[0053]-在CECT中以登录号7411保藏的奠肠球菌(Enterococcusfaecalis)，
[0054]-在CECT中以登录号7409保藏的唾液乳杆菌，和
[0055]-在CECT中以登录号7413保藏的罗伊乳杆菌。
[0056]本发明的细菌包括结合于其表面的至少一种金属纳米颗粒。本文所用的术语“金属纳米颗粒”指代包括金属的纳米颗粒。本文所用的术语“纳米颗粒”指代直径范围为约I至约1000纳米的颗粒。在【具体实施方式】中，根据本发明使用的纳米颗粒一般具有如下范围的平均粒径:2至50nm，优选4至1nm，更优选8nm。平均粒径是平均最大颗粒尺寸，可理解，颗粒不一定是球形的。颗粒尺寸可利用常规技术如显微镜技术(例如，透射电镜)常规地测量。在一个实施方式中，根据本发明使用的纳米颗粒具有球形的或基本上球形的形状。形状可通过常规光学或电子显微镜技术常规地评估。
[0057]术语“金属”，如本文所用，指代作为良好的电和热导体的任何元素、化合物或合金。在【具体实施方式】中，金属选自铁、锰、钴、镍、妈、锌、镁、钾、铜、络、砸、硅、碘及其组合。在优选实施方式中，金属选自铁、钙、锌、砸及其组合。在更优选的实施方式中，金属是铁。
[0058]在【具体实施方式】中，当金属是砸时，其不是砸代半胱氨酸形式。
[0059]金属可以是零氧化态或氧化物形式。在更具体的实施方式中，金属是氧化物形式。术语“金属氧化物”，如本文所用，指代金属元素的任何氧化物。术语“氧化物”指代包含一个或多个-2氧化态氧原子以及其他元素的任何化学化合物。在【具体实施方式】中，金属氧化物氧化铁。可构成本发明细菌的纳米颗粒的部分的氧化铁的示例性非限制性实例是磁赤铁矿、磁铁矿、赤铁矿、针铁矿和水铁矿。在【具体实施方式】中，氧化铁选自磁赤铁矿、磁铁矿、赤铁矿、针铁矿和水铁矿。
[0060]在还更优选的实施方式中，氧化铁是磁赤铁矿。
[0061 ]术语“磁赤铁矿”，如本文所用，指代式γ -Fe2O3限定的氧化铁矿物质。
[0062]术语“磁铁矿”，如本文所用，指代式Fe3O4限定的氧化铁矿物质。
[0063]术语“赤铁矿”，如本文所用，指代式Ct-Fe2O3限定的氧化铁矿物质。
[0064]术语“针铁矿”，如本文所用，指代式a-FeO(OH)限定的氧化铁矿物质。
[0065]术语“水铁矿”，如本文所用，指代式(Fe3+)203.0.5H20或式式[Fe3+1()014(0H)2]限定的氧化铁矿物质。
[0066]在本发明细菌的【具体实施方式】中，纳米颗粒是磁性纳米颗粒。术语“磁性纳米颗粒”，如本文所用，指代具有铁磁性和/或超顺磁性表现的任何纳米颗粒。非限制性的适当实例可包括 Fe203、Fe304、Fe204、FexPty、CoxPty、MnFex0y、CoFexOy、NiFexOy、CuFexOy、ZaFexOy，和CdFexOy，其中X和y在I和6之间变化，取决于本领域已知的合成方法。在优选实施方式中，磁性纳米颗粒包括氧化铁。在更优选的实施方式中，磁性纳米颗粒包括磁赤铁矿。
[0067]可附着至根据本发明第一方面的细菌的纳米颗粒可通过本领域技术人员已知的方法获得，如，例如，Massart描述的方法(Massart，R.1EEE Trans.Magn.1981,1247-1248)，如实施例1示例。
[0068]在优选实施方式中，纳米颗粒直接结合至细菌，S卩，其不包含任何朝向外侧的化学基团或任何可与细菌壁组分形成相互作用的包衣。在优选实施方式中，不用胺基团官能化纳米颗粒。在另一优选的实施方式中，不用聚合物组分涂覆金属纳米颗粒。在还更优选的实施方式中，不用聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)-b-聚(L-组氨酸)-b-聚-(乙二醇)(PLGA-PLH-PEG)涂覆纳米颗粒。
[0069]在【具体实施方式】中，细菌包括金属纳米颗粒和至少一种另外的金属，例如，2、3、4或更多种另外的金属。在此【具体实施方式】中，所述另外的金属不同于构成金属纳米颗粒的金属。在更具体的实施方式中，另外的金属选自铁、锰、钴、镍、钙、锌、镁、钾、铜、铬、砸、硅、碘及其组合。在优选实施方式中，细菌包括金属纳米颗粒，该金属纳米颗粒包括铁，优选氧化铁，更优选磁赤铁矿，和一种或多种另外的金属，该另外的金属选自锰、钴、镍、I丐、锌、镁、钾、铜、铬、砸、硅、碘及其组合。在更具体的实施方式中，细菌包括金属纳米颗粒，该金属纳米颗粒包括铁，优选氧化铁，更优选磁赤铁矿，和一种或多种另外的金属，该另外的金属选自钙、锌、砸及其组合。在更具体的实施方式中，细菌包括金属纳米颗粒，该金属纳米颗粒包括铁，优选氧化铁，更优选磁赤铁矿，和进一步包括金属，该金属选自锌和妈，更优选其包括锌和钙。
