱氧型核碱基配对。在DMV的一个又进一步优选的实施例中具有一个3’突出端，含有5’末端核碱基的链是不同的、想要的序列，而具有突出端的链的序列是靶DNA的序列。
本发明的一个尤其优选的实施例是一种DMV，其中的两条链并非完全互补。而且一条链的序列包括将被修饰的靶DNA的序列，另一条链的序列包括不同的、想要的、使用者意图引入到靶序列位置上的序列。由此可见，在靶和想要的序列不同的核碱基处，一条链上的碱基与另一条链上的非互补碱基配对。这种DMV在本说明书称为异源双链突变载体(HDMV)。在一个优选的实施例中，想要的序列是一条被分开的链中的一段的序列。在第二个优选的实施例中，发现想要的序列是位于不含有核糖型核碱基的片段或链上。在一个更优选的实施例中，想要的序列是被分开的链中一个片段的序列，该片段不含有核糖型核碱基。
在又一个第二优选的实施例中，CMV的第一条链不含有介于两段核糖型核碱基片段之间的脱氧型核碱基的插入片段。在该实施例中，第二条链被分为第一段和第二段，该第一段由非核糖型核碱基组成，并且第一条链中与其配对的部分包括小于四个以及优选的是不含有脱氧核糖型核碱基。在一个优选的实施例中，第一链含有5’末端核碱基。又一个进一步优选的实施例是具有依据以上所描述的单条核糖型片段的双链突变载体，其中核糖型片段的序列是靶DNA的序列，不同的、想要的序列的序列是第一段的序列。6.2.核碱基间的键在一种DMV链上的核碱基之间的键可以是任何适合于DMV与其靶序列杂交的键。这些序列包括在天然核酸中发现的传统磷酸二酯键。具有这种核苷的寡核苷酸的有机固相合成如美国专利编号Re:4,069中所描述。
可选地，核碱基间的键可以是取代的磷酸二酯，如硫代磷酸酯、取代的磷酸三酯。可选地，可以使用非磷酸酯、含有磷的键。Letsinger的美国专利编号5,476,925描述了磷酸酰胺酯接头。3’-磷酸酰胺酯键(3’-NP(O-)(O)0-5’)十分适合用于DMV，因为其相比于5’-磷酸酰胺酯能够稳定杂交。也可以采用核碱基之间的非磷酸酯键。美国专利编号5,489,677描述了具有毗邻的N和O的核碱基间键以及它们的合成方法。键3’-ON(CH3)CH2-5’(亚甲基甲基亚氨基methylenemethylimmino)键是一个优选的实施例。其它适合用于DMV中的键如Kmiec的美国专利编号5,731,181中所描述。缺乏一个戊糖呋喃糖基序且通过肽键连接的核碱基也可以用于本发明中。含有这种所谓的肽核酸(PNA)的寡核碱基如Nielsen的美国专利编号5,539,082中所描述。构建PNA/核苷嵌合体的方法如WO95/14706中所描述。
对2’位置和核碱基间接头的修饰的一个完整的回顾见Freier,S.M.,&Altmarm,K-H.,1997，核酸研究25,4429-4443。6.3.双链突变载体的应用双链突变载体(DMV)尤其是非嵌合的突变载体可以被用于将变化引入到细胞内的靶DNA序列上。DMV可以依据指导进行使用并达到嵌合突变载体中所描述的目的。见，如Kmiec的WO97/41141及Kren,B.T.,等，1998，自然医学4,285-290。
本发明进一步包括了双链突变载体的使用，包括具有转化和重组/修复功能原核细胞中的嵌合突变载体。突变载体可以被用于在一种细菌内的质粒上、细菌基因上或一种细菌人工染色体(BAC)上的DNA序列中进行特定的变化。细菌人工染色体已经基于细菌F因子复制起始点被构建，Shizuya,H.,等，1992，自然遗传学6.8794-8797；Hosoda,F.,等，1990，核酸研究18,3863-3869，或基于P-1质粒复制起始点，Ioannou,P.A.,等，1994，自然遗传学6,84-90。迄今为止，在一种BAC中引入特定的遗传变化已经需要构建一种包括变化的质粒，接着进行两次重组事件，Yang,X.W.,等，1997，自然生物技术15,859-865；Messerle,M.,等，1997,Proc.Natl.Acad.Sci.94,14759-14763。商业上可供的基于P1的单拷贝BACpBeloBAC1I，其来自Genome Systems,St.Louis Mo.,适合用于本发明的该实施例中。
