一种乌鳢的抗病免疫增强剂环-(丙氨酸-色氨酸)的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水产养殖领域，确切地说是一种乌禮的抗病免疫增强剂及其综合饲养 方法。
【背景技术】
[0002] 乌禮（况annaargw?)隶属驴形目，禮科，禮属。因乌禮是适合东北特有的气候和 水域特点且抗逆性强的品种，又因其营养价值高、味道鲜美，有各种吃法，是很受国内外市 场欢迎的品种。近年来，已对乌禮进行驯化及人工繁育的突破，配合饲料的营养组成已有系 统研究。但在高密度集约化养殖中，面临各种环境胁迫，进入高密度养殖水体中的消毒剂和 药物能够影响胃肠道微生物菌群的完整性，降低生产性能，抑制免疫反应。水产养殖中控制 疾病的最有效的方法之一就是通过免疫增强剂的预防管理增强鱼的防御机制。从运方面 看，许多中草药和其他天然免疫增强剂被筛选出并被认为是水产疾病管理中较有效的替代 方法，并且许多具有抗菌性能的天然免疫增强剂的应用已经被提出。通过微生态制剂处理 渔用饲料，可W改善饲料的品质，提高饲料的营养价值和饲料转化效率，提高水产动物的免 疫力，促进动物生长。近来许多研究表明利用细菌细胞基质产品控制鱼类疾病是由于它们 那独一无二产生新奇的代谢物的能力。所W，根据科研和实践的经验总结和梳理，海洋细菌 泌次级代谢产物环-(丙氨酸-色氨酸）作为乌禮的一种抗病免疫增强 剂。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种乌禮抗病免疫增强剂环-(丙氨酸-色氨酸）。
[0004] 环-(丙氨酸-色氨酸）作为乌禮饲料添加剂的应用。
[0005] 所述的乌禮饲料添加剂为提高乌禮抗病能力及促生长添加剂。
[0006] 一种乌禮的配合饲料，按质量份： 进口鱼粉15. 2~16. 0、国产鱼粉15. 3~19. 0、环-(丙氨酸-色氨酸）0.5~2.0、维 生素预混料1. 0、蚕蛹3. 5~4. 0、血球蛋白粉2. . 4~3. 3、矿物质预混料2. 0、豆巧16. 0~ 19. 0、花生巧9. 5~17. 0、面粉25. 00~31. 00、鱼油2. 20~2. 85、玉米5. 5~6. 5、棉巧 5. 56~7. 6、菜巧5. 0~6. 3、酵母粉1. 5~3. 6、墨鱼粉2. 2~3. 0,混合后，膨化。
[0007] 优选：进口鱼粉15. 26~15. 6、国产鱼粉15. 62~18. 56、环-(丙氨酸-色氨 酸）1.0~2.0、血球蛋白粉2. .45~3. 2、豆巧16. 5~18. 75、花生巧9. 5~16. 84、面粉 25. 42~30. 2、鱼油2. 24~2. 8、棉巧5. 6~7. 5、菜巧5. 2~6. 3、墨鱼粉2. 3~3. 0,混合 后，膨化。优选：进口鱼粉15. 6、国产鱼粉15. 84、环-(丙氨酸-色氨酸）0. 5、蚕蛹3. 5、豆 巧16. 5、血球蛋白粉2. 45、花生巧9. 5、面粉30. 2、维生素预混料1. 0、鱼油2. 24、玉米5. 5、 矿物质预混料2. 0、棉巧5. 6、菜巧5. 3、酵母粉1. 5、墨鱼粉2. 3。
[000引优选：进口鱼粉15.36、国产鱼粉18. 56、环-(丙氨酸-色氨酸）1.0、蚕蛹4. 5、棉 巧6. 8、血球蛋白粉2. 56、菜巧5. 2、豆巧18. 75、墨鱼粉2. 5、花生巧16. 84、面粉26. 2、维生 素预混料I.O、鱼油2. 5、矿物质预混料2.O、酵母粉2.O、玉米6. 3。
