一种利用超高压处理米渣蛋白制备高抗氧化活性肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种制备抗氧化肽的方法，具体涉及一种利用超高压处理米渣蛋白制 备高抗氧化活性肽的方法。
【背景技术】
[0002] 稻谷是世界上最重要的粮食之一，中国是有名的产粮大国，粮食产量中85%以上 是稻谷，仅湖南省粮食的商业库存每年在430~660万吨之间。一部分粮食需要用于淀粉 糖工业生产，但会产生大量的副产物米渣，而米渣中蛋白质含量高达40~70%。大米蛋白的 品质是公认的谷类蛋白中的上佳者，大米蛋白的营养价值高于小麦蛋白质，大米蛋白中的 第一限制性氨基酸一一赖氨酸的含量高于其它谷类，且氨基酸含量较为合理，与其它谷类 蛋白相比，生物价和蛋白质效用比率更高。另外，大米蛋白的低过敏性使之非常适合作为婴 儿或是特殊人群的食品。因此，研究稻米深加工副产物一一米渣蛋白的再加工技术具有重 要意义。
[0003] CN101748182B公开了一种米蛋白抗氧化肽的制备方法，其技术方案是将米渣过 筛后用水浸泡，然后使用胶体磨将其磨碎再进行酶解，最终制备米蛋白抗氧化活性肽，但 是，使用胶体磨会产生很多泡沫，影响实验准确性，并且碱性蛋白酶水解程度效果不佳。CN 103468777 B公开了一种发芽糙米抗氧化肽的提取方法，其包括糙米浑浊液制备、中性蛋白 酶水解、灭酶、离心分离、真空浓缩、冷冻干燥等步骤，但是，其在糙米浑浊液制备的过程中， 仅仅使用高速组织捣碎机进行捣碎，这样的操作只是把发芽糙米打碎，并没有破坏其结构， 所以酶解的时候效率较差。
[0004] 超尚压技术是目如国际上最热门的食品加工技术之一，超尚压处理在食品蛋白加 工中可通过改变蛋白的结构，改变蛋白质的溶解性、凝胶性、乳化性、起泡性等诸多加工特 性；还可以通过改变蛋白质的酶解特性以产生多种活性肽；并且超高压处理传压速度比较 快、均匀，不存在梯度压力，另外，超高压技术相对耗能比较少。CN103540637A公开了 一种高 压处理和酶解制备高纯度大米蛋白肽的方法，其技术方案是米渣预处理、高压均质、超声、 酶解、脱色、分离、干燥，但是，其使用的最高压力为80MPa，研究表明，这样的压力并不能完 全破环蛋白质基本结构，不能让蛋白质更好的酶解。CN103283934A公开了一种高纯度大米 蛋白的制备方法，其米渣蛋白提取方案是酶法提取，然后再进行高压处理，但是，酶法提取 会产生较多的杂质，这样制得的产品，杂质含量较高。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种能提高 米渣蛋白的酶解效率和抗氧化活性，所得高抗氧化活性肽清除自由基效果好，且处理过程 不破坏营养成分，产品纯度高，操作简单的利用超高压处理米渣蛋白制备高抗氧化活性肽 的方法。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种利用超高压处理米渣蛋白制 备高抗氧化活性肽的方法，包括以下步骤： (1) 米渣预处理：将米渣磨碎，过60~100目筛，得米渣粉； (2) 提取米渣蛋白：将步骤（1)所得米渣粉与水以质量比1:6~10混合，调节混合液 pH值至11~13,恒温搅拌反应3~5h，然后离心，收集上清液，调节上清液pH值至5. 0~ 5. 8,静置沉淀，离心，弃去上清液，采用去离子水洗涤沉淀至中性，沉淀即为米渣蛋白； (3) 超高压处理：将步骤（2)所得米渣蛋白在300~500MPa (优选350~450MPa，进一 步优选400 MPa)压力下，处理5~15min (优选8~12min)，冷冻干燥，得超高压米渣蛋白 粉； (4) 酶解：将步骤（3)所得超高压米渣蛋白粉配制成3~5wt%的水溶液，加入4000~ 8000U中性蛋白酶/g超高压米渣蛋白粉，酶解2~3h，灭酶，离心收集上清液； (5) 真空浓缩：将步骤（4)所得上清液真空浓缩至固形物质量分数为50~70wt%的浓 缩液； (6) 冷冻干燥：将步骤（5)所得浓缩液进行冷冻干燥，即得高抗氧化活性肽。
