光学鉴定聚合物的制作方法

专利名称：光学鉴定聚合物的制作方法
技术领域：
本发明领域本发明涉及用于分析聚合物的光学系统、方法和产品，更具体地说本发明涉及利用高定域光辐射用于检定聚合物单个单元的光学系统、方法和产品。
背景本专利申请要求具有1998年8月13日提出的美国专利临时申请60/096544和1999年2月14日提出的美国专利临时申请60/120414的优先权，这两个专利通过引用结合到本文中来。
细胞具有决定其功能的复杂微结构。许多与细胞结构和功能相联系的多样性是由于细胞具有组合各种结构单元成为多种化合物的能力。细胞通过从有限组称为单体或单元的结构单元组合成聚合物来完成这项任务。不同聚合物功能的关键是基于聚合物内单体的一级序列并且是完整理解细胞功能所必需的，诸如为什么细胞以特定方式分化或细胞如何应答具体药物的处理。
通过鉴定聚合物单体序列来鉴定其结构的能力是完整理解每个活性组分和组分在细胞内起的作用所必需的。通过测定聚合物的序列，可以制成表达图(exprossion maps)，用于测定什么蛋白质被表达、理解在病态下什么地方发生突变、和测定当一具体单体不存在或突变时是否多糖具有更好的功能或失去功能。
表达图涉及测定mRNA表达型式。鉴定各种不同表达的mRNA的需要对于时间和空间上理解遗传程序十分重要。在包括胚胎、生长和老化阶段的有机体生命发展的时间过程中，出现和消失了不同的基因。除了发展变化外，也存在对不同刺激诸如损伤、药物、外体和应力的响应而发生的短暂变化。及时记录特定细胞组在响应刺激或在生长中的表达变化的能力可产生所谓的时间表达图。另一方面，也有机体表达图，其包括不同组织和细胞类型的不同表达的基因的知识。因为表达图的产生涉及cDNA或mRNA的测序和鉴定，更快的测序意味着必须更快地产生多个表达图。
目前，只有1％的人类基团组和更少量的其它基团组已经被测序。另外，只获得了一个使用表达的序列标志的非常不完整的人体表达图(Adams等人，1995)。现有的基因组测序的方案缓慢且涉及费时费力的步骤诸如克隆、基因组文库的产生、集落挑取和测序。即使是一部分基因组分库的建立也要几个月的时间。即使在文库建立后，也需要长时间来制备供测序的DNA和实施实际的测序步骤。在这些不利因素的多方面影响下，显然即使是一个基因组的测序也需要大量金钱、时间和人力的投入。
一般来说，DNA测序使用以下两种方法中的一种来进行。第一种较流行的方法是Sanger等人(“用链终止抑制剂进行DNA测序”，Proc.Natl.Acad Sci.USA.74:5463-7,1977)所述的双脱氧链终止法。这种方法涉及在双脱氧核苷酸终止的DNA分子的酶合成。通过使用四个ddNTP，可合成一组在每个目标DNA的位置终止的分子。随后的分析获得了有关DNA分子的长度和每个分子终止处的碱基(A,C,G或T)的信息。用这种信息可测定DNA序列。第二种方法是Maxam和Gilbert测序(Maxam和Gilbert，“用来DNA测序的一种新方法”，Pro.Natl.Acad.Sci.USA.75:560-4,1977)，其使用化学降解来产生在目标DNA的某些位置降解的一组分子。用化学反应的解离专一性和片断长度的知识，得到DNA序列。两种方法均依赖聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射性DNA片断的照相显示。每个方法花约1到3天。Sanger测序反应只能一次产生300-800个碱基。
Sanger的方法提出提高序列信息的产量。Sanger的方法包括多重测序、毛细管凝胶电泳和自动凝胶电泳。最近，人们也越来越有意开发独立于Sanger的方法。独立于Sanger的方法使用完全不同的方法来获取碱基资料。该类型包含最新的技术，其包括扫描电镜术(STM)、质谱、酶促发光无机焦磷酸盐检测测定(ELIDA)测序、外切核酸酶测序和通过杂交测序。
目前，大规模测序最广泛使用的方法是自动凝胶电泳。自动化要求即时用电荷耦合装置(CCD)检测器读取荧光标记的Sanger片断。用不同标记的引物进行四个不同的双脱氧链终止反应。所述反应混合物被混合并一起在聚丙烯酰胺板上电泳。在凝胶末端使用激光激发，通过计算机分辨出分离的DNA片断并测定序列。现有许多商品自动仪器，每种使用不同的检测方法和标记方式。其中最有效的是Applied Biosystems Model 377XL，其最大实际速率达到每天115,200个碱基。
在毛细管凝胶电泳的方法中，反应样品通过小口径填充凝胶的毛细管分析。所述毛细管的小口径(50μm)使得可以有效分散电泳时产生的热。因此，可在没有过量焦耳加热(400V/m)下使用高的场强度，减少分离时间到每次反应运行约20分钟。不仅可更快分离碱基，而且也比常规凝胶电泳提高了分辨率。此外，进行许多毛细管平行分析(Wooley and Mathies，“使用毛细管电泳片的超高速DNA测序”，Anal.Chem.67:3676-3680,1995)可扩大产生的碱基资料(实际速率等于200,000碱基/天)。其主要缺陷是因为每次反应必须制备新装填凝胶的毛细管所以不能连续装载毛细管。毛细管凝胶电泳仪现已商品化。
多重测序是一种更有效使用电泳凝胶的方法(Church and Kieffer-Higgins，“多重DNA测序”Science,240:185-88,1988)。首先将Sanger反应样品用专用低聚物标记并然后在所述电泳凝胶的一泳道上运行多至20个不同样品。然后将所述样品吸印到膜上。然后依次将膜用与Sanger反应样品上的标记对应的低聚物探测。洗涤膜并连续再探测直到所有20个样品的序列均被测定。尽管凝胶电泳次数明显减少，但洗涤和杂交步骤与运行电泳凝胶一样费时费力。实际测序速率相当于自动凝胶电泳的速率。
质谱测序首先在80年代后期提出。该领域的最新进展已可更好地序列测定(Crain,MassSpectrom.Rev.9:505-54,1990；Little等人，J,Am.Chem.Soc.116:4893-4897,1994；Keough等人，Rapid Commun.Mass Spectrom.7:195-200,1993；Smirnov等人，1996)。质谱测序首先需要产生一组长度差一个碱基的嵌套DNA分子。片断的序列分析通过质谱进行。在一个实施例中，外切核酸酶被用于部分消化33-mer(Smirnov,“Sequencing oligonucleotides by exonuclease digestion anddelayed extraction matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,”Anal.Biochem.238:19-25,1996)。产生一组具有类似5’末端和不同的3’位终止(varying points of 3’termination)的分子。然后分析所述反应混合物。质谱具有足够灵敏度来分辨连续片断的质量差异，从而可产生序列资料。
质谱测序高度准确、便宜并比常规方法快速。但其主要局限在于读取长度为几十个碱基的水平。即使是最好的方法，矩阵辅助激光解吸离子化时间飞行(MALDI-TOF)质谱(Smirnov et al.,“Sequencingoligonucleotides by exonuclease digestion and delayed extraction matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight massspectrometry,”Anal.Biochem.238:19-25,1996)只能获得80到90个碱基对的最大读取长度。由于在分析步骤中更长的DNA在胍的部位中碎裂，因此更长的读取长度是物理上不可能的。因此质谱测序局限于确证短的引物序列，在大规模测序中没有实际的应用。