在细菌中使用突变载体要求该细菌具有功能的RecA和MutS基因。RecA功能可以是组成型的，或者可以通过一种与可诱导的启动子(如lac启动子)操作性连接的RecA基因提供，如pAC184□TETRecA中所显示的。当使用一种可诱导的启动子时，RecA在细胞成为转化感受态之前需要诱导仅约1小时，然后在电穿孔之后需要大约一小时。一种可诱导的RecA的采用对于特定的用途是优选的，其中一种质粒或一种细菌人工染色体可能由于RecA的连续存在遗传上不稳定。本工艺的熟练人员将理解一种显性负RecA突变体(如在DH5α中所发现的)是不适合在本发明中使用的。出乎意料的是，突变载体的活性不能通过引入具有重组酶活性但缺乏其它功能的RecA突变体(如RecAPro67)而被恢复。
可以通过任何能够被用于将质粒DNA转化细菌的方法将突变载体引入到细菌中。在一个实施例中，该嵌合体通过电穿孔被引入。细胞可以通过用于质粒的技术被制成电穿孔感受态。然后将突变载体和感受态细菌一起重悬在无菌的毫微极纯度的水中，浓度为每108个细菌有10ng到10微克之间的载体。电穿孔在总体积为40微升中进行。
在一个优选的实施例中，DMV通过电穿孔被引入到细菌内。DMV，大约1-2毫克/毫升，与亚精胺(3nM到200nM之间)一起在室温下、在2-4微升的体积中预温孵，然后与细菌混合达到终体积为40微升，并电穿孔。优选的亚精胺的浓度为5nM到50nM之间，最优选的是10nM。不受理论的束约，这种亚精胺预温孵在电穿孔之前使DMV黏附在细菌上，其被认为能够使定向突变的速度提高。取代亚精胺，可以采用精胺或等价的线性聚烷基胺。
以下表Ⅰ表示了在细菌内空间突变的速度，和从HuH-7肝癌细胞系无细胞提取物获得的速度之间的比较。然后将抽提处理的DMV电穿孔到RecA缺陷的细菌内，并计算每个氨苄抗性的克隆中卡那抗性克隆的数目。比较显示在抽提物活性和细菌系统活性之间存在明显的相关。尤其，在两种系统中，变体Ⅳ和Ⅵb均比Kany.y强，并且在两种系统中具有3’外切酶防护末端的非嵌合型突变载体均是有活性的。唯一的不同是变体Ⅶ，其仅含有脱氧核糖核苷酸。变体Ⅶ在无细胞抽提物中是有活性的，但在细菌系统中没有。脱氧寡核糖核苷酸也被发现在真核细胞中是无活性的。不受理论的束约，申请者们相信变体Ⅶ在无细胞系统中有活性是由于相比于含有细胞的系统，在该系统中存在的核酸酶的量降低。基于这些结果，细菌嵌合成形术(chimeraplasty)可以被用于检测用于真核研究的重组诱发剂寡核碱基的不同结构。
7．实施例7.1.材料和方法质粒的构建用于克隆的所有DNA片段和载体均通过凝胶电泳分离，并采用GenecteanⅡKit(BIORAD101)纯化。PCR反应的进行如以下混合1-100ng靶或基因组DNA、5微升含Mg2+的10x缓冲液(Boehringer Manheim)、0.5微升25mM dNTPs、2.5单位Taq DNA聚合酶(Boehringer Manheim)、20pmal各引物，终体积为50微升。循环程序为94℃持续5分钟，接着是30个循环94℃持续30秒、55℃持续30秒、72℃持续30秒，接着是在72℃延伸7分钟。为了构建pWE15Kan5，在pWE15载体(Stratagene)的4021位核苷上引入单个的T→G点突变，其在卡那基因上引入了一个TAG终止密码子和一个新的BfaⅠ位点。突变的卡那片段是从pWE15模板中使用以下的PCR引物构建的SetA=Kan3910(5’CAGGGGATCA AGATCTGAT3’(序列编号1)-下划线表示BglⅡ位点)和Kan4010(5’CAGGGGATCAAGATCTGAT3’(序列编号2))SetB=Kan4014(5’TCGGCTAGGACTGGGCACA3’(序列编号3)-下划线表示Bfal位点以及黑体表示突变位点)以及Kan4594(5’TGATAGCGGTCCGCCACA3’(序列编号4)-下划线表示RsrⅡ位点。)在用BglⅡ消化产物A和用RsrⅡ消化产物B之后，将两种产物均用BfaⅠ消化并连接起来。将所得到的突变片段克隆到用BglⅡ和RsrⅡ线性化后的pWE15中，形成pWE15Kans。带有pWE15Kans质粒的大肠杆菌为卡那霉素敏感。
突变的pBR322质粒，pBRTsΔ208，在208位上含有一个碱基删除，其导致四环素基因的提早终止。该删除通过如以上所描述的一种重叠的PCR程序构建。带有突变体的DNA产物的产生通过使用引物setA{5BR22(5’CATCGATAAGCTTTAATGC3’(序列编号5))和(3BRSPH5’CATAGTGACTGGCATGCTGTCGGA3’(序列编号6))}和引物setB{3BR496(5’GCTCATGAGCCCGAAGTGGC3’(序列编号7))和(5BRSPH 5’TCCGACAGCATGCCAGTCACTATG3’(序列编号8))}。将两种产物在构建的SphⅠ位点处连接起来。