包括金属、金属纳米颗粒的益生细菌和其应用_6

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菌,c)具有钙和锌的细菌,和最后d)具有钙、锌和铁的细菌。
[0216]大体程序如下:
[0217]1.测量24小时发酵乳杆菌培养物的0.D.600以收集2 X 19个细胞/ml。
[0218]2.通过将管在冰上保存10分钟来冷却培养物至0°C。
[0219]3.在4°C下通过以3000g离心20分钟回收细胞。
[0220]4.从细胞团滗析介质。将管倒置在纸巾垫上I分钟,以允许最后痕量介质被吸走。
[0221]5.通过旋流或轻柔涡流在Iml冰冷MgCl2-CaCl2溶液(174.02g的CaCl2.2H20和203.02g的MgCl2.6H20,并将其溶于IL蒸馏水)中重悬浮各细胞团。
[0222]6.在4°C下通过以3000g离心20分钟回收细菌。
[0223]7.从细胞团滗析介质。将管倒置在纸巾垫上I分钟,以允许最后微量介质被吸走。
[0224]8.通过旋流或轻柔涡流在Iml冰冷0.5M CaCl2中重悬浮各细胞团。
[0225]9.添加5μ1Ζη(Ν03)2.4H20(IM)0
[0226]10.在4°C下通过以3000g离心20分钟回收细菌。
[0227]11.添加ΙΟΟμΙ磁赤铁矿纳米颗粒(0.95M,pH 2-5)至分离的细胞团。
[0228]注1:在制备只有细菌的对照(对照)时,在步骤7后,通过旋流或轻柔涡流在Iml蒸馏水中重悬浮细胞团,然后跳至步骤11。
[0229 ] 注2:在制备只有CaCl 2的细菌时,删除步骤9和1。
[0230] 注3:在制备具有CaCl2和锌的细菌时,删除步骤11。
[0231 ]注4:在制备具有CaCl2、锌和铁的细菌时,添加矿物质遵循的顺序是钙,锌和铁。
[0232]12.将管转移至布置在预热42°C循环水浴中的支架。将管在支架中保存精确90秒。不晃动管。
[0233]13.将管快速转移至冰浴。使细菌冷却1-2分钟。
[0234]14.在4°C下通过以3000g离心20分钟回收细菌。
[0235]15.将细菌在蒸馏水中洗涤两次。
[0236]将所得细菌样本在胃液和胃肠液中在37°C下培育,伴以持续搅动(170rpm)。每小时采集Iml样本,在胃液模拟的情况下完成6小时,并且在胃肠液模拟的情况下完成4小时。通过原子吸收和ICP(电感耦合等离子体质谱法)分析金属释放。
[0237]模拟胃液组合物:模拟胃液通过如下制备:将胃蛋白酶(0.0lg)、胃粘蛋白(0.015g)和NaCl(0.088g)溶于1ml蒸馏水,并用IM HCl将pH调节为1.3。
[0238]反应池中的样本的最终组成因此为lmg/ml胃蛋白酶、1.5mg/ml胃粘蛋白和8.8mg/ml Nacl(0.15mM)ο
[0239]模拟胃肠液组合物:模拟胃肠液通过如下制备:将胆汁提取物(0.05g)、脂酶(0.016g)和CaC12(0.007g)溶于1ml蒸馏水,并用IM HCl或NaOH将pH调节为7.0。
[0240]反应池中的样本的最终组成因此为5mg/mI胆汁提取物、1.6mg/mI脂酶、5mMCaCl2o
[0241 ]结果
[0242]将用磁赤铁矿特别制备的发酵乳杆菌样本(M1-M18)置于包含适当模拟胃液和肠液的适当容器中,并在37°C下温育,伴以持续搅拌。在下列时间采集样本:0、1、2、3、4、5和6小时。将样本离心,以滗析细菌,并取900μ1上清液用于分析。结果显示在胃条件下小规模的Fe释放。释放在结肠条件下明显较高,并且大部分在第一个小时内发生(图5)。
[0243]遵照相同的方案,在存在和不存在磁性纳米颗粒的情况下分析钙和锌金属释放(图6和7)。
[0244]实施例3
[0245]细菌表面上的金属掺并
[0246]材料和方法
[0247]扫描电镜(SEM)研究表面精细结构的最有效的技术之一。通过利用与能量色散X射线分析仪(EDX)X-Max 50mm偶联的Zeiss SUPRA40VP扫描电镜来记录SEM图像。EDX是用于元素分析或化学表征的分析技术。通过电弧放电法用碳涂覆样本,以用于SEM-EDX。
[0248]结果
[0249]利用能量色散X射线光谱确定个体细菌表面的元素组成。图8a的SEM图像显示与Ca2+—起温育后的细菌ADX光谱显示Ca的3.8eV特征Ka峰,表示10重量%左右的值(图8b)。
[0250]图9a的SEM图像显示与磁赤铁矿和Ca2+—起温育后的细菌。EDX光谱分别显示Fe和Ca的6.2eV和3.8eV特征Ka峰(图9b)。铁显示20重量%左右的值,而钙的百分比为10%。