[0070]第二方面，本发明涉及本发明第一方面所述细菌的生物纯培养物。
[0071 ]术语“生物纯培养物”，如本文所用，指代这样的培养物:在其中发现，与培养物中存在的其他生物体相比，本发明细菌的比例为95%或更高(例如，96%或更高、97%或更高、98 %或更高、99 %或更高或100 % )。术语“培养物”，如本文所用，指代本发明细菌的菌群。培养物可包括本发明细菌以外的成分，如培养基或可被添加至培养基、有益于培养物生长或维持的任何其它物质。术语“培养基(culture medium)”或“介质(medium)”在本领域已知，总体上指代用于活细胞培养的任何物质或制剂。关于细胞培养物所用的术语“介质”包括在细胞周围环境的组分。介质可以是固相、液相、气相或相位和材料的混合物。介质包括液体生长介质以及不维持细胞生长的液体介质。介质还包括胶状介质，如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原蛋白基质。示例性气态介质包括在皮氏培养皿或其它固体或半固体载体上生长的细胞所暴露的气相。术语“介质”还指代意图用于细胞培养的材料，即使其还未与细胞接触。换句话说，制备用于细菌培养的富养分液体是介质。类似地，在与水或其它液体混合时适于细胞培养的粉末混合物可被称为“粉末状介质”。“确定的介质”指代由化学上确定的(通常是纯化的)组分制成的介质。“确定的介质”不包含表征不清的生物学提取物，如酵母提取物和牛肉汤。“富介质”包括被设计以支持具体物种的大多数或所有可存活形式生长的介质。富介质通常包括复杂的生物学提取物。本领域已知的适于乳酸细菌或双歧杆菌培养物的任何常规培养基可用于本发明，如，例如，MRS介质、HANK介质、APT介质、RCM介质、LMl 7介质、GMl7介质和ElIiker介质。在【具体实施方式】中，可构成本发明生物纯培养物的部分的培养基是MRS介质。适于乳酸细菌和双歧杆菌培养的MRS介质和其他介质的描述可见于Handbook ofCulture Media for Food Microb1logy,Vol.34,Janet E.L.Corry、G.D.W.Curtis、Rosamund M.Baird编著。
[0072]获得细菌的方法
[0073]第三方面，本发明涉及获得选自乳酸细菌和双歧杆菌属细菌、包括结合于其表面的至少一种金属的细菌的方法，包括使所述细菌与至少所述金属接触，其中所述接触在存在至少一种二价阳离子盐的情况下并且在其中所述细菌的生长大幅(实质，substantial Iy)减少的温度下进行。
[0074]术语“乳酸细菌”、“双歧杆菌属细菌”、和“金属”已在前文关于本发明第一方面进行过描述。
[0075]根据第三方面的方法，乳酸细菌或双歧杆菌属细菌与金属之间的接触应在存在至少一种二价阳离子盐的情况下进行。术语“二价阳离子盐”，如本文所用，指代其中二价阳离子偶联至反离子或处于溶液中的化合物。术语“二价阳离子”，如本文所用，指代处于正氧化态，产生价态为2的正电荷的元素。二价阳离子的实例是Fe2+、Mn2+、C02+、Ni2+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Cr2+、Se2+和Si2+。优选地，二价阳离子盐选自钙盐、镁盐及其组合。更优选地，二价阳离子盐选自氯化钙、氯化镁及其组合。还更优选，二价阳离子盐是氯化钙和氯化镁的组合。不希望束缚于任何具体理论，认为盐的添加能够影响细菌表面，增加其多孔性，从而增加金属结入口 ο
[0076]根据第三方面的方法，乳酸细菌或双歧杆菌与金属之间的接触应在其中所述细菌的生长大幅减少的温度条件下进行。术语“最低生长温度”，如本文所用，指代这样的温度:在该温度以下不发生持续平衡的细菌生长。适于实施根据本发明的方法的生长温度根据细菌而变化，并且应针对每个物种和细菌菌种来确定。本领域技术人员已知确定其中细菌生长大幅减少的温度条件的方法和技术，如Shaw等描述的方法(Shaw等，Journal ofBacter1logy，1971，Vol.105(2):683-684)。在【具体实施方式】中，乳酸细菌或双歧杆菌与金属之间的接触在0°C和10°C之间包括的温度，更优选在0°C下进行。
[0077]在优选实施方式中，实施接触金属的温度是细菌生长减少至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或更多(相对于细菌在其最佳生长温度的生长)的温度。