用HindⅢ和BamHⅠ消化所得到的片段并将其用于取代野生型pBR322质粒内的相似区域。碱基的删除在208位构建了一个SphⅠ位点。突变的pBR322质粒，pBRTsm153(G)，在四环素基因的密码子6上含有一个终止密码子，该突变质粒的构建是通过一种重叠的聚合酶链式反应(PCR)程序，使用的片段混合物为PCR引物setA{(5BR(序列编号5))和3BRBfa(5’CGGCATAACCTAGCCTATGCC(序列编号9))}和引物setB[(3BR496(序列编号7))和5BRBfa(5’GGCTAGGTTATGCCGGTACTG3’(序列编号10))]。混合产物的再扩增采用了引物5BR22和3BR496。所得到的产物用HindⅢ和BamHⅠ消化并用于取代野生型pBR322质粒内的相似区域。在153位引入一个G形成了一个终止密码子并引入了一个BfaⅠ消化位点。另外，在四环素基因325位上构建一个A→G的沉默突变，以使得被改变过的质粒可以和野生型的pBR322质粒区别开来。含有pBRTsΔ208和pBRTsm153(G)质粒的大肠杆菌菌株为四环素敏感型。pET21aTR的制备通过将EcoRⅠ和StyⅠ片段克隆到类似酶切过的pET2la(+)(Novagen)载体上。pET21aTR能够将四环素抗性传递给大肠杆菌菌株。pET21aTsΔ208和pET21aTsm153的制备分别是通过用pBRTsm153(G)和pBRΔ208中的片段取代pET21aTR上的HindⅢ和SalⅠ区域。带有pBRTsm153(G)和pBRΔ208的大肠杆菌对四环素敏感。
pAC184ΔTETRecA+的构建pACYC184(New England Bio Labs)载体的四环素区域通过AvaⅠ和XbaⅠ的消化被除去并用一种AvaⅠ和XbaⅠ接头取代{184delTet-1(5’TCGGAGGATCCAATCTCGAGTGCACTGAAAC3’(序列编号11))与184delTet-2(5’CTAGGTTTCAGTGCACTCGAGATTGGATCCT3’(序列编号12))}一起退火，以形成中间克隆载体pAC184TET。pAC184TETRecA和pAC184TETRecAm的制备是通过将克隆的RecA或RecAm产物克隆到pAC184TET的BclⅠ位点上。RecA或RecAm插入片段的制备是通过PCR扩增pUCRRecA和pUCRRecAm，使用引物5RecALinkBC1I(5’GCGTGATCATGCACCATATGACGATTAAA3’(序列编号13)和3RecALinkBC1I(5’GCGTGATCAAGGAAGCGGAAGAGCGCCCA3’(序列编号14))。接头定义的区域是分别含有LacO、pUC19的调控区域(XXX)、以及野生型RecA和RecA突变体(框内删除-除去氨基酸X到X)的编码区域，框内含LacZ基因的前五个氨基酸。
pAC184ΔTETRec变体的构建；RecA突变体的编码区域的的序列以前已被描述(REF)。pAC184ΔTETRec67、pAC184ΔTETRec616和pAC184ΔTETRec659的制备是通过四个引物PCR反应，使用引物(recAxba-rec67A、rec67B、recAndeI、recA616A、recA616B、RecA659A、RecA659B)。将含有特定突变的Xbal/NdeⅠ片段克隆到pAC184ΔTETRec的Xbal/NdeⅠ盒内。分离阳性克隆并进行序列测定。
pAC184ΔTETmutS的构建MutS基因从由大肠杆菌DH5α中分离的基因组DNA中通过PCR被扩增，使用引物MutS5’XbaⅠ(5’GCGTCTAGAGATGAGTGCAATAGAAAATTT3’(序列编号15)和MutS3’AseⅠ(5’GCGATTAATTTACACCAGACTCTTCAAGC3’(序列编号16)。MutS PCR产物的纯化采用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)，并连接到pGEM-T载体(Promega)内以完成pGEM mutS载体的定向TA克隆。通过序列测定鉴定了完整的野生型MutS编码区域。将MutS XbaⅠ和AseⅠ插入片段连接到XbaⅠ和NdeⅠ消化的pAC184ΔTetRecA表达载体上，其取代了MutS的RecA编码区域。
