一种枯草芽胞杆菌合生元组合制剂的制备方法及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种枯草芽孢杆菌合生元组合制剂及其制备方法与应用，植物浸提物可在发酵过程中提高枯草芽胞杆菌和草分枝杆菌细胞量及代谢产物量，代谢产物富含胞壁酰二肽、脂多糖、类胡萝卜素、黄酮、氨基酸等多种活性组分，在模拟肠道的厌氧拟生环境下，对肠道益生菌如双歧杆菌有显著促生长作用，在饲料中应用可以明显提高仔猪肠道中有益微生物数量，达到有效调节肠道消化吸收功能及提高机体免疫力之功效。CGMCC NO. 091620030401
【专利说明】
一种枯草芽胞杆菌合生元组合制剂的制备方法及其应用
[0001]
技术领域
[0002] 本发明涉及生物技术工程领域，特别是一种枯草芽胞杆菌合生元组合制剂的制备 方法。
【背景技术】
[0003] 合生元是指一类具有调节肠道消化代谢吸收功能的，由益生菌和益生元联合使用 的一种微生态制剂。高等动物的消化吸收功能主要取决于肠道的功能，而肠道内微生物菌 群的平衡在吸收代谢过程中扮演着至关重要的作用，大量研究表明肠道内一旦以双歧杆 菌、乳酸菌为代表的益生菌群与无害菌、病原菌处在失衡状态时，即表现为代谢紊乱，因此 调节肠道内微生态环境，有效提高肠道益生菌数量至关重要。在厌氧的肠道内提高双歧杆 菌的数量有两种方式:1.摄入含大量双歧杆菌等益生菌的食物。所有摄入食物在胃部经强 酸及大量蛋白酶作用下，微生物难以保持活性，更加难以活菌形式驻存在肠道内，主要是微 生物的代谢产物对肠道益生菌起着生长促进作用。2.摄入益生元。通常所指的益生元为具 有使双歧杆菌增殖作用的低聚糖，主要有异麦芽低聚糖、低聚果糖、低聚半乳糖、大豆低聚 糖、棉子糖混合乳蔗糖、低聚木糖等等，近年来研究表明植物浸出汁也具有显著促双歧杆菌 和乳酸菌生长的作用。因此调节肠道内微生态菌群可以通过摄入有益菌和益生元等方式进 行。
[0004] 枯草芽孢杆菌通过与有害菌竞争消化道上皮的附着位点、产生抑菌物质、与有害 菌竞争营养物质、生物夺氧等机制从而有利于建立消化道正常的微生物区系；调节、提高免 疫功能;提高消化吸收功能;防止毒性胺的合成。专利CN1296059C中提出草分枝杆菌具有促 进吸收和提高免疫力的功效，专利CN103555630 B又提出草分枝杆菌的草分枝杆菌的近邻 戈登氏菌具有提高机体免疫和调节肠道功能，专利CN104013649 A提出地衣芽胞杆菌合生 元对肠道疾病具有快速治疗的作用。植物浸提物对双歧杆菌、乳酸菌和草分枝杆菌生长具 有促进作用，原料广泛，取材方便，因此开发一种以草分枝杆菌和植物浸提物构成的在厌氧 条件下促肠道内益生菌生长的合生元具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种枯草芽胞杆菌合生元组合制剂的制备方法及合生元 组合制剂的应用。
[0006] 本发明的目的是通过如下途径实现的：一种枯草芽胞杆菌合生元组合制剂的制备 方法，其制备步骤如下： A.枯草芽孢杆菌的制备： 将枯草芽孢杆菌用LB培养基活化，活化条件为:28-32°C，150-180rpm振荡培养，18-22 小时后，转接到种子罐。种子罐培养基按重量百分比为：葡萄糖0.2%，氯化钠0.5%，酵母膏 0.5%，蛋白胨1%，余量为水，pH7.2-7.3，28-32 °C，通气量1:0.8，至芽孢率达90%以上时停止 发酵。以10%接种进行固体发酵，发酵培养基按重量百分比为:红参粉2.5%，丹参粉2.5%，玉 米粉1 〇%，黄豆饼粉1 〇%，麸皮75%，混合均匀；再加纯水至含水率50%，托盘发酵；1 -10小时静 止发酵，10-20小时适当通风翻曲，控温30-32Γ，至芽孢率达到90%以上，得枯草芽孢杆菌 体； B. 