扫描隧道显微镜(STM)测序(Ferrell，“扫描隧道显微镜在DNA测序中的使用”Molecular Biology and Biotechnology,R.A.Meyers编辑VCH出版，New York,1997)方法在STM商品化时提出。能直接从电子显微照片读取碱基对资料的最初期望不再可能。DNA分子必须置于通常高度有序的热解石墨(HOPG)或金的传导表面。它们缺乏足够稳定保持DNA以抵抗隧道尖端施加的物理或电子力移除的结合位。DNA分子难于通过静电粘附在所述表面。即使成功地固定DNA，由于需要极高的分辨率，也难以分辨碱基资料。现代技术可从嘧啶中分辨出嘌呤，但不能鉴定单独的嘌呤和嘧啶。获得这种技艺的能力需要能分辨嘌呤的醛基和胺基以及嘧啶上的甲基存在与否的电子显微镜。
酶促发光无机焦磷酸盐检测测定(ELIDA)测序使用对从DNA聚合释放的焦磷酸盐的检测来测定连续碱基的加入。由DNA聚合反应释放的焦磷酸盐通过ATP硫酸化酶转变成ATP并且所述ATP的生产通过萤火虫荧光素酶连续监测。为了测定碱基的特异性，该方法使用ATP、CTP、GTP和TTP的连续洗涤。如果ATP的洗涤产生焦磷酸盐，则混入一种或多种腺嘌呤。混入碱基的数量正比于产生的焦磷酸盐的量。产生的序列信息的增强可通过同时进行许多ELIDA反应的平行分析来获得。
外切核酸酶测序涉及荧光标记的单束DNA分子，其悬浮于流动流中并依次被外切核酸酶解离。然后释放出独立的荧光碱并通过单分子检测系统。所标记的核苷酸检测的时间序列相应于DNA的序列(Ambrose等人，“单分子检测在DNA测序和分级中的应用”Ber.Bunsenges.Phys.Chem.97:1535-1542,1993；Davis等人，“基于单分子检测的快速DNA测序”Los Alamos Science.20:280-6,1992；Jett等，“高速DNA测序一种基于单分子荧光检测的方法“J.Of Bio.Structure&Dynamics.7:301-9,1989)。使用加工外切核酸酶，理论上可以每秒10个碱基的速率测序10000bp或更大片断。
在通过杂交方法测序中，用一系列包括所有可能的低聚物序列的低聚物对目标DNA依次进行探测。目标DNA的序列用所述低聚物和所述目标间的杂交型的知识产生(Bains，“用以DNA测序的杂交方法”Genomics.11:294-301,1991；Cantor等，“通过杂交工艺测序的报导”Genomics.13:1378-1383,1992；Drmansc等，“杂交测序”InAutomated DNA Sequencing and Analysis Techniques,J.Craig Ventor编辑.Academic Press,London,1994)。探测目标DNA有两种可能的方法。“上探测”法包括在一基片上固定目标DNA并用一系列低聚物连续探测。另一方面“下探测”法则要求将一系列低聚物固定在一基片上并与目标DNA杂交。随着向DNA探针施用微芯片合成技术的“DNA芯片”的出现，可在一个1cm2的面积上产生几千个不同DNA探针的阵列，使得下探测方法更实际可行。对于一个8-mer来说，上探测方法将需要65536次连续的探测和洗涤，这将花费大量的时间。通过完美杂化，6,5536个八聚物探针将最多测定170个碱基。用65,536个“混合的”11-mers，可产生700个碱基。
大多数这些技术的最常见局限性是短的读取长度。实际上短的读取长度意味着在目标DNA的线性顺序可被译码前需要测序另外的遗传序列信息。短的片断必须与另外的重叠片断桥连一起。理论上，对于500个碱基的读取长度，人类基因组的所有3×109个碱基的线性序列被适当排序前最小需要对9×109个碱基测序。现实中，产生可信基因组所需的碱基数目为约2×1010个碱基。不同技术的比较表明只有不实用的外切核酸酶测序在理论上具有长读取长度的能力。为了减少需要测序的碱基数，显然必须提高读取长度。
蛋白质测序通常涉及例如通过Edman降解的端氨基酸残基的化学诱导顺序去除和鉴定。参见Stryer,L.,Biochemistry,W.H.Freemanand Co.,San Francisco(1981)24-27页。Edman降解要求所述多肽具有与异硫氰酸酯反应的自由氨基。所述异硫氰酸酯通常为异硫氰酸苯酯。所述加合物与最近的聚合物的骨架酰胺基分子内反应形成五元环。这种加合物重排并然后端氨基酸残基使用强酸解离。鉴定释出的氨基酸的乙内酰苯硫脲(PTH)并且缩短的加合物可再进行降解和分析的重复循环。
此外，也有人描述了多肽的羧端基测序的几种新方法。参见Inglis,A.S.,Anal.Biochem.195:183-96(1991)。羧端基测序方法类似于Edman降解，但是涉及从聚合物的另一端的顺序降解。参见Inglis,A.S.,Anal.Biochem.195:183-96(1991)。类似于Edman降解，羧端基测序方法涉及端氨基酸残基的化学诱导顺序去除和鉴定。
新近，有人描述了通过制备一嵌套系列(序列限定系列)的聚合物片断并接着进行质量分析进行多肽测序。参见Chait,B.T等，Science257:1885-94(1992)。通过比较片断与已知质量氨基酸残基间的相对质量差来测定序列。尽管形成嵌套(序列限定)系列的聚合物片断为DNA测序的需要，这种方法基本不同于包括每个残基的顺序移除和鉴定的常规蛋白质测序方法。尽管这种方法在实践中具有潜力，但是其具有几个问题并且证实并非为一种有效方法。
每一种已知的聚合物测序方法均有缺陷。例如大多数方法缓慢且劳力密集。基于凝胶的DNA测序方法鉴定300-800单元的聚合物的系列需要约1到3天。诸如质谱和ELIDA测序的方法只可针对非常短的聚合物。
因此存在新的聚合物序列测定方法的需要。测序的速率一直限定了产生多体和时间表达图(其无疑有助于复杂遗传官能的快速测定)的能力。为了加速进行疾病诊断和新药制备的速率，也存在改善分析聚合物的系统和方法的需要。
本发明简述本发明涉及用于分析聚合物的新系统、方法和产品，特别是涉及可用于测定聚合物序列的新系统、方法和产品。本发明具有许多优于先有聚合物测序技术的系统和方法之处。使用本发明的方法测定整个人类基因组序列可比使用常规技术快几个数量级。除了进行整个基因组的测序外，本发明的方法和产品可用于产生发育和疾病进程的全面和多个表达图。测序单个基因组和产生多个表达图的能力将大大增强测定表型性状或疾病进程的遗传基础的能力。
本发明的一方面，用于光学分析聚合物的连接单元的系统包括光源、干涉站、光学检测器和处理器。光源构建用于发射所选波长的辐射。干涉站构建成用于接收所发射的辐射和由光源发射的辐射产生定域辐射点。也将干涉站构建成用于顺序接收聚合物的单元并布置用于在所述定域辐射点顺序辐照所述单元。光学检测器构建用于检测包括所述定域辐射点与所述单元相互作用得到的特征信号的辐射。处理器被构建和布置用于根据所测辐射分析所述聚合物。
该方面优选的实施方案包括一种或多种下面的特征构建所述干涉站来顺序接收用辐射敏感标记物选择性标记的单元并且所述干涉包括辐射敏感标记物对定域辐射的干涉。
所述辐射敏感标记物包括荧光团。
所述干涉站包括构建来接收所发射的辐射和提供随其出现的瞬逝辐射的波导管。