细菌菌株及基因型、培养基、和生长条件用于本研究的大肠杆菌菌株包括RR1、MC1061、WM1100、BMS71-18、和EMSOmutS。细胞在LB肉汤或LB平板中生长(10)。其中合适的细胞在以下抗生素的存在下生长卡那霉素(50微克/毫升)、氨苄青霉素、四环素、氯霉素。为了质粒或嵌合体的转染，如以上所描述的(11)使细胞本质上为电感受态。简要地，细胞在LB中生长达到OD600为0.5-0.7，通过离心(3000Xg,4℃,10分钟)浓缩达到初始体积的1/10th，在冰浴的毫微极纯度H2O中清洗几次(4-5)。在最后一次清洗时，将细菌沉淀重悬在初始体积的1/500th的水中(对于立即使用)或15％甘油中(在-80℃冻存)。将电感受态的细胞立即冻存或放置在冰上直至电穿孔(直到24小时)。
嵌合体的转染含有pWE15Kans(用于靶向卡那霉素基因的转化)、pET21aTsm153(G)或pBR322TsΔ208(用于靶向四环素基因的转化)的、电感受态的大肠杆菌菌株MC1061、WM100和RR1分别用1-2微克嵌合的Kany.y、Tetm153或TETΔ208转染，使用标准的电穿孔条件，2.5kV,25F,200 Ohms。在电穿孔之后，立刻将细胞在1毫升SOC(12)存在下生长、在37℃温和振荡1小时。我们改变转染之后的孵育时间，以使得在抗生素筛选之前有足够的时间进行靶向基因的转化。典型地，在SOC培养基中复苏之后，再将全部的培养物转入4毫升含有10微克/毫升卡那(Sigma)的LB肉汤中，在37℃振荡90分钟。然后将1毫升这种培养物转入4毫升含有50微克/毫升卡那(Sigma)的LB肉汤中，在37℃振荡3小时，在此之后将一滴(100微升)在含有50微克/毫升卡那的LB琼脂中涂板并在37℃孵育过夜。如以前所描述的，对于每个细菌菌株和每个电穿孔条件，都将绘制出杀死曲线。质粒DNA的分析在嵌合处理之后从卡那抗性克隆中分离出来的质粒DNA，被用于转化感受态DH5α细菌。细菌在含有氨苄的LB平板中生长以确定总细菌，并在含有卡那或四环素的LB平板中生长以进行转化挑选。典型地，从一个原代分离菌落中分离3-5个继代分离菌落并通过RFLP分析。在三次重新涂板之后保留了两组等位基因，证明了从单个细菌进化来的克隆包括了转化的和突变的质粒的混合物，将其亚克隆并通过测序或限制性酶切进行分析。7.2.结果用于引入卡那抗性的双链突变载体的普遍结构如以下所给出。插入片段、3’同源区域、以及5’同源区域分别定为“Ⅰ”、“H-3”和“H-5”。链间接头定为“L”。一种选择性的chi位点(5’-GCTGGTGG-3’)及其互补序列分别定为X和X’。3’和5’突变子区域为单个的核苷，分别定为M3’和M5’。变体Ⅰ类似于如Cole-Strauss,1996，科学273,1386，以及Kren,1998，自然医学4,285-290中所描述的嵌合突变载体。变体Ⅰ在本说明书中是指别处的Kany.y*.对于一种变体特征的符号“-”表示该变体的特征同变体Ⅰ相同。 以上DMV引起一个CG转换，其将一个TAG终止密码子转变为一个TAC tyr密码子。注意Ⅰ的第一条链缺少一个外切酶防护的3’末端，以及Ⅰ的第二条链是一条被分开的链，其第一段是想要的、不同的序列。变体Ⅳ和Ⅴ分别是一种嵌合突变载体和一种非嵌合突变载体，具有由一段核酸酶抗性接头(2’OMe-U4)提供的3’末端核酸酶防护。变体Ⅵa和Ⅵb是嵌合的异源双链突变载体。变体Ⅵb是一种在其中想要的、不同的链被发现是在第一段上的变体，该段仅含有DNA-型核苷。
以下表中给出了在一种细菌系统中，与变体Ⅰ相关的变体的活性，并给出了一种无细胞抽提物转变成kanr/105的频率。与实验值相比，背景速度是可以忽略的，除了无细胞系统和细菌系统中的变体Ⅵa以及细菌中的变体Ⅶ。对这些变体所报道的数据是背景校正过的。变体Ⅵa和Ⅶ表现出低或无活性。各个变体Ⅲ-Ⅴ在两种系统中均强于Ⅰ，Ⅰ属于在本文中以上所引用的Yoon,Cole-Strauss和Kren的科学出版物中所描述的类型。基于从这些数据中的推论，变体Ⅷ是最理想的嵌合体。
*位点特异性速度来自一个独立的实验、与其它数据一起标准化的结果突变的速度可以通过比较卡那抗性(突变的)和氨苄抗性菌落进行确定。在电穿孔以后(采用的是每108个MC1061细胞用1微克和2微克突变载体，没有加入亚精胺)，变体Ⅳ导致一种质粒的突变为有活力的细菌的1％到2％之间。无法确定突变的绝对速度，因为每个细菌含有多个pWE15Kans质粒的拷贝。对于每个变体，质粒从所挑选的卡那抗性克隆中制备、细菌转化及挑选卡那抗性。从这些继代转染体中制备质粒是同源的。继代转染体的质粒的序列显示变体Ⅵa和Ⅶ之外所有的预期的序列。