灭活草分枝杆菌发酵物的制备： a. 种子，种子培养基成分为：纯水中含鹿糖2〇-25g/L，蛋白胨2.5-3g/L，朽1檬酸钠20-25g/L，磷酸二氢钾 1 · 0-1 · 5g/L，磷酸氢二钠 1 · 5-2 · Og/L，琼脂 15-20g/L，pH7 · 0-7 · 2;接种， 30 ± 1°C培养48小时，镜检无杂菌且生长健壮； b. 种子罐培养，培养基成分为:纯水中含鹿糖2〇-25g/L，蛋白胨2.0-2.5g/L，朽1檬酸钠 15-22g/L，磷酸二氢钾 1.0-1.5g/L，磷酸氢二钠 1.5-2. Og/L，PH7.0-7.2 ;;接种，自动添加 消泡剂，通气量1:0.6-0.8g/L，30 ± 1°C培养32-36小时，镜检无杂菌且生长健壮； c. 发酵罐培养，培养基成分为：纯水中含蔗糖15-20g/L，蛋白胨1.5-2. Og/L，黄芪浸膏 15g/L，柠檬酸钠 15-20g/L，磷酸二氢钾 1.0-1.5g/L，磷酸氢二钠 1.5-2. Og/L，PH7.0-7.2 ; 接种，自动添加消泡剂，通气量1: 〇. 8，30 ± 1°C培养48-52小时，菌数达108-109个/mL停止发 酵； d. 发酵液喷雾浓缩干燥:150°C，干粉含水率不高于10%，得灭活草分枝杆菌发酵物； C. 将上述方法制得的枯草芽孢杆菌与灭活草分枝杆菌发酵物按照1-1.5:5-10充分混 合均匀，制得枯草芽胞杆菌合生元组合制剂。
[0007] 本发明所得的枯草芽胞杆菌合生元组合制剂作为动物饲料添加剂、免疫调节剂、 调节肠道药物的应用。
[0008] 本发明制得的一种枯草芽胞杆菌合生元组合制剂，在厌氧拟生环境中能够有效促 进肠道益生菌如双歧杆菌生长繁殖，并抑制肠道内有害微生物，在动物模型中能够调节动 物肠道内微生态环境，促进肠道绒毛增长，加深肠道沟壑，为肠道内双歧杆菌、乳酸菌等益 生菌提供更多抗冲击的生长空间，在肠道中数量与活性增加，从而达到调节肠道消化吸收 功能，提高免疫力的功效，可作为动物饲料添加剂或者肠道调节药物使用。
【具体实施方式】
[0009] 本发明一种枯草芽胞杆菌合生元组合制剂的制备方法，其制备步骤如下： A. 枯草芽孢杆菌的制备： 将枯草芽孢杆菌用LB培养基活化，活化条件为:28-32°C，150-180rpm振荡培养，18-22 小时后，转接到种子罐，种子罐培养基按重量百分比为：葡萄糖0.2%，氯化钠0.5%，酵母膏 0.5%，蛋白胨1%，余量为水，pH7.2-7.3，28-32 °C，通气量1:0.8，至芽孢率达90%以上时停止 发酵。以10%接种进行固体发酵，发酵培养基(干燥品）按重量百分比为:红参粉2.5%，丹参粉 2.5%，玉米粉10%，黄豆饼粉10%，麸皮75%，混合均匀，再加纯水至含水率50%，托盘发酵；1-10 小时静止发酵，10-20小时适当通风翻曲，控温30-32Γ，至芽孢率达到90%以上，得枯草芽孢 杆菌体； B. 灭活草分枝杆菌发酵物的制备： a.种子，种子培养基成分为：纯水中含鹿糖2〇-25g/L，蛋白胨2.5-3g/L，朽1檬酸钠20- 25g/L，磷酸二氢钾 1 · 0-1 · 5g/L，磷酸氢二钠 1 · 5-2 · Og/L，琼脂 15-20g/L，pH7 · 0-7 · 2g/L;接 种，30 ± 1°C培养48小时，镜检无杂菌且生长健壮； b. 种子罐培养，培养基成分为:纯水中含鹿糖2〇-25g/L，蛋白胨2.0-2.5g/L，朽1檬酸钠 15-22g/L，磷酸二氢钾1.0-1.5g/L，磷酸氢二钠1.5-2. Og/L，PH7.0-7.2;接种，自动添加消 泡剂，通气量1:0.6-0.8g/L，30 ± 1°C培养32-36小时，镜检无杂菌且生长健壮； c. 