[0007] 步骤（2)中，用氢氧化钠调节混合液pH值至11~13,用盐酸调节混合液pH值至 5. 0~5. 8,碱液和酸液的浓度均为I. 0mol/L〇
[0008] 步骤（2)中，由于米渣蛋白中80%为碱溶性蛋白质，所以需要先让蛋白质溶于碱 液，再加酸调节PH值使蛋白质沉淀，pH值不宜过高，否则会破环蛋白质结构，酸性条件下蛋 白质凝聚从而沉淀，在等电点的时候沉淀达到最大值，所以依据米渣蛋白的等电点确定最 佳酸沉pH值。
[0009] 进一步，步骤（2)中，所述搅拌反应的温度为30~50°C，搅拌反应的转速为500~ 900r/min。
[0010] 进一步，步骤（2)中，所述离心的转速为3000~5000r/min，离心的时间为10~ 20min〇
[0011] 进一步，步骤（2)中，所述静置沉淀的时间为1~3h。
[0012] 步骤（3)中，所述超高压处理的温度为室温，本发明超高压设备的升压和降压过程 均可在Imin内完成。超高压处理对蛋白质的改性作用主要体现在以下两个方面：（1)对蛋 白质结构的影响：超高压处理主要是破坏蛋白质的三级、四级结构的非共价键，而对共价键 作用较小，不同超高压力处理对蛋白质结构的影响不同，一般在100~200MPa下，蛋白质变 化是可逆的，但当压力超过300MPa时，蛋白质会发生氢键断裂，产生不可逆变性而改变蛋 白质的三级结构，另外，因为超高压只能破坏蛋白质的大分子结构，而肽是小分子，超高压 对它的作用很小，所以，本发明是先对米渣蛋白进行超高压再酶解，而不是对酶解后的肽进 行超高压，如果是先酶解再超高压，就都达不到提高抗氧化力的效果；（2)对蛋白质酶解的 影响：超高压处理能影响蛋白质的结构和性质，从而也影响到酶对蛋白质的催化特性，超高 压处理对蛋白的影响主要是在于蛋白三级、四级结构的非共价键，蛋白经超高压处理后结 构伸展而变得松散，从而暴露出更多位点，易于酶解反应进行，提高酶解效率。所以，本发明 方法采用先将米渣蛋白进行超高压处理，再进行酶解反应。
[0013] 步骤（4)中，由于底物浓度过高会抑制酶的活性，所以酶解时，选择超高压米渣蛋 白粉的水溶液浓度为3~5wt%。
[0014] 进一步，步骤（4)中，所述中性蛋白酶的酶活为40000~60000U/g。因不同蛋白酶 的底物特异性及作用位点的差异，不同蛋白酶作用于大米蛋白的水解程度不同，而且不同 蛋白酶水解得到的酶解产物的功能性质也将有所不同，中性蛋白酶具有作用条件温和，作 用于大米蛋白水解度高，酶解产物抗氧化活性高的优点。因此，最终确定中性蛋白酶为酶解 米渣蛋白的合适酶源。
[0015] 进一步，步骤（4)中，所述酶解的pH值为7,温度为40~50°C。
[0016] 进一步，步骤（4)中，所述灭酶的温度为75~95°C，时间为8~15min。
[0017] 进一步，步骤（4)中，所述离心的转速为4000~6000r/min，离心的时间为10~ 20min〇
[0018] 进一步，步骤（5)中，所述真空浓缩的真空度为0· 08~0· lOMPa，温度为45~ 50 cC 〇