作为重组诱发剂寡核碱基量的一种函数，转化的速度没有表现出极限。以0.01微克/108细菌及10、100和1000倍的剂量使用变体Ⅰ的实验表现出，在电穿孔之后每105个有活力的细菌中有5、11、56和320个转化菌落。用TetΔ208T和Tet153观察到的速度分别为，在类似的浓度条件下大约低于用变体Ⅰ所观察到的速度的10倍和2倍。
变体ⅠDMV和10nM亚精胺一起预诱导导致初级卡那抗性克隆的数目大约进一步提高八倍。在100nM亚精胺中也可以见到提高，然而，在1nM中没有明显提高，而1.0mM则为抑制剂。
变体Ⅱ含有一个细菌chi位点(5’GCTGGTG3’)，其插入到显示为X和X’的H-5’和接头之间。用chi位点取代最3’端的核苷(5’CGCGC3’)导致一种活力小于变体Ⅰ的三分之一的突变载体的产生。
构建并检测两种四环素特异性的DMV。TetΔ208T引起了一个T的插入，其纠正了一个移码突变。Tet153引起了一个AT转换，其将一个TAG终止密码子转换成了一个TTG亮氨酸密码子。四环素抗性嵌合突变载体的结构如以下所给出TetΔ208T Tet153
序列清单(1)一般信息(ⅰ)申请者Kumar,RameshMetz,RichardDiCola,MichaelThompson,Naomi(ⅱ)发明题目双链突变载体及其在细菌系统中的使用方法(ⅲ)序列数目20(ⅳ)联系地址(A)地址Kimeragen,Inc.
(B)街道300Pheasant Run(C)城市Newtown(D)州PA(E)国家美国(F)邮编18940(ⅴ)计算机可读形式(A)媒体类型Diskette(B)计算机IBM兼容机(C)操作系统DOS(D)软件用于Windows版本2.0的FastSEQ(ⅵ)当前申请数据(A)申请编号(B)提交日期(C)分类(ⅶ)以前申请数据(A)申请编号(B)提交日期(ⅷ)代理人/代理商信息(A)姓名Hansburg,Daniel
(B)登记编号36156(C)参考/摘要编号799-036-888(ⅸ)远距离交流信息(A)电话215-504-4444(B)电传215-504-4545(C)电报(2)序列编号1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列编号1CAGGGGATCA AGATCTGAT19(2)序列编号2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列编号2CCCAGTCCTA GCCGAATAG19(2)序列编号3的信息
(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列编号3TCGGCTAGGA CTGGGCACA19(2)序列编号4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列编号4TGATAGCGGT CCGCCACA18(2)序列编号5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列编号5
CATCGATAAG CTTTAATGC19(2)序列编号6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列编号6CATAGTGACT GGCATGCTGT CGGA24(2)序列编号7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列编号7GCTCATGAGC CCGAAGTGGC20(2)序列编号8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸
(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列编号8TCCGACAGCA TGCCAGTCAC TATG24(2)序列编号9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列编号9CGGCATAACC TAGCCTATGC C21(2)序列编号10的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列编号10GGCTAGGTTA TGCCGGTACT G21