发酵罐培养，培养基成分为：纯水中含蔗糖15-20g/L，蛋白胨1.5-2. Og/L，黄芪浸膏 15g/L，柠檬酸钠 15-20g/L，磷酸二氢钾 1.0-1.5g/L，磷酸氢二钠 1.5-2. Og/L，PH7.0-7.2 ; 接种，自动添加消泡剂，通气量1: 〇. 8，30 ± 1°C培养48-52小时，菌数达108-109个/mL停止发 酵； d. 发酵液喷雾浓缩干燥:150°C，干粉含水率不高于10%，得灭活草分枝杆菌发酵物； C.将上述方法制得的枯草芽孢杆菌与灭活草分枝杆菌发酵物按照1-1.5:5-10充分混 合均匀，制得枯草芽胞杆菌合生元组合制剂。
[0010] 益生菌枯草芽孢杆菌1.1398(Bacillus subtilis 1.1398 )，来源于广东省微生 物种质资源库，菌种保藏编号为AS 1.1398;草分枝杆菌(Mycobacterium phlei, sq_l)， 来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.0 916。
[0011] 本发明的要点在于制备枯草芽胞杆菌合生元组合制剂。枯草芽孢杆菌可以占位性 保护肠道粘膜，草分枝杆菌能够产生多种营养元素具有提高机体免疫力之功效，植物浸提 物既可以促进草分枝杆菌生长，也可以促进肠道内双歧杆菌、乳酸菌等益生菌生长，抑制有 害微生物繁殖，从而调节肠道内微生态平衡，以此促进消化吸收。益生菌枯草芽孢杆菌 1.1398发酵物在厌氧拟生条件下对双歧杆菌的促生长作用。
[0012] 菌种:枯草芽胞杆菌1.1398,菌种保藏号为AS 1.1398。长型双歧杆菌。
[0013] 益生菌枯草芽孢杆菌1.1398发酵物制备过程如下：用LB培养基活化枯草芽孢杆菌 1.1398,活化条件为：28-32°C，150-180rpm振荡培养，18-22小时后。转接到种子罐，种子罐 培养基为:葡萄糖〇. 2%，氯化钠0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，pH7.2-7.3，28-32°C，通气量1: 0.8,至芽孢率达90%以上时停止发酵。以10%接种，进行固体发酵，发酵培养基(干燥品）为： 红参粉2.5%，丹参粉2.5%，玉米粉10%，黄豆饼粉10%，麸皮75%，混合均匀。再加纯水至含水率 50%，托盘发酵；1-10小时静止发酵，10-20小时适当通风翻曲，控温在30-32°C，至芽孢率达 到85%以上。
[0014] 长型双歧杆菌活化培养过程： 厌氧条件下，接种双歧杆菌到MRS培养基中，37°C厌氧培养24小时，镜检无杂菌且生长 健壮。
[0015] 益生菌枯草芽孢杆菌1.1398发酵物对双歧杆菌生长的影响:厌氧无菌条件下，分 别取益生菌枯草芽孢杆菌1.1398发酵物添加到MRS培养基中，终浓度分别为0.1，0.2，0.4， 0.6,0.8,1.0,1.5,2.0g/L。分别接种活化长型双歧杆菌，37 °C厌氧培养24小时，在厌氧条件 下利用平板菌落计数法测定菌浓度，见表1。
[0016] 表1益生菌枯草芽孢杆菌1.1398发酵物在厌氧拟生条件下对双歧杆菌生长的影 响（108 个/mL)
通过表1可以看出，在厌氧拟生条件下枯草芽孢杆菌1.1398发酵物对双歧杆菌生长与 促进作用，浓度为〇. 4-0.8g/L时效果最佳，双歧杆菌浓度值可以从MRS培养基中的5.29 X 1〇8 增加到12.65 X 108。
[0017] 实施例2 益生元灭活草分枝杆菌发酵物在拟生条件下对双歧杆菌的促生长作用。