[0078]在【具体实施方式】中，在与金属一起温育前，乳酸细菌或双歧杆菌被冷却至最低生长温度(例如，0°C)以下的温度一一例如，通过将乳酸细菌或双歧杆菌培养物在冰上保存一段时间，例如，1分钟。
[0079]将要根据第三方面所述的方法通过金属修饰的乳酸细菌或双歧杆菌可通过在本领域技术人员已知的标准培养条件下培养适当的细菌来获得。在【具体实施方式】中，乳酸细菌或双歧杆菌得自在MRS介质中的24小时培养。在优选实施方式中，细菌一一为获得包括结合于其表面的金属的细菌其将要通过第三方面所述的方法处理一一已在不包括所述金属的培养基中生长。不希望束缚于任何具体理论，认为由于细菌与金属在不允许显著细菌生长的条件下接触，金属不显著进入细菌，而是合并到细菌表面上。
[0080]在第三方面的方法的【具体实施方式】中，使乳酸细菌或双歧杆菌与纳米颗粒中包含的金属接触。术语“纳米颗粒”在前文已被定义。在此【具体实施方式】中，所述接触应在金属纳米颗粒具有正表面静电电荷的PH下进行。术语“表面静电电荷”，如本文所用，指代可通过纳米颗粒的ζ电位测量的静电电荷或粒子。术语“ζ电位”指代滑动面位置处的界面双层(DL)相对于远离界面的流体主体中的点的电位。换句话说，ζ电位是分散介质与附着于分散颗粒的流体静止层之间的电位差。本领域技术人员已知如何基于实验确定的电泳迀移率或动态电泳迀移率计算纳米颗粒的ζ电位(Delgado AV等，2005，Pure Appl.Chem.77(10): 1753-1850；Dukhin AS和Goetz PJ，〃Ultrasound for characterizing colloids",Elsevier，
2002)o
[0081]金属纳米颗粒的表面静电电荷呈阳性的pH将取决于纳米颗粒组成，并且可由本领域技术人员确定。例如，当金属纳米颗粒包括磁赤铁矿时，pH应低于5。在优选实施方式中，当金属纳米颗粒包括磁赤铁矿时，在pH 2下温育乳酸细菌或双歧杆菌和磁赤铁矿纳米颗粒。
[0082]这些实验条件保留细菌的生物膜EPS(胞外聚合物物质)JPS的存在似乎为接枝金属纳米颗粒至细菌所需(图1 c )。事实上，当按照标准方案(Molecular cloning: alaboratory manual.Vol.2.John J.Sambrook?David David?ffi11iam Russell CSHLPress，2001)将EPS生物膜去除时，阳性金属纳米颗粒不被固定至细菌外表面(图lc)。
[0083]在【具体实施方式】中，在温育乳酸细菌或双歧杆菌培养物与金属前进行干燥步骤。所述干燥步骤可通过技术人员已知的任何适当的技术进行，如细胞培养物离心和介质滗析(倾析，decantat1n)。
[0084]在第三方面的方法的【具体实施方式】中，使乳酸细菌或双歧杆菌与两种或更多种金属接触。在更具体的实施方式中，使细菌与纳米颗粒中包括的第一金属接触，所述接触在纳米颗粒具有阳性静电电荷的PH下进行，并且至少一种另外的金属不同于纳米颗粒中包括的金属。在还更具体的实施方式中，使细菌与下列接触:铁纳米颗粒，例如，磁赤铁矿纳米颗粒;和选自钙、锌、砸及其组合的另外的金属，优选选自钙、锌及其组合的另外的金属，更优选钙和锌的组合。
[0085]金属可通过下列提供:包括包含所述金属的化合物(例如，所述金属的盐)的溶液，或包括包含所述金属的纳米颗粒的溶液。
[0086]当需要包括超过一种另外金属的细菌时，可在相同步骤中使乳酸细菌或双歧杆菌与这些另外的金属接触，即，将细菌与包括不同的另外的金属的溶液一起温育，或优选地，乳酸细菌或双歧杆菌和各不同金属之间的接触可在不同的相继温育步骤中进行。在【具体实施方式】中，额外的步骤(一个或多个)在乳酸细菌或双歧杆菌与金属纳米颗粒温育前进行。在更具体的实施方式中，每个额外的使细菌与另外的金属接触的步骤之后是干燥步骤。所述干燥步骤可包括，例如，离心细菌和含金属溶液的混合物，和去除溶液。
[0087]在【具体实施方式】中，第三方面的方法包括下列步骤:
[0088]-使乳酸细菌或双歧杆菌与第一金属(例如，钙)接触。
[0089]-使乳酸细菌或双歧杆菌与第二金属(例如，锌)接触。
[0090]-使乳酸细菌或双歧杆菌与包括第三金属(例如，铁，优选磁赤铁矿)的纳米颗粒接触。
[0091]进一步方面，本发明还涉及通过第三方面的方法可获得的细菌、通过第三方面的方法获得的细菌和其生物纯培养物。术语“生物纯培养物”在前文已被定义。
[0092]食品和药物组合物
[009