(2)序列编号11的信息(ⅰ)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列编号11TCGGAGGATC CAATCTCGAG TGCACTGAAA C31(2)序列编号12的信息(ⅰ)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列编号12CTAGGTTTCA GTGCACTCGA GATTGGATCC T31(2)序列编号13的信息(ⅰ)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性
(ⅱ)分子类型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列编号13GCGTGATCAT GCACCATATG ACGATTAAA29(2)序列编号14的信息(ⅰ)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列编号14GCGTGATCAA GGAAGCGGAA GAGCGCCCA29(2)序列编号15的信息(ⅰ)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列编号15GCGTCTAGAG ATGAGTGCAA TAGAAAATT30(2)序列编号16的信息
(ⅰ)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列编号16GCGATTAATT TACACCAGAC TCTTCAAGC29(2)序列编号17的信息(ⅰ)序列特征(A)长度84个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列编号17GCTATTCGGC TASGACTGGG CACAAGCTGG TGGTTTTCCA CCAGCTTGTG CCCAGTCSTA60GCCGAATAGC GCGCGTTTTC GCGC84(2)序列编号18的信息(ⅰ)序列特征(A)长度68个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型；其它
(ⅹⅰ)序列描述序列编号18GCTATTCGGC TASGACTGGG CACAATTTTT TGTGCCCAGT CSTAGCCGAA TAGCGCGCGT60TTTCGCGC68(2)序列编号19的信息(ⅰ)序列特征(A)长度68个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列编号19TTCCGACAGC ATTGCCAGTC ACTATTTTTA TAGTGACTGG CAATGCTGTC GGAAGCGCGT60TTTCGCGC68(2)序列编号20的信息(ⅰ)序列特征(A)长度68个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列编号20TAGGCATAGG CTTGGTTATG CCGGTTTTTA CCGGCATAAC CAAGCCTATG CCTAGCGCGT60TTTCGCGC
权利要求
1．一种双链突变载体包括a．第一条至少12个相连的核碱基以及不超过75个相连的核碱基的寡核碱基链，该链具有一个第一末端和一个第二末端核碱基；b．第二条具有一个最3’端的核碱基和一个最5’端的核碱基、并且具有与第一条链相等数目的核碱基的寡核碱基链，这第二条链视需要而定地被分为第一段和第二段；以及c．一个3’末端核碱基和一个5’末端核碱基；其中ⅰ．第二条链的最3’端的和最5’端的核碱基分别与第一条链的第一末端和第二末端核碱基为Watson-Crick碱基配对，ⅱ上述最3’端的核碱基和上述第二末端核碱基是被保护以免受3’核酸外切酶攻击的，以及ⅲ第二条链至少含有两个至少为5个连续核碱基的非重叠区域，它们与第一条链的核碱基为Watson-Crick碱基配对，其前提是不多于两个毗邻的Watson-Crick碱基对是由一个核糖型核碱基和脱氧核糖型核碱基组成的。
2．如权利要求1中所述的载体，其中第一条链至多包括60个核碱基。
3．如权利要求1中所述的载体，其中第一条链和第二条链至多包括2个毗邻的核糖型核碱基。
4．如权利要求1中所述的载体，其中一个末端核碱基在通过一个核酸酶抗性接头与最3’端的或最5’端的核碱基相连，籍此使一个核碱基免受3’核酸外切酶的攻击。
5．如权利要求4中所述的载体，其中核酸酶抗性接头包括一个选自以下群体的部分，其包括2’-甲氧基-尿苷、2’-烯丙氧基-尿苷、2’-氟-尿苷、2’-甲氧基-胸苷、2’-烯丙氧基-胸苷、2’-氟-胸苷、聚乙二醇和反式-4,4’-茋甲酰胺。