[0251]实施例4
[0252]包含磁赤铁矿纳米颗粒的细菌作为口服MRI造影剂
[0253]材料和方法
[0254]利用在200MHz下运行并且装备有33cm孔磁体(Oxford Ltd.,UK)的4.7TB1specTomograph系统(Bruker ,Karlsruhe,德国)进行 MRI 测定。
[0255]体内实验
[0256]在体内实验中,使用重约20g的正常Balb-c小鼠。口服给予不同Fe剂量的造影剂。
[0257]结果
[0258]MRI是人多种疾病的最有效的非侵入性诊断方式之一。
[0259]对在磁赤铁矿纳米颗粒已被标记后在造影细菌的MRI图像中的效力进行测试。该系统的主要优点如下:
[0260]1.细菌充当超顺磁性磁赤铁矿纳米颗粒的口服载体。
[0261]2.细菌不在胃处递送磁赤铁矿纳米颗粒,因此,可采集MRI图像(图10)。细菌上颗粒饱和水平或细菌量的控制对于最佳MRI获取而言是必要的。
[0262]3.细菌随着pH升高释放磁赤铁矿纳米颗粒,因此这些颗粒的递送发生在其沿肠道经过(trip)期间(图11)。
【主权项】
1.细菌,其选自乳酸细菌和双歧杆菌属细菌,包括结合于其表面的至少一种金属纳米颗粒。2.根据权利要求1所述的细菌,其中所述金属纳米颗粒包括选自下列的金属:铁、锰、钴、镍、I丐、锌、镁、钾、铜、络、砸、娃、碘及其组合。3.根据权利要求1或2中任一项所述的细菌,其中所述金属纳米颗粒是磁性纳米颗粒。4.根据权利要求1至3中任一项所述的细菌,其中所述金属是氧化物形式。5.根据权利要求4所述的细菌,其中所述金属氧化物是氧化铁。6.根据权利要求5所述的细菌,其中所述氧化铁选自磁赤铁矿、磁铁矿、赤铁矿、针铁矿和水铁矿。7.根据权利要求1至6中任一项所述的细菌,进一步包括不同于所述纳米颗粒中包括的所述金属的至少一种另外的金属。8.根据权利要求7所述的细菌,其中所述至少一种另外的金属选自铁、猛、钴、镍、I丐、锌、镁、钾、铜、络、砸、娃、碘及其组合。9.根据权利要求8所述的细菌,其中所述纳米颗粒包括氧化铁,并且其中所述至少一种另外的金属选自钙、锌、砸或其组合。10.根据权利要求1至9中任一项所述的细菌,其中所述纳米颗粒具有2和50nm之间的尺寸。11.根据权利要求1至10中任一项所述的细菌,其中所述乳酸细菌选自发酵乳杆菌、加氏乳杆菌、罗伊乳杆菌、棒状乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、胚牙乳杆菌、唾液乳杆菌和保加利亚乳杆菌,并且所述双歧杆菌属细菌选自短双歧杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、幼J L双歧杆菌和动物双歧杆菌。12.获得选自乳酸细菌和双歧杆菌属细菌的、包括结合于其表面的至少一种金属的细菌的方法,包括使所述细菌与至少所述金属接触,其中所述接触在存在至少一种二价阳离子盐的情况下和在其中所述细菌的生长大幅减少的温度下进行。13.根据权利要求12所述的方法,其中所述金属选自铁、锰、钴、镍、I丐、锌、镁、钾、铜、铬、砸、硅、碘及其组合。14.根据权利要求12或13中任一项所述的方法,其中所述金属被包含在纳米颗粒中,并且所述细菌和所述纳米颗粒之间的所述接触在所述纳米颗粒具有正表面静电电荷的PH下进行。15.根据权利要求14所述的方法,其中所述纳米颗粒是磁性纳米颗粒。16.根据权利要求15所述的方法,其中所述金属是氧化物形式。17.根据权利要求16所述的方法,其中所述金属氧化物是氧化铁。18.根据权利要求17所述的方法,其中所述氧化铁选自磁赤铁矿、磁铁矿、赤铁矿、针铁矿和水铁矿。19.根据权利要求14至18中任一项所述的方法,其中所述纳米颗粒具有2和50nm之间的尺寸。20.根据权利要求12至19中任一项所述的方法,包括使所述细菌与纳米颗粒中包括的第一金属在所述纳米颗粒具有正表面静电电荷的pH下接触,和使之与至少一种另外的金属接触,其中所述第一金属与所述至少一种另外的金属不同。21.根据权利要求20所述的方法,其中所述第一金属是磁赤铁矿,并且所述另外的金属是钙和锌的组合。22.根据权利要求12至21中任一项所述的方法,其中所述乳酸细菌选自发酵乳杆菌、加氏乳杆菌、罗伊乳杆菌、棒状乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、胚牙乳杆菌、唾液乳杆菌和保加利亚乳杆菌,并且所述双歧杆菌属细菌选自短双歧杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、幼J L双歧杆菌和动物双歧杆菌。