一种饲料防霉添加剂及其制备、使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于畜禽类饲料添加剂领域，具体涉及到一种以茶茎、茶梗及不能入茶的 茶树老叶等为原料的饲料防霉添加剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 中国是畜牧和海水养殖大国，饲料无疑是支撑其发展的物质基础。但是饲料容易 在储存过程中霉变，不利于储存。据联合国粮农组织估计，全世界每年大约有5-7%的粮食、 饲料等农作物产品遭受霉菌污染。大量生长和繁殖的霉菌不仅消耗了饲料中的营养物质， 使饲料质量下降、饲料报酬降低，而且畜禽食用后会引起腹泻、肠炎从而引起消化能力降 低、免疫功能下降等症状，严重的可造成畜禽死亡。由于饲料霉变及霉菌毒素污染严重影响 着饲料工业和畜牧业生产，饲料的防霉保鲜一直是饲料业亟待解决的重要问题。
[0003] 近年来的研究证明，霉变引起的食源性疾病是弯曲菌(Campylobacterspp)、志贺 氏菌（Shigella spp)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、耶尔森氏肠 杆菌(Yersenia enter olitica)、沙门氏菌（Salmonella spp)及大肠杆菌(E.coli)等多种 致病菌。这些病菌感染的疾病已是目前面临的常见问题，优选治疗方法是使用抗生素。但因 细菌耐药性等问题，欧洲共同体已禁止使用多种抗生素用于防止饲料防霉。至今为止饲料 防霉主要采用辐射灭菌、添加防霉剂、使用防霉包装袋等，其中饲料防霉添加剂有化学防霉 剂和天然防霉剂。化学防霉剂成本低、产量大、易获得，但是化学防霉剂具有不同程度的安 全问题。因此，开发高效、安全无毒的天然防霉剂越来越受到重视。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提出一种饲料防霉添加剂及其制备、使用方法，该饲料防霉添加 剂采用茶茎、茶梗等天然材料制成，成本低廉、安全可靠，可以避免化学防霉剂所引发的诸 多安全问题。
[0005] 本发明的饲料防霉添加剂以茶茎和/或茶梗作为原料，粉碎成粉末或制备提取物 而制成。
[0006] 在本发明中，上述粉末的粒径小于0.85mm，以便于牲畜消化吸收，并减少对牲畜消 化系统的损害。
[0007] 进一步地，为降低成本，所述茶茎、茶梗是在冬季修剪茶树时获得的。目前冬季修 剪茶树时，所修剪下来的茶茎、茶梗均当做废物处理，将其用于饲料防霉添加剂，属于废物 利用，成本接近于零，大大提高了市场竞争力。
[0008] 本发明的饲料防霉添加剂的机理如下：
[0009] 茶叶提取物具有显著的抗氧化抑菌活性及保鲜功能，且安全性较高，引起人们的 广泛关注，目前已经有些公司采用茶叶提取物作为饲料防霉添加剂。茶多酚是茶叶提取物 的主要活性成份之一，是决定茶叶色、香、味及功效的主要成分，约占茶叶干物质重量的 30%左右。按其化学结构分为儿茶素、黄酮、花青素、酚酸等成分，其中表儿茶素(EC)、表儿 茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)占儿茶 素总量的70%左右，是茶多酚中起主要抗氧化活性、清除自由基和抑制微生物的生物活性 物质。但是，采用茶叶提取物作为饲料防霉添加剂有以下缺点：茶叶提取物不仅成本高，而 且茶叶中富含的咖啡因等生物碱具有明显的中枢兴奋作用限制了其在饲料防腐添加剂中 的使用。
[0010]下面为茶茎、茶梗及茶树叶提取物的制备与成分分析：
[0011]实验样品由贵州普安宏鑫茶厂提供。实验准确称取干燥茶茎、茶500g，使用粉碎机 粉碎后回收细粉化的茶茎、茶，加入10倍量的水溶液，加热提取30分钟，提取液经纱布过滤 后，滤饼再用相同条件提取1次，纱布过滤，合并两次滤液。滤液浓缩后，经冷冻干燥得茶茎、 茶水提取物用于本研究。
[0012] 鉴于茶茎、茶提取物是以饲料添加剂作为最终产品开发，故从安全性角度考虑提 取溶剂尽量选择水、乙醇或含水乙醇为宜。提取时茶茎、茶与溶剂的比率没有特定限制，但 一般茶茎、茶与溶剂的比例5:1~50范围为宜。本发明对提取温度没有特定限制，从室温到 溶剂沸点范围都可适用。当然室温、常压及在溶剂沸点范围内提取最为理想。提取方法可以 采用加热提取、超声提取、微波提取等，也可多种方法结合起来应用。提取时间从30分钟到 24小时范围均可以。