[0019] 进一步，步骤（3)、（6)中，所述冷冻干燥是指在真空度10~30MPa，温 度-20~-40 °C下，冷冻干燥24~48h至水分含量为5~10%。
[0020] 本发明方法利用超高压技术处理所得米渣蛋白，与未经超高压处理的进行对比， 其DPPH自由基清除率由20~45%提升到50~60%，ABTS自由基清除率由50~60%提升 到80~95%，羟基自由基清除率由3~7%提升到4~12%，说明超高压所得的米渣蛋白酶解 液的抗氧化活性远大于未经高压处理的；而超声处理所得米渣蛋白，其DPPH自由基、ABTS 自由基和羟基自由基清除率分别为30~50%，60~75%，3~8%，说明超高压所得的米渣蛋 白酶解液的抗氧化活性相对于经过超声处理的具有明显的提高；另外，本发明方法不会破 坏米渣的营养成分，所得高抗氧化活性肽产品呈乳白色，不含糖分等杂质。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0022] 本发明实施例所使用的中性蛋白酶，酶活50000U/g，生产厂家为鸿鹰祥生物工程 股份有限公司；其它所使用的化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
[0023] 实施例1 (1) 米渣预处理：将500g米渣磨碎，过80目筛，得米渣粉； (2) 提取米渣蛋白：将步骤（1)所得米渣粉与4L水混合，用1.0 mol/L的氢氧化钠溶液 调节混合液pH值至12,在温度40°C，转速700r/min下，恒温搅拌反应4h，然后4000r/min 离心15min，收集上清液，用1.0 mol/L的盐酸溶液调节上清液pH值至5. 4,静置沉淀2h， 4000r/min离心15min，弃去上清液，采用去离子水洗涤沉淀至中性，沉淀即为米渣蛋白； (3) 超高压处理：将步骤（2)所得米渣蛋白用双层聚氯乙烯袋包装，密封，在400MPa压 力下，处理l〇min，在真空度20MPa，温度-30°C下，冷冻干燥36h至粉末状，得超高压米渣蛋 白粉，干燥后产品水分含量为8% ; (4) 酶解：将步骤（3)所得超高压米渣蛋白粉配制成4wt%的水溶液，加入6000U中性蛋 白酶/g超高压米渣蛋白粉，在pH值为7,温度45°C下，酶解2. 5h，85°C灭酶10min，5000r/ min离心15min，收集上清液； (5) 真空浓缩：将步骤（4)所得上清液在真空度0. 09MPa，温度47°C下，进行真空浓缩， 至固形物质量分数为60wt%的浓缩液； (6) 冷冻干燥：将步骤（5)所得浓缩液在真空度20MPa，温度-30°C下，冷冻干燥36h至 粉末状，即得高抗氧化活性肽，干燥后产品水分含量为8%。
[0024] 所得高抗氧化活性肽呈乳白色，表明不含糖分等杂质。
[0025] 实施例2 (1) 米渣预处理：将500g米渣磨碎，过60目筛，得米渣粉； (2) 提取米渣蛋白：将步骤（1)所得米渣粉与3L水混合，用1.0 mol/L的氢氧化钠溶液 调节混合液pH值至11，在温度30°C，转速500r/min下，恒温搅拌反应3h，然后3000r/min 离心10min，收集上清液，用1.0 mol/L的盐酸溶液调节上清液pH值至5. 0,静置沉淀lh， 3000r/min离心10min，弃去上清液，采用去离子水洗涤沉淀至中性，沉淀即为米渣蛋白； (3) 超高压处理：将步骤（2)所得米渣蛋白用双层聚氯乙烯袋包装，密封，在300MPa压