23.根据权利要求12至22中任一项所述的方法,其中所述二价阳离子盐选自钙盐、镁盐及其组合。24.根据权利要求23所述的方法,其中所述二价阳离子盐选自氯化钙、氯化镁及其组入口 ο25.根据权利要求12至26中任一项所述的方法,其中所述细菌和所述金属之间的所述接触在0°C和10°C之间包括的温度下进行。26.通过根据权利要求12至25中任一项所述的方法可获得的细菌。27.根据权利要求1至11中任一项所述的细菌或根据权利要求26所述的细菌的生物纯培养物。28.食品,包括根据权利要求1至11中任一项所述的细菌或根据权利要求26所述的细菌或根据权利要求27所述的生物纯培养物。29.药物组合物,包括根据权利要求1至11中任一项所述的细菌或根据权利要求26所述的细菌或根据权利要求27所述的生物纯培养物和药学上可接受的载体。30.选自根据权利要求1至11所述的细菌和根据权利要求26所述的细菌的细菌、或根据权利要求27所述的生物纯培养物,用于其在治疗和/或预防与金属缺乏相关的疾病或状况中的应用,其中所述细菌包括所述疾病或状况缺乏的金属,并且其中所述细菌或培养物被口服给予。31.根据权利要求30所述的用于应用的所述细菌或其生物纯培养物,其中所述与金属缺乏相关的疾病或状况选自与铁缺乏相关的疾病或状况、与锰缺乏相关的疾病或状况、与钴缺乏相关的疾病或状况、与镍缺乏相关的疾病或状况、与钙缺乏相关的疾病或状况、与锌缺乏相关的疾病或状况、与镁缺乏相关的疾病或状况、与钾缺乏相关的疾病或状况、与铜缺乏相关的疾病或状况、与铬缺乏相关的疾病或状况、与砸缺乏相关的疾病或状况、与硅缺乏相关的疾病或状况和与碘缺乏相关的疾病或状况。32.选自根据权利要求1至11所述的细菌和根据权利要求26所述的细菌的细菌、或根据权利要求27所述的生物纯培养物,用于其在癌症治疗中的应用,其中所述金属被包含在磁性纳米颗粒中。33.根据权利要求32所述的用于应用的所述细菌或生物纯培养物,其中所述癌症是胃肠道癌。34.用于在对象肠道中递送金属的非治疗方法,包括口服给予根据权利要求1至11中任一项所述的细菌或根据权利要求26所述的细菌或根据权利要求27所述的生物纯培养物。35.造影剂,包括根据权利要求1至11中任一项所述的细菌或根据权利要求26所述的细菌或根据权利要求27所述的生物纯培养物,其中所述金属被包含在纳米颗粒中。36.根据权利要求1至11中任一项所述的细菌或根据权利要求26所述的细菌或根据权利要求27所述的生物纯培养物作为磁共振成像造影剂的应用,其中所述金属被包含在磁性纳米颗粒中。37.根据权利要求36所述的应用,其中所述细菌或培养物被口服或静脉内给予。38.根据权利要求36或37中任一项所述的应用,其用于消化道的磁共振成像。39.用于对象的消化道的磁共振成像的方法,其包括: (i) 口服给予所述对象根据权利要求1至11中任一项所述的细菌、或根据权利要求26所述的细菌、或根据权利要求27所述的生物纯培养物或根据权利要求35所述的造影剂,其中所述金属被包含在纳米颗粒中,和 (i i)检测所述对象的消化道中的所述金属纳米颗粒。40.根据权利要求39所述的方法,其中所述对象的消化道中所述金属纳米颗粒的检测在所述口服给予后I和5小时之间进行,从而使胃成像;或在所述口服给予后6和24小时之间进行,从而使肠道成像。
【专利摘要】本发明涉及选自乳酸细菌如乳杆菌属和双歧杆菌的包括金属和/或金属纳米颗粒的益生细菌,和包括这些细菌的食品和药物组合物。本发明还提供获得这些细菌的方法和这些细菌用于治疗和预防矿物质缺乏病症、作为消化道成像造影剂和用于治疗癌症的应用。
【IPC分类】A61K33/34, A61K35/747, A61P35/00, A23L33/16, A61K49/18, A61P3/02, A61K49/00, A23L33/135, C12N1/20, C12R1/225, A61K35/74, A23L33/165
【公开号】CN105517453
【申请号】CN201480047246
【发明人】J·M·多明格斯维拉, N·加尔韦斯罗德里格斯, M·A·马丁马科斯, F·卡蒙娜罗德里格斯-阿科斯塔, D·龙东罗德里格斯, M·奥利瓦雷斯马丁
【申请人】生物学研究院
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2014年6月24日
【公告号】EP2818056A1, EP3019038A1, US20160160207, WO2014206969A1
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