所述干涉站包括具有1nm到500nm的狭缝，其中所述狭缝产生定域辐射点。
所述干涉站包括布置用来产生定域辐射点的微通道和具有亚微粒子宽度的狭缝。所述微通道构建用于接收和推进聚合物单元通过定域辐射点。
狭缝的宽度在10nm到100nm的范围。
所述系统可包括一个偏振器并且所述光源为用于发射辐射光束的激光，偏振器用于偏振达到狭缝前的激光束。
所述偏振器可布置成偏振与狭缝宽度平行或与狭缝宽度垂直的激光束。
所述干涉站可包括与布置用于接收伸直形式聚合物的微通道垂直的几个狭缝。
所述干涉站可包括构建和布置用于提供推进聚合物单元通过微通道的电场的一系列电极。
所述系统还可包括构建和布置用于伸直聚合物并将伸直聚合物提供到干涉站的校直站。
在另一实施方案中光学分析聚合物连接单元的方法包括用辐射敏感标记物标记所选的聚合物单元；
顺序将所述聚合物的单元通过微通道；产生所选波长的辐射来由此产生定域辐射点；在定域辐射点顺序辐照标记的聚合物的单元；顺序检测提供源于定域辐射点与标记物或所述单元相互作用的特征信号的辐射；和根据所测辐射分析所述聚合物。
在另一实施方案中，所产的制品用于光学分析聚合物连接单元，其包括在一基片上制造并构建用来接收辐射和由此产生定域辐射点的干涉站。所述干涉站还构建成顺序接收聚合物的单元并布置成在定域辐射点顺序辐照所述单元而产生辐射的特征信号。
按照另一方面，用于光学分析聚合物连接单元的系统包括光源、干涉站、光学检测器和处理器。光源构建成能发射选择波长的辐射。干涉站构建成能接收所发射的辐射和构建成顺序接收聚合物的单元并布置成在用由光源发射的辐射激发的瞬逝辐射顺序辐照所述聚合物单元。将光学检测器构建成能检测包括源于由所述单元对瞬间辐射的作用的特征信号的辐射。处理器被构建和布置成根据所测辐射分析所述聚合物。
该方面优选的实施方案包括一种或多种下面的特征构建所述干涉站来顺序接收用辐射敏感标记物选择标记的单元并且所述干涉包括所述辐射敏感标记物对瞬逝辐射的干涉。
所述辐射敏感标记物包括荧光团。
所述干涉站包括构建接收所发射的辐射和提供随其出现的瞬逝辐射的波导。
所述波导是一种介电波导，构建用于获得导入光的全内反射。所述波导是一方镜，金属镜层围绕着介电物，而使导入光具有低的损失。所述波导包括一个在所述金属镜层上具有一小孔的尖稍，并布置用来发射瞬逝辐射。所述波导包括构建用来辐射瞬逝辐射的尖端。
所述干涉站包括位于波导尖端的毫微通道并布置用来接收伸直形式的聚合物。
所述干涉站包括构建和布置用于提供推进聚合物单元通过所述毫微通道的电场的一系列电极。所述电极是内电极。
所述电极是外电极。所述毫微通道在2到50纳米之间。
所述波导还构建和布置用来接收包括特征信号的辐射和将接收的辐射光耦合到光学检测器中。
所述干涉站包括另一构建和布置用于接收包括特征信号的辐射和将接收的辐射光耦合到光学检测器的波导。
所述系统还包括构建和布置用于伸直聚合物并将伸直聚合物提供到干涉站的校直站。
本发明的再一方面是用于利用连接单元的共焦荧光照明(confbcalfluorescence illuminatiom)光学分析聚合物的系统。所述系统包括构建用来发射光辐射的光源；构建用于接收和过滤所述光辐射成已知波长的过滤器；构建用于接收所述过滤的光辐射的分光镜；构建用于所述过滤的光辐射和从所述过滤的光辐射产生定域辐射点的干涉站，所述干涉站也构建成用于顺序接收所述聚合物的单元和布置成在所述定域辐射点顺序照射所述单元；构建用于检测包括源于所述单元在所述定域辐射点的作用的特征信号的辐射的光学检测器；和构建及布置用于根据包括所述特征信号的检测辐射分析所述聚合物的处理器。
在一个实施方案中，干涉站构建用于顺序接收用辐射敏感标记物选择性标记的所述单元，在所述定域辐射点产生所述特征信号。在另一实施方案中，所述辐射敏感标记物包括荧光团。在一些实施方案中，所述过滤器为激光线过滤器。
所述系统也可包括物镜，其中所述物镜聚焦所述过滤的光辐射。
所提出的用于分析聚合物的系统和方法具体可用于测定DNA分子内单元的序列并可消除对产生基因组文库、克隆和集落挑取的需要，而所有这些均构成了漫长的预测序步骤，它们是目前基因组规模测序方案中的主要限制因素。此中公开的方法提供了比现有技术长得多的读取长度并使序列读取快上百万倍。所提出的读取长度为大约几十万个核苷酸。在可以进行染色体组重建前这显著降低了对重叠和冗余序列的需要、降低了需要测序的DNA的实际量。由于此中所提出要求保护的新装置(其被称为毫微通道板或微通道板)提供的极大的平行放大，阅读一定数量聚合物单元所花实际时间比现有方法快百万倍。所有这些因素的组合成一种包括测序在内的聚合物分析的方法，其将在分子和细胞生物学领域提供巨大的进展。
图2说明用于

图1的系统中的校直站和第一干涉站。
图3是沿图2所示线3-3的校直和站第一干涉站的横截面图。
图4是图2所示校直站和第一干涉站的一部分的俯视图。
图4A说明位于图4所示的第一干涉站的纳米狭缝的布置。
图4B说明用于鉴定荧光团标记的聚合物单元的光学系统。
图5和5A说明用于图1系统的第二干涉站。
图6到7B说明图4所示校直站和第一干涉站的制造。
图8是所制造的校直站和第一干涉站的SEM显微照片。
图9、10A、10B、和10C显示图8的校直站和干涉站的测试结果。
图11是按照第一干涉站的另一实施方案的光波导的中心线横截面图。
图11A是在图11中显示的光波导的透视图。
图11B和11C说明线性化聚合物与由光波导发射的瞬逝辐射的相互作用。
图12说明如随图11的光波导使用的近场和远场检测的光系统。
图13、13A和13B说明进入图11的光波导的电磁辐射的耦合。
图14A到16G说明图11所示的光波导的制造。
图17是利用共焦荧光照明的光学装置和用于聚合物线性分析的检测的示意图。
图18是用于校直和伸展聚合物的校直站的另一实施方案的俯视图。
优选实施方案的详细说明参照图1，用于鉴定聚合物的各个单元的干涉系统包括系统控制器10、聚合物供料处20、微观流体泵25、聚合物校直站30、第一干涉站40和第二干涉站50。系统控制器10可为通用计算机。微观流体泵25从聚合物供料处20提供所选量的聚合物27到聚合物校直站30。受系统控制器10控制的聚合物校直站30使用力场和机械阻隔物校直各聚合物并将所述聚合物分配到第一干涉站40。第一干涉站40使用一光学系统鉴定所通过的聚合物的各单元。所述光学系统包括光源42、滤光器45、光学检测器46和其它与光源和检测器相关的光学元件和电子元件。所述光学系统通过光学控制器48控制。
当聚合物的各单元通过干涉站40时，光源42发射出向着干涉站40的光学组件的辐射。所述光学组件产生直接与聚合物单元相互作用、或与选择性连接到聚合物单元的标记物相互作用、或与聚合物单元和标记物两者相互作用的定域辐射点。所述定域辐射点包括非辐射近场或瞬逝波，定域于至少一标准尺寸。定域辐射点提供了比常规光学系统所用的衍射局限分辨率高得多的分辨率。
此外，干涉站40使用独特的布置和几何形状，而让定域辐射点与一个或几个纳米级或更小尺寸的聚合物单元或连接的标记物相互反应。光学检测器46检测由所述相互作用改变的光并将检测信号提供给光学控制器48。第二干涉站使用电场或电磁场。使用X-射线辐射或可见或红外辐射鉴定从第一干涉站40通过第二干涉站50的聚合物。控制器56控制第二干涉站50的运作。控制器48和56均与系统控制器10相连。
参照图2和3，聚合物校直站30和第一干涉站40包括基片92、石英晶片60和光学玻璃面层90。基片92由非导体的化学惰性材料诸如Teflon或Delrin加工而成以便于传导流体96(如琼脂糖凝胶)和所测试聚合物的流动。基片92包括加工用来分别放置金线98A和98B的槽94A和94B，其具有按照用于推进聚合物分子39通过第一干涉站40的电场的形状选择的形状。石英晶片60在区域91处封在基片92上。