[0013] 本实验采用的分析方法为高效液相色谱法。DIONEX液相分析仪为Ultimate3000 型，电子天平为Sartorius BP2IlD十万分之一型，恒温干燥箱为德国Memmert型，超纯水仪 为Merck miIlipore公司，小型粉碎机为杭州熊火科技有限公司，乙腈为Fisher(色谱纯）， 甲酸为广州化学试剂厂(分析纯）。对照品咖啡因（Caffeine,Caff )，可可碱(Theobromine, Tb)，没食子儿茶素没食子酸酯（(-)-Gall〇CateChin gallate，GCG)，表没食子儿茶素没食 子酸酯（（-)-Epigal locatechin gal late ,EGCG)购自日本和光纯药株式会社；没食子酸 (Gallic acid ,GA)，儿茶素（（ + )-Catechin，C)购自美国Sigma公司；没食子儿茶素（（-)-Gal I ocatech in，GC )，表没食子儿茶素 （Epi gal locatech in ,EGC )，表儿茶素 (Epicatech in, EC)购自日本栗田工业株式会社;表儿茶素没食子酸酯（（-)-Epicatechin_3-gallate，ECG) 购自上海晶纯生化科技股份有限公司。
[0014] 色谱条件，色谱柱为C0SM0SIL 5C18-AR-II(4.6*250mm，5ym，Nacalai tesque. Inc.，Japan)，流速为lml/min，定量检测波长为231腦，柱温为35°(3，进样量为2(^1。 流动相A:H20(含0.1%甲酸）；流动相8:0130以含0.1%甲酸）。供试样品经蒸馏水溶解后离 心，经0.45μπι水膜过滤后进HPLC分析，样品中各成分含量见表1。
[0015] 表1.茶茎、茶梗及芽茶提取物中生物碱及多酚类化合物含暈（％ )
LUUi/j U :禾粒测出。
[0018] 由表1可以看出，在茶茎、茶梗及芽茶的提取物中，芽茶提取物中的咖啡因 (Caffeine，Caff)含量要远远高于茶茎、茶梗的提取物，可见利用茶叶提取物作为饲料防霉 添加剂，对牲畜的健康不利;而茶茎、茶梗的提取物富含儿茶素等多酚类抗菌、抗病毒活性 成分，有利于饲料防霉，且不会对牲畜的健康形成负面作用。
[0019] 下面继续测试及分析茶茎、茶梗提取物的抗氧化作用。
[0020] 抗氧化活性采用体外抗氧化能力指数(oxygen radical absorbance capacity， ORAC)测定。测定原理为荧光素钠在485nm光的激发下，发射527nm的荧光，此荧光可以被 AAPH释放的过氧自由基氧化而导致荧光衰退。当抗氧化剂存在时，可与荧光素钠竞争氧化 剂，减缓其荧光衰减的速度。这一特性可用来作为测定样品氧自由基清除活性的依据。ORAC 实验需要设定两种对照，没有抗氧化剂存在时的自由基作用对照(+AAPH)和没有添加自由 基产生剂的荧光自然衰减对照(-AAPH)。抗氧化剂作用下的荧光衰退曲线下面积与无抗氧 化剂存在(+AAPH)时自由基作用的荧光衰退曲线下面积之差，即荧光熄灭曲线下的延迟部 分面积(NetAUC)为抗氧化剂的保护面积。样品的抗氧化能力与其保护面积直接相关。
[0021] 测定方法:在96孔板每个微孔中加入待测样品溶液20yL，再加入磷酸钾缓冲液20μ L以及AAPH140yL(终浓度12.8mmol/L)，最后添加荧光素钠20yL(终浓度63nmol/L)，此时反 应启动，迅速将酶标板置于预温37°C的荧光酶标仪中开始测定。本方法采用动力学方式，每 2min测定一次，至荧光强度衰减至零为止。实验所得各微孔反应的荧光强度数据将通过软 件输出到Excel中作进一步处理。各微孔不同时间点的绝对荧光强度数据与-AAPH孔荧光强 度相比，折算成相对荧光强度f，以相对荧光强度采用近似积分法计算荧光衰减的曲线下面 积。荧光衰退曲线下面积可以近似看作各梯形面积之和，公式为:AUC = O.5X(fO+fl)X At +0.5X(fl+f2)X Δ?+···+0.5Χ (fx+fx+1 )X At+---+0.5X(fn-l+fn)X At = 0.5X[2X (fO+fl+'"+fn-l+fn) - fO - fn] X Δ t抗氧化剂的氧自由基清除能力ORAC值(抗氧化能力指 数），是通过焚光衰退曲线的保护面积NetAUC与Ιμπιο? · L-I标准抗氧化物质Trolox的保护 面积相比得出的。其计算公式为：〇RAC值= K[(AUCSample-AUC+AAPH)/(AUCTrolox-AUC+ AAPH)]，K为样品稀释倍数。如表2所示，芽茶、茶茎、茶梗提取物均显示较强的体外抗氧化能 力，可以说，芽茶、茶茎、茶梗在抗氧化能力方面相差不大。
[0022]表2.芽茶、茶莖、茶梗提取物的抗氧化能力指数(mmol/g tea)
LUUM」 卜_测试及分析汆圣、汆梗提取物的杌菌作用。
[0025]实验采