6．如权利要求4中所述的载体，其中一级末端和二级末端核碱基通过核酸酶抗性接头与最3’端的和最5’端的核碱基相连。
7．如权利要求6中所述的载体，其中核酸酶抗性接头包括一个选自以下群体的部分，其包括2’-甲氧基-尿苷、2’-烯丙氧基-尿苷、2’-氟-尿苷、2’-甲氧基-胸苷、2’-烯丙氧基-胸苷、2’-氟-胸苷、聚乙二醇和反式-4,4’-芪甲酰胺。
8．如权利要求1中所述的载体，其中第二条链或第一段不含有RNA型核碱基。
9．如权利要求1中所述的载体，其中3’末端核碱基通过一个保护基团保护免受3’核酸外切酶的作用。
10．一种异源双链突变载体包括a．第一条至少12个相连的核碱基以及不超过75个相连的核碱基的寡核碱基链，该链具有一个第一和一个第二末端核碱基；b．第二条具有一个最3’端和一个最5’端的核碱基、并且具有与第一条链相等数目的核碱基的寡核碱基链，这第二条链视需要而定地被分为第一段和第二段；以及c．第一3’末端核碱基和一个5’末端核碱基；其中ⅰ．第二条链的最3’端的和最5’端的核碱基分别与第一条链的第一末端和第二末端核碱基为Watson-Crick碱基配对，ⅱ第二条链的最3’端的核碱基和第一条链的第二末端核碱基是被保护以免受3’核酸外切酶攻击的，以及ⅲ第二条链至少含有两个至少为5个连续核碱基的非重叠区域，它们与第一条链的核碱基为Watson-Crick碱基配对，前提是第一条链至少有一个核碱基与第二条链的非互补核碱基配对。
11．如权利要求10中所述的载体，其中第一条链至多包括50个核碱基。
12．如权利要求10中所述的载体，其中第一条链至多有3个核碱基与第二条链的非互补核碱基配对。
13．如权利要求12中所述的载体，其中非互补的核碱基是脱氧核糖型核碱基。
14．如权利要求12中所述的载体，其中第一条链至多有一个核碱基与第二条链的非互补核碱基配对。
15．如权利要求12中所述的载体，其中第二条链由一个第一段和一个第二段组成，并且第一段包括一个错配的核碱基。
16．如权利要求15中所述的载体，其中第一段不含有核糖型核碱基。
17．如权利要求15中所述的载体，其中第一段含有5’末端核碱基。
18．如权利要求12中所述的载体，其中第一条链含有至少10个核糖型寡核碱基。
19．如权利要求18中所述的载体，其中第一条链不含有脱氧核糖型寡核碱基。
20．如权利要求10中所述的载体，其中最5’端的核碱基通过一段核酸酶抗性接头与第二末端核碱基相连，籍此使得上述第二末端核碱基被保护免受3’核酸外切酶的攻击。
21．如权利要求10中所述的载体，其中最3’端的核碱基通过一段核酸酶抗性接头与第一末端核碱基相连，籍此使得上述3’末端核碱基被保护免受3’核酸外切酶的攻击。
22．如权利要求21中所述的载体，其中最5’端的核碱基通过一段核酸酶抗性接头与第二末端核碱基相连，籍此使得上述第二末端核碱基被保护免受3’核酸外切酶的攻击。
23．如权利要求21中所述的载体，其中的接头包括选自以下群体的部分，其包括2’-甲氧基-尿苷、2’-烯丙氧基-尿苷、2’-氟-尿苷、2’-甲氧基-胸苷、2’-烯丙氧基-胸苷、2’-氟-胸苷、聚乙二醇和反式-4,4’-茋甲酰胺。
24．如权利要求10中所述的载体，其中第一段不含有核糖型核碱基。
25．如权利要求10中所述的载体，其中3’末端核碱基通过一个保护基团被保护免受3’核酸外切酶的攻击。
26．一种不具有插入片段的嵌合双链突变载体包括；a．第一条至少12个相连的核碱基以及不超过75个相连的核碱基的寡核碱基链，该链具有一个第一和一个第二末端核碱基；b．第二条具有一个最3’端和一个最5’端的核碱基、并且具有与第一条链相等数目的核碱基的寡核碱基链，这第二条链被分为第一段和第二段；以及c．一个3’末端核碱基和一个5’末端核碱基；其中ⅰ．第二条链的最3’端的和最5’端的核碱基分别与第一条链的第一末端和第二末端核碱基为Watson-Crick碱基配对，ⅱ第一段的核碱基为脱氧型核碱基，并且第一条链中与之配对的核碱基为核酸酶抗性核糖型核碱基，ⅲ第二条链至少含有两个至少为5个连续核碱基的非重叠区域，它们与第一条链的核碱基为Watson-Crick碱基配对。
27．如权利要求26中所述的载体，其中第一段含有5’末端核碱基。
28．如权利要求27中所述的载体，其中第一段中至多有一个核碱基是与第一条链中的非互补核碱基配对的。
29．如权利要求26中所述的载体，其中最3’端的核碱基和第一末端核碱基通过一个接头连接，该接头含有选自以下群体的部分，其包括2’-甲氧基-尿苷、2’-烯丙氧基-尿苷、2’-氟-尿苷、2’-甲氧基-胸苷、2’-烯丙氧基-胸苷、2’-氟-胸苷、聚乙二醇和反式-4,4’-茋甲酰胺。