或者槽94A和94B和线98A和98B可由直接位于石英晶片60上的金属区代替，或可由用于产生电场的外电极代替。通常所述电极相隔约毫米到5厘米，优选2厘米的距离并通常提供约20V/cm的电场强度。
图4和4A显示本发明优选的校直站30和第一干涉站40的实施方案。图4是造在石英晶片60上的校直站30和第一干涉站40(也显示在图2)的一部分的俯视图。当然，单个石英晶片60可包括成百上千个校直和第一干涉站。石英晶片60包括覆盖有金属层62(如铝、金、银)的石英基片并具有在所述表面上制造的微通道41。通过金属层62所造的是狭缝36A、36B和36C，它们构成了提供定域辐射点的光学元件。狭缝36A、36B和36C具有1nm到5000nm、优选10nm到1000nm、更优选10nm到100nm间的选择宽度。狭缝36A、36B和36C横穿过微通道41(具有1微米到50微米宽度和几百微米的长度)。由金线98A和98B产生的电场拉动聚合物链39(诸如DNA分子)通过微通道41而透过狭缝36A、36B和36C。
如图4所示，聚合物校直站30包括几个位于区域31的校直柱。区域31经过度区34与微通道41相连。校直柱32具有环状横截面并直径约为1微米。校直柱32相隔约1.5微米并根据所测聚合物的长度而离微通道41约5μm到500μm(并优选约10μm到200μm)。例如，当聚合物为具有大约167000个碱基对的噬菌体T4 DNA时，校直柱32位于离毫微狭缝36A约30微米处。通常，离毫微狭缝36A的距离为聚合物39的预计长度的大约一半。
图4A说明从光源42发射的光束65用在金属层62中形成的毫微狭缝36干涉而产生定域辐射点67。大小比毫微狭缝36的宽度大许多倍的激光束65辐照石英晶片60的背面。穿透石英晶片60并与毫微狭缝36干涉。作为非辐射近场的定域辐射点67在聚合物链39拉过微通道41时顺序辐照聚合物链39的单元。定域辐射点67可理解为从毫微狭缝36发射的瞬逝波。因为毫微狭缝36的宽度小于光束65的波长，所以所述辐射为菲涅耳方式。
所述光学系统也可包括在光源42和石英晶片60间的偏振器43和在石英晶片60和光学检测器46之间的陷波滤波器45。当偏振器用平行于毫微狭缝36的长度的E矢量定向光束65时，存在由毫微狭缝36发射的近场辐射并且没有远场辐射。当偏振器用垂直于毫微狭缝36的E矢量定向光束65(其为许多长波长)时，存在来自毫微狭缝36的远场辐射。通过选择偏振入射束65，所述光学系统可在近场和远场辐射间变换。
图4B说明了用于鉴定由荧光团标记的聚合物单元的光学系统。所述光学系统包括激光源80、声光可调谐滤光器82、偏振器84、陷波滤光器86、增强器和CCD检测器88和与录像机VCR 89相连的视频监视器87。聚合物链39的各单元用对所选激发波长敏感的荧光团68选择性标记。声光可调谐滤光器82用于选择从激光源80发射光的激发波长。激发束65与毫微狭缝36(在图4A中所示并在此标为区域40)干涉而产生非辐射近场67。在金线98A和98B(图2和3)间的电场以已知的速率拉聚合物链39引起每个标记单元与辐射67相互作用。随荧光团68移动通过狭缝36A、36B和36C(图4所示)，发射的辐射67激发重发射荧光辐射72的荧光团68。正如本领域人们所知道的，陷波滤光器86通过辐射70的荧光波长(72)并衰减激发波长来提高信噪分辨率。位于石英晶片60上方几毫米到几厘米处的CCD检测器88检测荧光辐射72。CCD检测器88可分别检测随荧光团移动通过时每个毫微狭缝36A、36B和36C的荧光辐射72。这个过程在许多位于石英晶片60上的毫微狭缝处发生。
电场可用于置聚合物39在毫微狭缝36附近。毫微狭缝36“发射”非辐射场67，其在仅一或两个波长的距离范围被衰减。为了置荧光团68在非辐射场67的范围内，聚合物39可能需要被更拉近到毫微狭缝36(和金属膜62)并由此更接近金属层62。使用通过向金属层62施加AC场产生的介电力将聚合物39更拉近毫微狭缝36。参见例如“在不均匀电场诱捕DNA”Charles L.Ashbury和Ger van denEngh著，Biophysical Journal 74卷，1024-1030页(1998)，“生物聚合物的分子介电泳”M.Washizu,S.Suzuki,O.Kurosawa,T.Nishizaka和T.Shnohara著，IEEE Transactions on Industry Applications,30卷，4期，835-843页(1994)，和“在微量生产设备中DNA的静电操作”M.Washizu和O.Kurosawa著，IEEE Transactions on Industry Applications,26卷，6期，1165-1172页(1990)。通常，参见“介电泳中性物质在不均匀电场的行为”Pohl.H.A.,Cambridge University Press,Cambridge,UK 1978。不均匀场将吸引聚合物39(如DNA分子)的极化单元到金属层62。
参见图5，第二干涉站50测量随线性化聚合物分子接近和通过毫微通道越过毫微通道的离子流。所测的离子流的阻断被用于鉴定所述聚合物分子的长度和聚合物的其它特性。干涉站50接收来自第一干涉区40的线性化聚合物39并使用电极52和53以垂直于电极54和55的方向施加横贯通道电压来将聚合物分子拉过通道51。电极54和55与位于控制器56的微安计56A相连以测定通过毫微通道51的离子流。或者，参见图5A，微安计被电桥56B替代，其比较没有聚合物39(Zl)的通道51的阻抗与其瞬时阻抗(Zx)。在通道51中没有聚合物39时，伏特计测定值为0V。随着延伸的近乎线性的“线”39通过通道51，其存在明显降低或完全阻断了从电极54到电极55的正常离子流。
使用亚微粒子平金属钣印刷制造电极54和55并与所述桥相连以检测阻抗的变化或与微安计相连测量离子流。将穿过通道测得的数据放大，并使用低通滤光器将放大的信号滤光(例如每秒64,000样品)并通过模数转换器在所选采样速率下将所得数据数字化。系统控制器10用聚合物单元的速度来校正离子流的瞬时降低并测定所述聚合物的长度例如DNA或RNA分子的长度。
在另一个实施方案中，光学系统包括能从单个荧光团检测荧光的超快、高灵敏分光光度计。光源42是激发波长的锁模Nd∶YAG激光发射辐射。所述系统使用将参比束提供给光电二极管的分光器和提供初始脉冲给时间-振幅转换器(例如Tennelec 863)的鉴别器(例如Tennelec TC454)。主光束65导过调节功率水平的中性密度滤光器。正如上面所述，与非辐射近场67相互作用的荧光团激发荧光72，其在干涉滤光器(例如Omega Optics制造)分光滤光后由检测器46收集并通过雪崩光电二极管或光电倍增管(例如Hamamatsu R1562UMCP微通道光电倍增管)检测。微通道光电倍增管信号通过放大器放大并通过鉴别器(例如Tennelec C4534鉴别器)整形。将具有适当时间延迟的信号提供到时间-振幅转换器(TAC)。定时-选通TAC输出通过万能定标器计数并经VME界面连接到系统控制器10。对于来自每个检测器的信号来说，系统控制器10提供作为每种类型的耦合到聚合物39的单元的发荧光荧光团的特征的时间延迟条带图。
