一种微量热法结合抗疲劳活性评价实验确定高抗疲劳活性大豆肽的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于大豆深加工技术领域，尤其是一种微量热法结合抗疲劳活性评价实验 确定高抗疲劳活性大豆肽的制备方法。
【背景技术】
[0002] 当前，我国的抗疲劳保健品、功能食品尚处于起步阶段，绝大多数产品研发的理论 基础源于传统的中医药和养生文化。我国抗疲劳保健品、功能食品在功效研究、功能性成分 的分尚和提取、吸收率的提尚、广品的风味适应性、广品类型等方面均有待提尚；适合运动 员、高强度要求体力劳动者、特殊岗位工作者职业抗疲劳要求，适合普通消费者日常抗疲劳 需求，能够获得普遍欢迎的大众化抗疲劳食品，目前市场上还不多。因此，我国抗疲劳食品 的研究领域尚有广阔的空间，开发潜力巨大。近年来抗疲劳活性肽作为一类小分子物质，以 其分子量低、吸收率高、活性强、用量少、绿色健康的独特优势，已越来越多地引起人们的重 视。
[0003] 大量研究证明大豆蛋白经蛋白酶水解形成的产物中具有抗疲劳活性肽成分，目前 国内外生产的大豆活性肽是大豆蛋白质经蛋白酶水解得到的多种肽分子混合物。对蛋白酶 水解制备大豆肽的方法国内外学者进行了大量的研究，大都是通过测定产物的性质，来确 定最佳反应温度、酸度等条件，试验方法较复杂，随意性较大，不能准确定量确定蛋白酶水 解反应的最佳工艺。致使蛋白酶水解工艺控制欠缺理论指导，控制难。微量热法通过高灵 敏度的微量量热仪直接测量酶催化反应过程中微量的热量变化，获得蛋白酶对大豆蛋白催 化反应的热功率一时间曲线，定量确定蛋白酶水解大豆分离蛋白最佳反应温度、pH,具有灵 敏度高、操作简单等优点。微量热法结合抗疲劳活性评价实验可以更准确地定量确定高抗 疲劳活性大豆肽的制备方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于，克服现有技术的不足，提供一种制备高抗疲劳活性大豆肽的 方法。本发明用一种新的研究方法微量热法，对大豆蛋白酶解制取大豆肽最适蛋白酶、最 适条件进行定量的研究，结合抗疲劳活性评价实验确定一种新的高抗疲劳活性大豆肽的制 备方法。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：一种微量热法结合抗疲劳活性评价 实验确定高抗疲劳活性大豆肽的制备方法，步骤如下；
[0006] (1)配制溶液：
[0007] 溶液①：准确称取大豆分离蛋白样品，用不同pH值（ρΗ3. 3-ρΗΙΟ. 0)的缓冲溶液分 别配制浓度为5-10g L 1的大豆分离蛋白溶液。
[0008] 溶液②：配制浓度为〇· 1-0. 3g L 1的中性蛋白酶（酶活力5· 3X 10 4U/g)溶液，胰 蛋白酶（酶活力5· IX 104U/g)溶液，菠萝蛋白酶（酶活力6. OX 104U/g)溶液，碱性蛋白酶 (酶活力5.7X104U/g)溶液。
[0009] (2) 90°C大豆分离蛋白溶液进行水浴处理IOmin ;
[0010] (3)测定热功率时间曲线：取溶液①2ml放入不锈钢安瓿中。把滴定微量量热仪 的连杆上绕细塑料管，管中盛蛋白酶溶液②lml，先预热，当温度恒定后，将搅拌系统打下， 转速为60-120rpm，用蠕动栗把蛋白酶溶液②注入安瓿中，然后进行热功率一时间曲线的测 定；
[0011] (4)通过热功率一时间曲线，按照热动力学理论和对比进度法解析出中性蛋白酶、 胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶各温度（306. 15K-336. 15K)、pH值（pH6. 13-pH9. 22)时 米凯利斯常数Km和最大速度Vmax，并建立米凯利斯常数Km与温度、pH值间的关系式，从 而获得中性蛋白酶最适温度319. 19K、最适pH7. 13;胰蛋白酶最适温度323. 27K、最适 pH7. 77 ;菠萝蛋白酶最适温度314. 63K、最适pH6. 99 ;碱性蛋白酶最适温度329. 5K、最适 pH8. 25 〇
[0012] (5)通过热功率一时间曲线，求得中性蛋白酶在其最适温度、最适pH的米凯利斯 常数Km = 24. 02g吨\胰蛋白酶在其最适温度、最适pH的米凯利斯常数Km = 42. 41g *L \ 菠萝蛋白酶在其最适温度、最适pH的米凯利斯常数Km = 50. 31g *L \碱性蛋白酶在其最 适温度、最适pH的米凯利斯常数Km = 16. Olg吨\从而可以知道碱性蛋白酶与底物大豆 分离蛋白的亲和力最强，结合抗疲劳活性评价实验进一步确定碱性蛋白酶是催化水解大豆 分离蛋白的最适蛋白酶。