30．如权利要求26中所述的载体，其中最5’端的核碱基和第二末端核碱基通过一个接头连接，该接头含有选自以下群体的部分，其包括2’-甲氧基-尿苷、2’-烯丙氧基-尿苷、2’-氟-尿苷、2’-甲氧基-胸苷、2’-烯丙氧基-胸苷、2’-氟-胸苷、聚乙二醇和反式-4,4’-茋甲酰胺。
31．一种不具有插入片段的含有一段突出端的嵌合双链突变载体包括a．第一条至少12个相连的核碱基以及不超过75个相连的核碱基的寡核碱基链，该链具有一个第一和一个第二末端核碱基；以及b．一段具有一个最3’端的核碱基和一个5’末端核碱基的寡核碱基；以及c．一段加在第二末端核碱基上的3’突出端；其中ⅰ．该段的最3’端的和5’末端核碱基分别与第一条链的第一末端和第二末端核碱基为Watson-Crick碱基配对，ⅱ该段的核碱基为脱氧型核碱基，并且该链中与之配对的核碱基为核酸酶抗性核糖型核碱基，ⅲ第二条链至少含有两个至少为5个连续核碱基的非重叠区域，它们与第一条链的核碱基为Watson-Crick碱基配对。
32．如权利要求31中所述的载体，其中第一段中至少有一个核碱基与第一条链中的非互补核碱基配对。
33．如权利要求32中所述的载体，其中第一段中至多有一个核碱基与第一条链中的非互补核碱基配对。
34．如权利要求31中所述的载体，其中最3’端的核碱基和第一末端核碱基通过一个接头连接，该接头包括一个选自以下群体的部分，其包括2’-甲氧基-尿苷、2’-烯丙氧基-尿苷、2’-氟-尿苷、2’-甲氧基-胸苷、2’-烯丙氧基-胸苷、2’-氟-胸苷、聚乙二醇和反式-4,4’-茋甲酰胺。
35．一种在一种细菌内将一段靶DNA序列转换成一段不同的、想要的序列的方法，其包括在该细菌中引入一种双链突变载体，该载体包括a．第一条至少12个相连的核碱基以及不超过75个相连的核碱基的寡核碱基链，该链具有一个第一和一个第二末端核碱基；b．第二条与第一条链具有相等数目的核碱基的寡核碱基链；以及，该链视需要而定地分为第一段和第二段。c．一个3’末端核碱基和一个5’末端核碱基，其中ⅰ．第二条链的最3’端的和最5’端的核碱基分别与第一末端和第二末端核碱基为Watson-Crick碱基配对，以及ⅱ第二条链至少含有两个至少为5个连续核碱基的非重叠区域，它们与第一条链的核碱基及3’末端或5’末端核碱基为Watson-Crick碱基配对；其中至少有一条链的序列包含不同的、想要的序列。
36．如权利要求35中所述的方法，其中第二条链的最3’端的核碱基被保护避免3’核酸外切酶的攻击。
37．如权利要求35中所述的方法，其中第一条链的第二末端核碱基被保护避免3’核酸外切酶的攻击。
38．如权利要求35中所述的方法，其中第一条链中至少有一个碱基与第二条链的非互补核碱基配对。
39．如权利要求38中所述的方法，其中突变的寡核碱基链的序列包括靶DNA的序列，以及包括不同的、想要的序列的寡核碱基链的序列。
40．如权利要求39中所述的方法，其中第一条链的序列包括靶DNA的序列，以及第二条链包括5’末端核碱基。
41．如权利要求39中所述的方法，其中第一条链的序列包括靶DNA的序列，以及第二条链不包括核糖型核碱基。
42．如权利要求35中所述的方法，其进一步包括在细菌中瞬时产生功能RecA的步骤。
43．如权利要求35中所述的方法，其中一个末端核碱基和一个远端核碱基被保护避免3’核酸外切酶的攻击。
44．如权利要求35中所述的方法，其中DNA靶序列是一种细菌人工染色体或一种质粒的序列。
45．一种核酸，包括RecA基因操作性地与一种可诱导的启动子连接。
46．一种细菌，包含如权利要求45中所述的核酸。
全文摘要
本发明基于发现重组诱发剂寡核碱基在含有一段链转移活性(RecA)和错配修复活性(MurS)的原核细胞中是有活性的。采用该系统,一类术语为异源双链突变载体的双链突变载体,在原核细胞中表现出比以前所检测的多种类型的突变载体的活性更高。通过将一段核酸酶抗性的寡核苷酸(如四－2’－O－甲基－尿苷)替代四胸苷接头,来连接重组诱发剂的寡核苷酸的两条链并除去含有DNA的插入片段,得到了活性的进一步提高。本权利要求涉及含有以上优点的双链突变载体上。在一个可选的实施例中,本权利要求涉及双链突变载体在原核细胞中的使用。
文档编号C12N15/70GK1309721SQ99808541
公开日2001年8月22日 申请日期1999年5月12日 优先权日1998年5月12日
发明者R·库马, R·A·梅茨 申请人:金默拉根有限公司