不同的荧光团具有不同的荧光寿命(即分子在通过荧光光子发射回到基电子态前保持激发态的时间)，其通常具有指数概率分布。荧光寿命可用于荧光团的鉴定。在快速测序中，系统可使用具有相似光谱但不同寿命的相关染料，因此只用一个激光源发射发射激发波长以及一个检测器检测荧光辐射。
在另一实施方案中，光学系统使用频率为10MHz到1GHz的调制辐射(如单边带或双边带调制)，使用相调制技术来鉴定与聚合物单元相邻的单荧光团的荧光。例如，激光源发射光束65，其使用在100MHz频率下的正弦信号强度调制。激发的荧光辐射72使用光电倍增管检测。相应的信号被零差探测或外差探测以分辨来自荧光团的特征信号如荧光寿命。(参见例如Lackowicz.J.R.“Gigahertz Frequency-Domain Fluorometry:Resolution of Complex Intensity Decays,Picosecond Processes and Future Developments.”Photo Migration inTissues,Academic Press,NY,169-186页，1989；也参见其它其引用的参考文献)图6到图7B说明图4中所示的校直区30、微通道41和狭缝36A、36B和36C的制造。图6是石英晶片60的侧视图，其为约400微米厚并在两面抛光。首先300纳米厚的铝膜62蒸镀在晶片上并以六甲基二硅氧烷(HMDS)涂布35分钟(图6)。然后，将光致抗蚀剂Shipley1813以4000rpm的转数旋涂晶片60秒钟，并将晶片在115℃热板上烘烤将抗蚀剂硬化(图6A)。将晶片曝光并将光致抗蚀剂在1∶1 MF312显影剂中显影并水浸60秒钟。使用Cl反应性离子蚀刻机PK1250蚀刻粗制铝图形(图6B)。图6C显示具有部件(显示为方框)和校直(标记为交叉)的晶片俯视图。在1000W RF功率的Branson桶形蚀刻机中使用the resist descum方法除去所有抗蚀剂残余(图6D)。
参见图6E，将PMMA抗蚀剂(4％950K/甲基异丁酮)以3000rpm的速度旋涂在晶片上60秒钟并将晶片在180℃热板上烘烤30分钟。然后将100A的金金属层蒸镀到所述PMMA光致抗蚀剂上以避免电荷积累。所示PMMA光致抗蚀剂暴露于e-束系统以限定毫微狭缝。将曝光的PMMA抗蚀剂在IPA∶MIBK 3∶1中显影1分钟，并将100A金金属层蚀刻(图6F)。接着，通过使用Cl反应离子蚀刻PK1250蚀刻铝1.5分钟限定毫微通道构型(图6G)。使用在1000W RF功率下的Branson桶形蚀刻机去除光致抗蚀剂10分钟(图6H)。为了产生校直区30和微通道41，使用等离子体增强的化学气相沉积(PECVD)在T=240C、450毫托、50W RF功率下用15sccm的硅烷、50sccm的N2O(图6I)沉积1微米的SiO2层。所述SiO2层通过化学机械抛光(CMP)平整。
图7到7B是沿一个毫微通道的晶片的侧视图。参见图7，校直区30和微通道41通过首先将光致抗蚀剂Shipley 1813以1800rpm旋涂60秒钟旋涂在晶片上来限定。抗蚀剂在高分辨率掩膜对准器诸如5x g-线分档器(stepper)中曝光并在1∶1 MF312和水中显影60秒钟。在CHF3(50sccm)+O2(2sccm)中使用活性离子蚀刻(RIE)蚀刻SiO2层而给出如图4所示的SiO2层的式样。使用Branson桶形蚀刻机在1000W RF功率下去除光致抗蚀剂10分钟。接着，使用PECVD沉积10nm到100nm的保护SiO2层(图7B)。玻璃面层90(图2中所示)可阳极结合到石英晶片60上或可使用RTV薄层连接到晶片60上。
图8显示了具有两个制成的校直区30和两个干涉区40的SEM显微照片。如图4所示，每个校直区30包括微柱32，每个干涉区40包括微通道41和毫微通道36A、36B和36C。
参见图9到10C，将装配好的校直区30和干涉区40(图8所示)在下面实验中测试。
将来自准直的Ar∶Kr离子激光的CW激光聚焦在晶片60的背面(如图4A所示)。具有488nm激发波长的激光束65在接近荧光团68的另一侧膜62上产生非辐射近场。显微物镜捕捉到了560nm的荧光远场辐射，其通过光电倍增管以时间相关方式记录。然后时间相关信号以大致等于狭缝36宽度的空间分辨率提供目标物质通过狭缝的记录。
图9显示了光电倍增管对0.5微米球通过2.0微米宽的狭缝(曲线94A)和0.1微米宽的狭缝(曲线94B)的响应。曲线94A和94B代表了作为时间函数的光电倍增管的电压。如所期待的那样，小的狭缝产生窄的曲线94B，它是这种装置的最小响应。
图10A到10C显示了同时通过相隔10微米的两个毫微通道的荧光珠和yoyo-1染色的T4 DNA的置放。图10A显示了珠粒通过第一狭缝和随后通过第二狭缝的两个强峰。图10B显示了部分未解螺旋的DNA束通过传送通道的情况。较宽的峰99A和99B是由于DNA螺旋的几何形状造成的。荧光珠粒的通过叠加了DNA信号。图10C显示了传送通过三个狭缝36A、36B和36C的高度伸展的DNA。还有，作为参考，来自荧光珠粒的信号叠加在DNA信号上。较宽的峰97A、97B和97C是由于DNA螺旋的几何形状造成的。
图11是具有波导160的石英晶片150沿所述波导中心轴的横截面图。波导160包括在石英晶片150上制造的具矩形横截面的两个波导166A和166B。矩形波导166A和166B可以是使用具不同折光率的两种介电材料并将光限定在具有比周围介电材料的折光率(n1)大的折光率(n2)的芯材料上(n2＞n1)的矩形波导。或者，矩形波导166A和166B可以是使用被金属材料包围的介电芯材料的矩形镜波导，或者波导166A和166B通过两种类型的波导的组合形成。
所述矩形介电波导理想地获得光传播的全内反射，其中入射角θl＞θc。为了使用全内反射限定导入光，干涉站40使用在尖端具非常小角度的三角波导。矩形镜波导通常展现出取决于所述金属镜质量的较高的损失。矩形镜波导传送光波长(λ)的上限到波导高度(h)的两倍(λ=2h)。因此这些波导具有设计用于可进行聚合物测定的选择范围波长的光传播的高度。更详细的情况可参见Bahaa E.A.Saleh和Malvin Carl Teich的“光子学原理”，John Wiley&Sons.1991。
正如在图11A的透视图中所示，波导166A和166B对称定位，它们的尖端170A和170B沿毫微通道171限定的对称轴对直(图11B所示)。毫微通道171具有2到100nm、优选5到50nn的宽度。金线98A和98B(图11B所示)与毫微通道171相隔约3到25毫米。或者如图11C所示，所述两个波导装置可被具有一个相对电极(形成100纳米到1微米的更宽通道)的单个波导代替。
图11和11A所示的三角波导166A和166B为约10微米宽、5000微米长和超过1微米高并由SiO2构成。波导166A和166B分别通过金属层164A和164B与基材162隔开并通过金属层174A和174B和玻璃面层152隔开。(或者，用于波导166A的金属层164A和174A或用于波导166B的金属层164B和174B可用具较低折光率的介电层代替)。导入的平面波176在输入面168A耦合到三角波导166A并随其向波导尖端170A透射而在波导面172A和173A内反射。波导尖端170A发射瞬逝辐射波(图11B所示)进入毫微通道171。在毫微通道171中，瞬逝辐射与聚合物各单元相互作用产生具特征信号的辐射。例如，瞬逝辐射与位于聚合物39一具体单元邻处的荧光团作用。三角波导166B收集包括来自毫微通道171的特征信号(例如荧光辐射)的辐射并将这种辐射透到耦合区168B。随着收集的辐射在波导166B内部传播，所述辐射可在三角面172B和173B进行全内反射。提供辐射188的输出面168B光学耦合到光学检测器46(图1)。还有，来自毫微通道171的辐射也在方向189通过玻璃面层152发射。位于毫微通道171上方几毫米到几厘米处的另一个外光学检测器检测远场辐射189，如图12所示。