[0009] 优选：进口鱼粉15. 23、国产鱼粉15. 62、棉巧7.5、环-(丙氨酸-色氨酸）2.0、菜 巧6. 3、蚕蛹4. 0、墨鱼粉3. 0、血球蛋白粉3. 2、豆巧18. 62、维生素预混料1. 0、花生巧9. 68、 面粉25. 42、鱼油2. 8、玉米6. 5、矿物质预混料2. 0、酵母粉3. 6。
[0010] 所述的维生素预混料： 盐酸硫胺素，15mg;核黄素，20g;叶酸，1. 5g;盐酸化唉醇，4g;尼克酸，SOg;泛酸巧， 28g;肌醇，40g;生物素，0. 6g;VitB3,30mg;VitB9,3. 0mg;VitBi2,〇. 〇lg;VitA，6000IU ;Vit〇3，0. 005g;VitC，200mg;VitD，2000IU;VitE，50mg;VitK，5.Omg，载体为脱脂米 慷。
[0011] 所述的矿物质预混料： 憐酸二氨钢，450g;氯化钟，129g;屯水硫酸儀，102g;五水硫酸铜，0. 6g;巧樣酸铁 150mg;屯水硫酸锋，SOmg;-水硫酸儘，3. 25g;六水S氯化侣，0. 15g;舰化钟，0. 23g;亚砸 酸钢，0.Olg;屯水硫酸钻0. 030邑。
[0012] 乌禮综合饲养的方法如下： 1、 每10亩塘放养体长IO-IScm左右的乌禮鱼种50000尾、搭配养殖的鱼类有：館（30g/尾）2000尾，錦（20g/尾）800尾，經（40g/尾）800尾，娜（30g/尾）800尾，细鱗斜 颂細（20g/尾）500尾； 2、 先将館鱼、錦鱼放养鱼池中，适应3d，每亩施用光合细菌200g调水2d后放养經、娜和 细鱗斜颂細； 3、 乌禮鱼苗饥饿2d，投喂上述一种乌禮配合饲料驯食，待3~5d完全摄食后，再与館、 錦、經、娜和细鱗斜颂細混养； 4、 每天投喂上述一种乌禮配合饲料，=个月后捕拱。
[0013] 本发明为一种乌禮的免疫增强剂环-(丙氨酸-色氨酸），配合饲料中添加海洋细 菌AewZommss 泌代谢物可抵抗常见的淡水细菌性鱼病的发生，与館、錦、經、娜和细 鱗斜颂細共同饲养，可充分利用水体的巧料资源和水体空间，综合饲养经济效益更高，适合 东北地区应用，商品鱼肉质好、口味极佳。
[0014] 具体优点如下： 1、配方科学、营养均衡，搭配各种蛋白饲料，使得氨基酸互补，饲料和鱼体必需氨基酸 平衡关联程度最佳，确保饲料系数低，使得鱼体生长快。
[0015] 2、饲料中含有海洋细菌AewZommss饼/。泌代谢物环-(丙氨酸-色氨酸）可作 为免疫增强剂对乌禮IL-I0基因表达、体液反应和抗病力等有正面影响，可有效地增强乌 鱼豊的抗防病能力，提高养殖的成活率。
[0016] 3、精选的蚕蛹、血球蛋白粉、花生巧和墨鱼粉的剂量和搭配比例使得饲料具有特 有的颜色和气味，可使乌禮迅速转食和摄食，提高饲料的利用率。
[0017] 4、不同食性、不同水层的鱼类进行搭配养殖，充分利用水体和空间，达到生态健康 养殖。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1环-(丙氨酸-色氨酸）的提取 (I)发酵及发酵产物提取： 海洋细菌活化2~3天后，从平板上挑取适量单菌落接种到含有 10血MB液体培养基的试管中，30°C、15化/min振荡培养1.5d。然后将菌液W5%(V/ V)的接种量接种到装有100HiL培养基的锥形瓶中，30°C、150r/min振荡培养1.5d。将菌 液W5%(V/V)的接种量接种至1000血培养基的锥形瓶中，30°C、15化/min振荡培养5 d。扩大培养后的细菌发酵液用等体积的含有5%丙酬的乙酸乙醋进行萃取，菌液与提取液 W-定比例混合，每瓶菌液萃取=次（第一次按菌液与混合液1 :1的比例萃取，第二次按 菌液与混合液2 :1的比例，第=次按菌液与混合液4 :1的比例）。收集上层有机相，然后将 萃取液在旋转蒸发仪上水浴溫度37°C，真空度82mbar条件下蒸馈浓缩，浓缩到一定体积 后转移到小体积的梨形旋蒸瓶中，再次进行浓缩，移入已称重的小离屯、管，氮吹仪吹干后称 重，记录质量后4°C避光保存，备用。共得到粗提物约6.2邑。