[0013] (6)不同试验条件（底物浓度、酶底比、pH、温度、酶组合）下得到的大豆肽产品 进行抗疲劳活性评价实验，根据试验结果确定高抗疲劳活性大豆肽的制备方法：调浆一加 酶反应一分离提取一脱除异味一脱除无机盐类一杀菌灭酶一浓缩、喷雾干燥一高抗疲劳 活性大豆肽产品。其中加酶反应底物浓度5% -10%、pH值8. 25、酶底比1-3%、水解温度 329. 5K，碱性蛋白酶水解大豆蛋白3h后加与碱性蛋白酶1:2的菠萝蛋白酶，在314. 63K、 pH6. 99下水解Ih获得高抗疲劳活性的大豆肽。
[0014] 本发明的有益效果是：本发明使用的微量热法具有灵敏度高，操作简单、实验结果 精准等优点；本发明提供一种制备高抗疲劳活性大豆肽的方法，能够有效提高产品的抗疲 劳功能，经抗疲劳活性评价实验证明，受试组小鼠负重游泳时间显著延长，游泳运动后血 乳酸含量显著降低，游泳运动后的肝糖原含量及小鼠肝糖原的储备水平显著提高，是优质 的抗疲劳大豆肽产品。本发明无污染，成本低，工艺简单，产品得率及产品抗疲劳功能高，水 溶性好、安全、无毒、无副作用，具有较高的推广价值，可以用于保健品、功能食品、食品添加 剂的开发。同时可以很好地对大豆深加工企业大豆肽生产中的蛋白酶水解工艺控制提供理 论指导，产生较高经济价值和社会效益，其前景非常广阔。
【附图说明】
[0015] 图1在T = 315. 15K，不同酸度时胰蛋白酶催化反应的热功率一时间曲线
[0016] 图2在pH = 7. 29,不同温度时胰蛋白酶催化反应的热功率一时间曲线
【具体实施方式】：
[0017] 以下列举具体实施例对本发明进行说明。需要指出的是实施例只用于对本发明作 进一步说明，不代表发明保护范围，其他人根据本发明提示作出的非本质的修改和调整，仍 属于本发明保护范围。
[0018] 实施例1
[0019] 1.溶液的配制：
[0020] 溶液①：准确称取大豆分离蛋白样品，用pH值为6· 70、7· 21、7· 73、8· 21、8· 73的缓 冲溶液分别配制浓度为l〇g L 1的大豆分离蛋白溶液。
[0021] 溶液②：配制浓度为0. 2g L 1胰蛋白酶溶液。
[0022] 2. 90°C大豆分离蛋白溶液进行水浴处理IOmin ;
[0023] 3.实验是在4ml不锈钢安瓶（滴定微量量热仪）中进行的。取大豆分离蛋白溶液 2ml放入不锈钢安瓿中。把滴定微量量热仪的连杆上绕细塑料管，管中盛碱性蛋白酶溶液 lml，先预热，当温度（311. 15K ;316. 15K ;321. 15K ;326. 15K ;331. 15K)恒定后，将搅拌系统 打下，转速为120rpm，用蠕动栗把胰蛋白酶溶液注入安瓿中，然后进行热功率一时间曲线的 测定，记录仪开始记录，当记录笔画出与基线平行的直线时即认为实验结束，搅拌停止。每 个体系重复实验测定三次，取平均值。
[0024] 实验测得在T = 315. 15K，不同酸度时胰蛋白酶催化反应的热功率一时间曲线如 图1，据图1解析得到了 = 315.151(，不同酸度（6.70、7.21、7.73、8.21、8.73)时的1(|11和￥|_: :PH = 6. 70, Kn= 51. 11 和 V _= 0· 0959 ;PH = 7. 21，K n= 49. 50 和 V _= 0· 1066 ;PH = 7· 73，Kn= 48. 80 和 Vnax= 0· 1183 ;PH = 8· 21，Kn= 49. 13 和 Vnax= 0· 1134 ;PH = 8· 73，Kn=50. 70 和 Vnax= 0· 0996。
[0025] 根据Km和Vmax的数据，用计算机拟合，可得Km-pH曲线方程，即
[0026] Kn= 172. 0-31. 71PH+2. 040PH2, R = 0· 9985，
[0027] 对该曲线方程求极值得胰蛋白酶催化大豆蛋白水解反应的最适pH为7. 77。
[0028] 实验测得在pH = 7. 29,不同温度时胰蛋白酶催化反应的热功率一时间曲线如图 2,据图 2 解析得到 pH = 7. 29 不同温度（311. 15K ;316· 15K ;321· 15K ;326· 15K ;331· 15K) 下的 Km和 Vmax:T = 311. 15K，Km = 56. 40 和 Vmax = 0· 0941 ;T = 316. 15K，Km = 48. 53 和 Vmax = 0· 1123 ;T = 321. 15K，Km = 45. 81 和 Vmax = 0· 1166 ;T = 326. 15K，Km = 47. 71 和 Vmax = 0· 1159 ;T = 331. 15K, Km = 52. 28 和 Vmax = 0· 1016 ;