图11B是每面被金属层围绕的两个三角波导166A和166B的横截面图，其中交叉阴影线图案表示波导面172A、172B、173A和173B的金属层。但是，金属层并不完全覆盖三角波导166A和166B的尖端170A和170B。尖端170A和170B的金属层可在用于产生毫微通道170的蚀刻或铣削(milling)过程中除去(如下所述)。通过基本上将整个波限定在SiO2区内波导166A将导入的光束176传送到尖端170A。在顶端170A，波导166A发射瞬逝波177，其在介电波导中以q-1(其中q=n1.2ω/c[(sinθl/sinθc)2-1)1/2)衰减(参见例如P.Yeh的“Optical Waves in Layered Media”,John Wiley&Sons,1988)。这样对于全内反射(θl＞θc)来说，瞬逝波在只有一个或两个波长的距离被衰减。瞬逝辐射177的波与通过毫微通道171的聚合物单元作用。例如，瞬逝波177与选择性连接到聚合物39的所选单元的荧光团178作用。荧光团178发射在所有方向传播的荧光辐射179。荧光辐射179通过波导166B收集并传送到检测器46(图1)。
图11C是使用单个三角波导166和一个金属电极185的另一种实施方案的横截面图。在波导166和金属电极185间形成的通道171A为约0.5微米，其明显大于毫微通道171。三角波导166的所有面均被金属层包绕并类似于波导166A和166B(图11A)那样制造，其中交叉阴影线图形表示在波导面172和173上的金属层。类似于波导166A的情况，尖端170A发射瞬逝波177，其在只有一个或两个波长的距离衰减。因此，聚合物39必须比电极185更拉近到尖端170以便用瞬逝波177辐照荧光团178。
利用通过在施加在线98A和98B的DC场基础上施加AC场到电极185和波导166(即金属层164和174)产生的介电力将聚合物39拉近到尖端170。正如上面结合图4A的所述，相应于DC场来说电容性施加的AC场在毫微通道171A中产生不均匀的场。
图12说明了用于检测从毫微通道171发射的近场和远场辐射的光学系统100。光源44发射光束176，其使用联系图13到13B所述的技术聚焦在波导166A的输入面168A上。在瞬逝波176与聚合物39作用后，近场辐射通过波导166B收集并从输出面168B光学耦合到光学检测器46。以方向189发射的远场100被透镜102收集、被可调谐滤光器104滤光并提供到PMT检测器106。光源42诸如LED或激光二极管可结合到石英晶片150上。这种布置可消除与输入面168A对直的外光源的需要。所述光源使用直接带隙材料制备，例如产生UV辐射的GaN或产生绿色波长辐射的GaP∶N。
石英晶片150也可包括集成的光学检测器46以避免使用用于检测和滤光的外部装置。集成的雪崩光电二极管或PIN光电二极管与滤除激发波长的原位滤光器(insitu filter)一起接收光束188。各种集成光学元件由Karl Joachim Ebeling描述于“集成光电子学-波导光学、光子学、半导体学”Spring-Verlag,1992。例如，一种波纹波导被用作反向耦合器从而使在一窄频带内的光被发射回来而起滤光作用。另一滤光器使用具有不同分散关系非常接近的两个波导制备。从一个波导的光波长耦合到另一个波导的光上，其存在折射率的匹配。通过往波导施加一个电压，分散曲线漂移并且得到的滤光器的光谱被改变而提供了可调谐的滤光器。
在另一实施方案中，所述光学系统是如上所述能检测来自单个荧光团的荧光的超快、高灵敏的分光光度计。
在另一实施方案中，光学系统使用使用如上所述的在10MHz到1GHz范围的频率调制的辐射。
图13到13B显示从外光源到波导的光的不同类型的耦合。参见图13，光源42发射光束176，其通过使用聚焦透镜180被聚集在三角波导166A的输入面168A。或者，参见图13A，棱镜182被用于将光束176耦合到三角波导166A。光束176通过棱镜182衍射并在内部进行全内反射。棱镜182位于SiO2区166A的表面并且被布置用于将光束176通过层184光学耦合到波导166A。或者，参见图13B，衍射光栅186被用于将光束176耦合到三角波导166A。光栅186制作在波导166A上从而其将光束176朝尖端170A衍射。或者，光学纤维耦合光束176到三角波导166A。将光耦合到波导的不同方法由Clifford R.Pollock描述于光学原理，Richard D.Irwin.Inc.,1995。
波导166A和166B在石英或另一种绝缘材料上制成以避免在基材150中的电流。为了在毫微通道区获得所需的高分辨率(即10nm的分辨率)，制造方法只使用UV平金属钣印刷术或连同深UV平金属钣印刷术、e-束平金属钣印刷术或X-射线平金属钣印刷术。相邻波导首先使用标准UV平金属钣印刷术确定并然后在单独的e-束或X-射线平金属钣印刷步骤确定毫微通道(或微通道171A，如图11C所述)。在包括尖端170A和170B处的辐射狭缝的波导实施方案中，狭缝(或小孔)通过在波导166A和166B的最尖端170A和170B处产生光致抗蚀剂的凹状(即一个凹口)产生，和通过在蒸镀金属前在面172A、173A、172B和173B上产生光致抗蚀剂的凸形来产生。由此，所形凸出面将被蒸发的金属覆盖，所述凹入尖端则不会。或者，通过首先产生一个非常薄的壁并然后使用取离或蚀刻来产生在壁上具有小狭缝的金属膜来制造小尖端(小孔)。当使用e-束平金属钣印刷术时，正如本领域人们所知的，金属硬罩被用于保持抗蚀剂的厚度和高的分辨率。
参照作为沿波导166A和166B的中心线的侧视图的图14A到14K，如下制造为改善抗蚀剂对晶片的粘合，所述晶片用六甲基二硅氧烷(HMDS)作为底层涂布34分钟(图14A)。然后将光致抗蚀剂Shipley 1830以4000rpm的速度旋涂所述晶片60秒钟以获得1.3微米厚的抗蚀剂并在115℃热板上烘烤60秒以将抗蚀剂硬化(图14B)。所述光致抗蚀剂在高分辨率掩模对准器诸如5x-g线分档器曝光并在加压的NH3烘箱中烘烤。这颠倒了光致抗蚀剂的正色调并为后续的取离处理提供了所需的后弯形状(即图14C所示的凹口)。将晶片在HTG/接触准直器中用405nm光泛光曝光1分钟并用Microposit 321显影1分钟。参见图14D，沉积1000埃的Al层并使用Microposit 1165抗蚀剂清除剂或丙酮在室温下进行清除(图14E)。使用抗蚀剂descum方法在Branson桶形蚀刻机中在0.6托氧气和150W RF功率下去除所有抗蚀剂残余物。
参见图14F到14K，如下产生SiO2波导使用15sccm硅烷、50sccmN2O在240℃、450毫托和50W RF功率下使用等离子体增强的化学气相沉积(PECVD)沉积1微米SiO2。如图14G所示，将SiO2层通过化学机械抛光(CMP)平整。顶部金属罩层通过将光致抗蚀剂Shipley1830以4000rpm的速率旋涂晶片60秒钟而获得1.3微米厚抗蚀剂并在115℃热板上烘烤60秒钟而确定。将所述抗蚀剂在高分辨率掩膜对准器如5x g-线分档器中曝光并在加压的NH3烘箱中烘烤。这颠倒了光致抗蚀剂的正色调并为后续的取离处理提供了所需的后弯形状(即凹口)，如图14I所示。将抗蚀剂在HTG/接触准直器中用405nm光泛光曝光1分钟并用Microposit 321显影1分钟。如图14J所示，沉积了一层1000A的Al金属层。过量金属通过使用Microposit 1165抗蚀剂清除剂或丙酮在室温下去除。