[0018] 菌种：草分枝杆菌sq_l (Mycobacterium phlei，sq_l)，菌种保藏号为CGMCC N0. 0916;长型双歧杆菌。
[0019] 灭活草分枝杆菌发酵物益生元的制备： 在斜面上菌种复壮，培养基成分为g/L:蔗糖20~25，蛋白胨2.5~3，柠檬酸钠20-25，磷 酸二氢钾1 · 〇~1 · 5，磷酸氢二钠1 · 5~2 · 0，琼脂15~20，PH7 · 0~7 · 2; 30 ± 1°C培养48小时，镜检 无杂菌且生长健壮。进一步种子罐培养，培养基成分为g/L:蔗糖20~25，蛋白胨2.0~2.5，柠 檬酸钠15-22，磷酸二氢钾1.0~1.5，磷酸氢二钠1.5~2.0，PH7.0~7.2;接种，自动添加消泡 剂，通气量1 : 0.6-0.8,30±1°C培养32-36小时，镜检无杂菌且生长健壮。进一步发酵罐培 养发酵培养基成分为g/L:鹿糖15~20,植物浸提物适量，蛋白胨1.5~2.0,朽 1檬酸钠15-20，磷酸二氢钾1.0~1.5，磷酸氢二钠1.5~2.0，PH7.0~7.2(植物浸提物按照质量体积比为2 ~50 g : 1 L );接种，自动添加消泡剂，通气量1 : 0.8,30±1°C培养48~52小时，菌数达 108~109个/mL停止发酵。进一步上述发酵液于150°C喷雾干燥，干粉含水率不高于10%，即得 灭活草分枝杆菌益生元。
[0020] 双歧杆菌活化过程如实施例1。
[0021] 用不同种类不同浓度植物浸提物培养的草分枝杆菌发酵物对双歧杆菌生长的影 响过程:厌氧条件下，采用相同接种量把MRS培养基中活化的双歧杆菌接种到草分枝杆菌合 生元制剂中（含不同种类不同浓度植物浸提物或寡聚糖），37°C厌氧培养24小时，在厌氧条 件下利用平板菌落计数法测定菌浓度，见表2。
[0022] 表2益生元灭活草分枝杆菌发酵物在拟生条件下对双歧杆菌生长的影响（108个/ mL)
由表2可以看出，不同组别的草分枝杆菌合生元组合制剂都对双歧杆菌生长有促进作 用，促进效果有所差别。发酵培养基中添加红参粉5g/L，或者丹参浸膏40g/L，或者黄芪浸 膏15g/L时，同类物质中粗双歧杆菌生长效果最显著，其中以添加黄芪浸膏15g/L时效果最 佳。以上添加植物浸出物组促双歧杆菌生长效果均优于添加寡聚糖为聚葡萄糖、水苏糖、低 聚果糖和低聚木糖组别。
[0023] 实施例3 枯草芽胞杆菌合生元组合制剂在厌氧拟生环境中对肠道益生菌双歧杆菌生长的影响： 实施例1和实施例2得到的益生菌枯草芽孢杆菌1.1398发酵物和灭活草分枝杆菌发酵 物益生元按照5-10:1-1.5混合，充分搅拌均匀。
[0024]双歧杆菌活化过程如实施例1。
[0025]益生菌枯草芽孢杆菌1.1398发酵物和灭活草分枝杆菌发酵物益生元按照5-10:1-1.5混合，以0.6g/L加入至IjMRS培养基中，分别接种活化长型双歧杆菌，37 °C厌氧培养24小 时，在厌氧条件下利用平板菌落计数法测定菌浓度，见表3。
[0026]表3枯草芽胞杆菌合生元组合制剂在厌氧拟生条件下对双歧杆菌生长的影响 (108个如
从表3可以看出，枯草芽胞杆菌合生元组合制剂在厌氧拟生环境中对双歧杆菌有显著 促生长作用。益生菌枯草芽孢杆菌1.1398发酵物和灭活草分枝杆菌发酵物益生元按照不同 混合比例调配时，效果均高于单独原物质。
[0027] 实施例4 枯草芽胞杆菌合生元组合制剂在猪饲料添加剂中的应用，其步骤如下： 枯草芽胞杆菌合生元组合制剂制备如实施例3，混合比例为5:1。
[0028]实验动物:选择健康且日龄相近的体重平均8.8kg左右的三元杂交断奶仔猪96头， 随机分成两组，每组48头分6栏隔开，每组8头。A组，每组料（日料)基础口粮+抗生素全价料 中常用添加量。B组基础口粮+0.4%枯草芽胞杆菌合生元组合制剂。27天后喂养结果见表2。 [0029]表2枯草芽胞杆菌合生元组合制剂对仔猪肠道微生物菌群调节作用(个/mL)