[001引（2)薄层层析： 取GF254薄层层析硅胶板置于Iior恒溫鼓风干燥箱中活化1h，待降至常溫后开始进 行点样。先用铅笔在层析上距末端1cm处轻轻画一横线，然后用毛细管吸取样液在横线上 轻轻点样，点的直径在2mmW内。将点了样的薄层板放入已预饱和展开剂的层析缸中，密 封展开缸顶的盖。由于毛细管作用，展开溶剂在薄层板上缓慢前进，前进至距离顶端1cm 处时，取出薄层板，样品组分因移动速度不同而彼此分离。展开后的薄层板经过干燥后，用 紫外光灯暗室中照射（A为254nm和365nm)观察检出斑点情况。展开分离后，化合物在 薄层板上的位置用比移值（Rf值）表示。化合物斑点中屯、至原点的距离与溶剂前沿至原点 的距离的比值就是该化合物的Rf值。本实验通过试验不同的二氯甲烧+甲醇体系，选取比 值Rf介于0. 2到0.4之间的溶剂比例二氯甲烧：甲醇的洗脱体系比例分别为70 :1、30 :1、 8 :1、2 :1、丙酬、甲醇。
[0020] (3)分离： 取粗提物6. 2g经200-300目减压桂胶柱层析，W70 :1、30 :1、8 :1、2 :1、丙酬、甲醇屯个 极性系统快速洗脱，共得屯个组分：化.a、化.b、化.C、化.d、化.e、化.f、化.g、化.h。化.b 部分经ODS减压柱色谱，流动相为甲醇：水比例依次为20: 80、40: 60、60: 40、80: 20、95: 5、甲醇，得到6个组分：化.b-1、化.b-2、化.b-3、化.b-4、化.b-5、化.b-6。
[0021] 其中化.b-1又经ODS加压柱色谱，W甲醇：水比例为12:88~100梯度洗脱，最 后用HPLC(RP-18)分离与纯化，得到化合物环-(苯丙氨酸-丝氨酸）（13mg)、环-(丙 氨酸-色氨酸）（12mg)、环-(径脯氨酸-苯丙氨酸）10mg、环-(酪氨酸-鄉氨酸）化 mg)、环-(酪氨酸-丙氨酸）（2mg)、环-(酪氨酸-甘氨酸）巧.5mg)和环-(酪氨酸-色 氨酸）（11.6mg)，收集环-(丙氨酸-色氨酸）。
[0022] 环-(丙氨酸-色氨酸）化学结构为：
白色粉末；[曰]25〇+ 85. 7。（C0. 5，Me0H)NMR( 600MHz，DMSO-de) 5h〇. 40(3H，d，J=6. 9Hz，H-7]，3. 01(lH，dd，J=4. 6，14. 3Hz，H-8a)，3. 24 (lH，dd，J= 4. 6，14. 3Hz，H-8b)，3. 58 (lH，q，J= 6. 9Hz，H-6)，4.ll(lH，dd，J=4. 6,4. 6Hz， H-：3)，6. 93 (lH，dd，J=6. 9,7. 8Hz，H-14)，7. 02 (lH，dd，J= 6. 9,7. 8Hz，H-15)， 7. 04 (lH，s，H-10)，7. 30 (lH，d，J= 7. 8Hz，H-13)，7. 56 (lH，d，J= 7. 8Hz，H-16)， 7. 91 (lH，brs，NH-l)，8. 02 (lH，brs，NH-4)，10. 89 (lH，brs，NH-ll)。
[0023] 实施例2材料和方法 健康的乌禮，80g左右，运到实验室后随机分布在2(K)L流水式水槽内。正式试验前驯 化14dW适应实验室的条件（溶解氧5. 50 ± 0. 68mg/L;pH7. 2 ± 0. 5;亚硝酸盐：0. 022 ± 0.01mg/L;氨氮 0. 14 ± 0.05mg/L;23 ± 2°C