图15A到15G是沿中心线的侧视图，图16A到16G是沿垂直于中心线的线的侧视图。PMMA抗蚀剂496K以2500rpm旋涂到晶片上以获得200nm厚抗蚀剂并在180℃热板上烘烤60分钟以硬化所述抗蚀剂。PMMA通过e-束系统曝光而在毫微通道区产生图案。曝光的PMMA抗蚀剂在IPA∶MIBK 3∶1中显影1分钟并如图15C中所示沉积1000A的Al金属层。在丙酮中去除过量金属后，在CHF3(50sccm)+O2(2sccm)在200W RF功率和40毫托下使用活性离子蚀刻(RIE)在Plasma Therm72蚀刻机中将波导蚀刻(但没有微通道图案)＞1微米以产生如图15B所示的壁。底部金属在16:H2PO4；1 HNO3；1乙酸；2水；润湿剂的溶液中湿蚀刻或在Cl中干蚀刻。剩余的抗蚀剂在1000WRF功率下Branson桶形O2等离子体蚀刻机中处理15分钟除去。铝使用16:H2PO4；1:HNO3；1乙酸；2水；润湿剂在湿蚀刻中去除。
在波导上顶部Al层的沉积显示在图15E到15G和16D到16G。参见图15E和16D，光致抗蚀剂Shipley 1830以4000rpm旋涂晶片60秒钟以获得1.3微米厚抗蚀剂并在115℃热板上烘烤60分钟以硬化抗蚀剂。所述抗蚀剂通过在高分辨率掩膜对准器中诸如5x g-分档器中曝光并在加压NH3烘箱中烘烤。这颠倒了光致抗蚀剂的正色调并为后续的取离处理提供了所需的后弯形状(即凹口)。将抗蚀剂在HTG/胺触准直器中用405nm光泛光曝光1分钟并用Microposit 321显影1分钟。如图15F和16F所示，沉积了一层1000A的Al金属层。过量金属通过使用Microposit 1165抗蚀剂清除剂或丙酮在室温下去除。
如下在装置的顶部沉积一层Cr金属层。首先将用于毫微通道的罩面层蚀刻并然后将Shipley 1830抗蚀剂以4000rpm旋涂晶片60秒钟以获得1.3微米厚抗蚀剂并在115℃热板上烘烤60分钟以硬化抗蚀剂。抗蚀剂通过在高分辨率掩膜对准器中诸如5x g-分档器中曝光并在加压NH3烘箱中烘烤。这颠倒了光致抗蚀剂的正色调并为后续的取离处理提供了所需的后弯形状(即凹口)。将抗蚀剂在HTG/接触校直器中用405nm光泛光曝光1分钟并用Microposit 321显影1分钟。然后沉积一层1000埃的Cr金属层，过量金属通过使用Microposit1165抗蚀剂清除剂或丙酮在室温下去除。PMMA 496K抗蚀剂以2500rpm旋涂到晶片上以获得200nm厚抗蚀剂并在180℃热板上烘烤60分钟以硬化抗蚀剂。将所述抗蚀剂通过e-束系统曝光而确定所需图案并且晶片在IPA∶MIBK 3∶1中显影1分钟。然后沉积一层1000埃的Cr金属层，过量金属通过使用Microposit 1165抗蚀剂清除剂或丙酮在室温下去除。
毫微通道171通过在Cl基的干蚀刻中蚀刻第一金属层(即Al层)产生，其中Cr作为蚀刻罩面层。然后，在CHF3(50sccm)+O2(2sccm)在200W RF功率和40毫托下使用活性离子蚀刻(RIE)在Plasma Therm72蚀刻机中将SiO2蚀刻＞1微米以产生壁。底部金属层在Cl基干蚀刻中蚀刻并且剩余的Cr使用湿蚀刻除去。或者毫微通道171可通过聚焦的离子束铣削来确定尖端的隙缝和孔隙来制造。
对于DNA测序来说，各分子可如通过引用并入本文的1998年2月11日提出的PCT申请PCT/US98/03024中的描述进行选择性标记。所述测序使用已经用测试序列的荧光标记的寡核苷酸杂化的单束DNA分子(ssDNA)的组合完成。当杂化发生时，标记的序列处于DNA分子上的固定位置。所述方法可使用三种标记物“开始”和“结束”标记物(其发出ssDNA的3’和5’起始和结束的信号)和用于测序的标记寡核苷酸(oligo)。通过使用当寡核苷酸通过微通道时的寡核苷酸序列的光谱并记录寡核苷酸标记物的位置观察大量这些标记分子，所述系统以前所未有的速度、准确性和低分子浓度水平获得了分子的序列。
本发明的另一实施方案显示在图17。光学装置200利用共焦荧光照明和检测。共焦照明允许小光学区(皮升级)被辐照。使用小探头体积可减少Raleigh和Raman散射。光学装置200包括光源202、滤光器204、分光镜206、和物镜208、和窄带通滤光器210、针孔212、透镜214和检测器216。作为1mW氩离子激光器的光源发射激光束201，其通过滤光器204。滤光器204是提供约514nm波长的聚焦束的激光线性滤光器。经滤光的束205通过分光镜206反射并通过物镜208聚焦在DNA样品或另一聚合温度区域。物镜208是100x 1.2NA油浸物镜。
所述DNA样品是具有一个或几个被荧光标记物标记单元的伸直DNA分子。在所述DNA上的荧光标记可以是一种和几种染料，包括Cy-3、四甲基罗丹明、罗丹明6G和Alexa 546。此外，可使用嵌加剂染料诸如TOTO-3(分子探针)。
激发的标记物提供了荧光发射，其通过分光镜206、窄带通滤光器210(例如由Omega Optical制造)并聚焦在100微米针孔212上。荧光213通过非球面透镜214聚焦在检测器216上，检测器216为以光子耦合方式操作的雪崩光电二极管(例如由EC&G Canada制造)。光电二极管的输出信号通过多通道定标器(EG&G)收集并使用通用计算机分析。
所述共焦装置适用于涉及飞行时间的定量应用。这种应用包括测量DNA上的距离、测定标记的序列和测定DNA伸展度。可使用这种装置检测单荧光分子。或者，图象装置使用安装在显微镜上的增强CCD(ICCD,Princeton Instruments)。
图18显示了用于在聚合物达到干涉站231前校直和伸展聚合物的校直站220的现优选实施方案，在校直站聚合物与光学辐射相互作用。校直站220在石英晶片上制造，其上可覆盖金属层222(例如铝、金、银)。校直站220包括三角形的微通道224、微柱区(micropostregion)228和输入区230，它们均制作在表面上。
输入区230为约50微米宽并且与微柱区228相连。微柱区228包括几个校直柱226。校直柱226具有环状横截面并且直径约1微米。校直微柱(microposts)226相隔约1.5微米，12到15行。微柱区228倾斜约26.6度。
微柱226位于离聚合物(如DNA)单元与光学辐射相互作用的干涉站约100微米到5,000微米(并优选约1,000微米到3,000微米)。微通道224为保持聚合物从微柱226出来后的伸展形态的恒定x-方向剪切的区域。所述电场拉动测试聚合物通过微通道224。
一种非常有效的均匀伸展聚合物(如DNA)的技术是在锥形的微通道224内设障碍区域、接着是用于保持所获得的伸展和伸直聚合物剩余螺旋的恒剪切部分。优选的实施方案是微柱与两个不同漏斗设计的区域的组合的结构，如图18所示。压流是优选的驱动力，因为可预测流体宏观流动的行为。
通道中恒剪切速率或平均速率随距离的变化定义为Su/x=S式中x为下到基本矩形的通道的距离，u为平均流体速度，其可从总流量(Q)和通道的横截面积(A)按如下计算u=Q/A在通道横截面为矩形的实施方案中，所述通道可由恒定的高度H和宽度W确定，这样其横截面积A=HW，并且平均流体速度为u=Q/HW应用流体流量必须连续的约束条件，则Q为常数。因此，u反比于W。该关系式可代入原S的表达式来确定剪切速率和宽度间的关系S=u/x=Q/H/x(1/W)=(-Q/HW2)(dW/dx)dW/dx=(-SH/Q)(W2)对该表达式进行积分，发现W=(SHx/Q+C)-1式中C为通道的原宽度确定的积分常数(边界条件)。该通道宽度的等式用于确定超过一个柱结构的通道。