表2说明与对照组相比，喂食抗生素组仔猪在盲肠和结肠内大肠杆菌数量明显降低，乳 酸杆菌量显著增加，喂食枯草芽胞杆菌合生元组合制剂的仔猪在结肠和盲肠内大肠杆菌降 低数量和乳酸杆菌提高数量更为显著，因此对肠道的微生态调节更为有利。
【主权项】
1. 一种枯草芽胞杆菌合生元组合制剂的制备方法，其特征在于:其制备步骤如下： A. 枯草芽孢杆菌的制备： 将枯草芽孢杆菌用LB培养基活化，活化条件为:28-32 °C，150-180rpm振荡培养，18-22 小时后;转接到种子罐，种子罐培养基按重量百分比为：葡萄糖0.2%，氯化钠0.5%，酵母膏 0.5%，蛋白胨1%，余量为水，pH7.2-7.3，28-32 °C，通气量1:0.8，至芽孢率达90%以上时停止 发酵；以10%接种，进行固体发酵，发酵培养基按重量百分比为:红参粉2.5%，丹参粉2.5%，玉 米粉1 〇%，黄豆饼粉1 〇%，麸皮75%，混合均匀；再加纯水至含水率50%;托盘发酵；1 -10小时静 止发酵，10-20小时适当通风翻曲，控温30-32Γ，至芽孢率达到90%以上，得枯草芽孢杆菌 体； B. 灭活草分枝杆菌发酵物的制备： a. 种子，种子培养基成分为：纯水中含鹿糖2〇-25g/L，蛋白胨2.5-3g/L，朽1檬酸钠20-25g/L，磷酸二氢钾 1 · 0-1 · 5g/L，磷酸氢二钠 1 · 5-2 · Og/L，琼脂 15-20g/L，pH7 · 0-7 · 2;接种， 30 ± 1°C培养48小时，镜检无杂菌且生长健壮； b. 种子罐培养，培养基成分为:纯水中含鹿糖2〇-25g/L，蛋白胨2.0-2.5g/L，朽1檬酸钠 15-22g/L，磷酸二氢钾1.0-1.5g/L，磷酸氢二钠1.5-2. Og/L，PH7.0-7.2;接种，自动添加消 泡剂，通气量1:0.6-0.8g/L，30 ± 1°C培养32-36小时，镜检无杂菌且生长健壮； c. 发酵罐培养，培养基成分为：纯水中含蔗糖15-20g/L，蛋白胨1.5-2. Og/L，黄芪浸膏 15g/L，柠檬酸钠 15-20g/L，磷酸二氢钾 1.0-1.5g/L，磷酸氢二钠 1.5-2. Og/L，PH7.0-7.2 ; 接种，自动添加消泡剂，通气量1: 〇. 8，30 ± 1°C培养48-52小时，菌数达108-109个/mL停止发 酵； d. 发酵液喷雾浓缩干燥:150°C，干粉含水率不高于10%，得灭活草分枝杆菌发酵物； C. 将上述方法制得的枯草芽孢杆菌与灭活草分枝杆菌发酵物按照1-1.5:5-10充分混 合均匀，制得枯草芽胞杆菌合生元组合制剂。2. 如权利要求1所述的一种枯草芽胞杆菌合生元组合制剂的制备方法，其特征在于:所 得的枯草芽胞杆菌合生元组合制剂作为动物饲料添加剂的应用。3. 如权利要求1所述的一种枯草芽胞杆菌合生元组合制剂的制备方法，其特征在于:所 得的枯草芽胞杆菌合生元组合制剂作为免疫调节剂的应用。4. 如权利要求1所述的一种枯草芽胞杆菌合生元组合制剂的制备方法，其特征在于:所 得的枯草芽胞杆菌合生元组合制剂作为调节肠道药物的应用。
【文档编号】A61P37/02GK105831398SQ201511013471
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年12月31日
【发明人】刘艳丽, 张素琴, 许加娟, 张世敏, 黎明, 潘沼羽, 胡智鹏, 文少怀, 朱瑶, 叶维民, 贾艳林, 康汇然, 李林, 罗永祥, 康建南
【申请人】湖南圣雅凯生物科技有限公司