其它实施方案在下面权利要求书的范围内。
权利要求
1.光学分析聚合物连接单元的系统，包括光源，构建用于发射已知波长的光辐射；干涉站(interaction station)，构建用于接收所述光辐射和由所述光辐射产生的定域辐射点，所述干涉站也构建用于顺序所述接收聚合物的单元并布置成在所述定域辐射点顺序辐照所述单元；光学检测器，构建用于检测包括所述单元在所述定域辐射点相互作用得到的特征信号的辐射；和处理器，构建和布置用于根据所述测得的包括所述特征信号的辐射分析所述聚合物。
2.权利要求1的系统，其中所述干涉站构建用于顺序接收被辐射敏感标记物选择性标记的所述单元而在所述定域辐射点产生所述特征信号。
3.权利要求2的系统，其中所述辐射敏感标记物包括荧光团。
4.权利要求1的系统，其中所述干涉站包括具有1nm到500nm宽度的狭缝，所述狭缝产生所述定域辐射点。
5.权利要求1的系统，其中所述干涉站包括微通道和具有亚微粒子宽度的狭缝，布置用于产生所述定域辐射点，所述微通道构建用于接收和推进所述聚合物单元通过所述定域辐射点。
6.权利要求1的系统，其中所述宽度为10nm到100nm。
7.权利要求5的系统，还包括偏振器和其中所述光源包括用于发射所述辐射束的激光器，所述偏振器用于偏振到达所述狭缝前的所述光束。
8.权利要求5的系统，其中所述偏振器布置用于偏振所述光束以平行于所述狭缝的宽度。
9.权利要求5的系统，其中所述偏振器布置用于偏振所述光束垂直于所述狭缝的所述宽度。
10.权利要求5的系统，其中所述干涉站包括与布置用于接收所述伸直形式的所述聚合物的所述微通道交叉的几个所述狭缝。
11.权利要求5的系统，还包括构建和布置用于提供推动所述聚合物的所述单元通过所述微通道的一系列电极。
12.权利要求11的系统，其中所述电极为内电极。
13.权利要求11的系统，其中所述电极为外电极。
14.权利要求5的系统，其中所述毫微狭缝长为几微米。
15.权利要求5的系统，还包括构建和布置用于伸直所述聚合物并提供所述伸直聚合物到所述微通道的校直站(alignment station)，所述校直站包括几个约1微米直径并相隔约0.5微米到5微米的微柱(microposts)。
16.权利要求5的系统，还包括构建和布置用于伸直所述聚合物并提供所述伸直聚合物到所述微通道的校直站，所述校直站包括几个离所述狭缝约5微米到500微米的微柱。
17.权利要求16的系统，其中所述微站相隔约0.5微米到2.5微米。
18.权利要求1的系统，其中所述光源是激光器，并且所述系统还包括布置用于选择所述波长的声光可调谐滤光器。
19.权利要求18的系统，其中所述波长是选择性耦合到所述单元的荧光团的激发波长，所述特征信号为由所述荧光团发射的荧光波长。
20.权利要求19的系统，还包括布置用于只传送所述荧光波长到所述光学检测器的陷波滤波器。
21.权利要求1的系统，其中所述光源构建用于发射所述紫外到红外波长范围的波长。
22.权利要求1的系统，其中所述光学检测器包括下面的一种光电二极管、雪崩光电二极管、光电倍增管、PIN二极管和CCD。
23.权利要求1的系统，其中所述处理器布置用于评价作为荧光寿命的特征信号。
24.权利要求1的系统，其中所述处理器布置用于评价作为荧光波长的特征信号。
25.权利要求1的系统，其中所述处理器布置用于评价作为所述检测光辐射强度的特征信号。
26.权利要求1的系统，其中所述处理器布置用于评价作为所述检测光辐射的时间相关性状的特征信号。
27.光学分析聚合物连接单元的方法，包括顺序将所述聚合物的所述单元送过微通道；发出已知波长的光辐射以产生定域辐射点；在所述定域辐射点顺序照射所述聚合物的所述单元；顺序检测辐射，提供源于所述单元在所述定域辐射点的相互作用的特征信号；和根据所检测的包括所述特征信号的辐射分析所述聚合物。
28.权利要求27的方法，其中所述将所述聚合物送过所述微通道包括使用电场。
29.权利要求27的方法，其中所述产生所述定域辐射点包括将所述产生的光光学耦合到具有小于1微米宽度的毫微通道。
30.权利要求27的方法，其中所述产生所述定域辐射点包括将所述产生的光光学耦合到具有约1nm到500nm宽度的毫微通道。
31.权利要求27的方法，其中所述产生所述定域辐射点包括光学耦合所述产生的光到具有其垂直于所述微通道方向的长度的几个毫微狭缝。
32.权利要求29的方法，其中所述产生所述定域辐射点包括产生所述激光束形式的光并偏振所述激光束至平行于所述狭缝的所述宽度的方向。
33.权利要求29的方法，其中所述产生所述定域辐射点包括产生所述激光束形式的光并偏振所述激光束至垂直于所述狭缝的所述宽度的方向。
34.权利要求27的方法，还包括通过使用几个相隔0.5到5微米并离所述定域辐射点5到100微米的微柱伸直所述聚合物。
35.权利要求27的方法，还包括用辐射敏感标记物标记所述聚合物的所选单元，并且其中所述检测包括收集包括在所述单元通过所述微通道整个时间内的所述特征信号的所述辐射。
36.权利要求35的方法，其中所述标记物包括荧光团，并且其中所述检测包括滤光以只将由所述荧光团激发的辐射提供给光学检测器。
37.权利要求27的方法，其中所述产生包括产生所述紫外到红外波长范围内的波长的所述光辐射。
38.权利要求27的方法，其中所述检测包括使用光电二极管检测器、雪崩光电二极管检测器、光电倍增管检测器、PIN二极管检测器或CCD检测器。
39.权利要求27的方法，其中所述聚合物为核酸。
40.制造用于光学分析聚合物连接单元的制品，包括在基材上制作的布置用于接收光源发出的光辐射并由此产生定域辐射点的干涉站，所述干涉站还构建用于顺序接收所述聚合物的单元并布置用于在所述定域辐射点顺序照射所述单元而产生辐射的特征信号。
41.权利要求40的制品，其中所述干涉站包括构建用于产生定域辐射点的毫微狭缝。
42.权利要求41的制品，其中所述干涉站包括构建用于提供所述伸直态的聚合物到所述毫微狭缝的微通道。
43.权利要求42的制品，其中所述毫微狭缝具有小于所述辐射波长的宽度。
44.权利要求42的制品，其中所述毫微狭缝具有1nm到500nm的宽度。
45.权利要求42的制品，其中所述毫微狭缝具有50nm到100nm范围的宽度。
46.权利要求40的制品，还包括构建和布置用于提供将所述聚合物的所述单元推进通过所述定域辐射点的电场。
47.权利要求40的制品，其中所述微通道的宽度小于1微米。
48.权利要求40的制品，还包括校直站，所述校直站包括相隔0.5微米到5微米的并离所述定域辐射点5微米到10微米的几个微柱。
49.权利要求48的制品，其中所述微柱离所述定域辐射点10微米到200微米。
50.权利要求49的制品，其中所述微柱相隔0.5微米到5微米。
51.权利要求50的制品，其中所述微柱相隔1.5到2.5微米。
全文摘要
本发明是一种用于光学鉴定聚合物的系统。优选所述系统用于进行聚合物的线性分析。
文档编号C12Q1/68GK1323355SQ99811963
公开日2001年11月21日 申请日期1999年8月13日 优先权日1998年8月13日
发明者J·O·特根菲尔德特, R·H·奥斯丁, E·Y·陈 申请人:美国吉诺米克斯公司, 普林斯顿大学托管委员会