芦荟干细胞冻干粉及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明涉及一种芦荟干细胞冻干粉的制备方法，包括以下步骤：从芦荟中获取含有形成层的组织；将所述含有形成层的组织置于固体培养基中培养后，分离出芦荟干细胞；再将所述芦荟干细胞置于植物干细胞培养基中进行体外培养，获得扩增后的芦荟干细胞；所述扩增后的芦荟干细胞经冷冻破碎后浓缩，收获芦荟干细胞提取物；将所述芦荟干细胞提取物与甘露醇混合后，除菌、冻干后，收获芦荟干细胞冻干粉。通过从芦荟茎尖中提取芦荟干细胞，对芦荟干细胞进行放大培养后，提取芦荟干细胞提取物，之后进行冻干处理获得芦荟干细胞，通过该方法制备芦荟干细胞冻干粉周期较短，产率较高，冻干方法简单易行，提取效率较高，具有较高的使用价值。
【专利说明】
芦荟干细胞冻干粉及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种芦荟干细胞冻干粉及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 植物干细胞(plant stem cell)是未分化的细胞，具有很强的自我更新和持续分 裂能力。植物干细胞培养技术，是在传统组培技术的基础上，以植物干细胞为目标，诱导、分 离和培养外植体，建立相应的干细胞培养体系植物干细胞培养技术，不仅丰富了植物培养 技术，而且为天然产物的商业化生产，乃至植物生物技术的发展，提供了新的研究方向和契 机。
[0003] 芦荟是一种多年生的肉质草本植物，属百合科芦荟属，传统上作为泻药使用，近年 来，也在化妆品和食品行业中得到了广泛的应用。随着研究的深入，芦荟的抗氧化能力、抑 菌、消炎、抗肿瘤、免疫调节和辅助治疗糖尿病的作用也相继被报道出来。芦荟中的芦荟素 A、创伤激素和聚糖肽甘露等具有抗病毒感染、促进伤口愈合复原的作用，又可以消炎杀菌、 吸热消肿、软化皮肤、保持细胞活力，凝胶多糖与愈伤酸联合还具有愈合创伤活性的功效。 因此，提供一种能够快速制备活性成分含量较高且适合医用的芦荟干细胞制品十分必要。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种芦荟干细胞冻干粉及其制备方 法。
[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种芦荟干细胞冻干粉的制备方 法，包括以下步骤：
[0006] 从芦荟中获取含有形成层的组织；
[0007] 将所述含有形成层的组织置于固体培养基中培养后，分离出芦荟干细胞；
[0008] 再将所述芦荟干细胞置于植物干细胞培养基中进行体外培养，获得扩增后的芦荟 干细胞；
[0009] 所述扩增后的芦荟干细胞经冷冻破碎后浓缩，收获芦荟干细胞提取物；
[0010] 将所述芦荟干细胞提取物与甘露醇混合后，除菌、冻干后，收获芦荟干细胞冻干 粉。
[0011] 在本发明提供的芦荟干细胞冻干粉的制备方法中，所述冻干步骤之前，
[0012] 还需调整所述芦荟干细胞提取物中的蛋白质浓度至30~70μg/ml。
[0013] 在本发明提供的芦荟干细胞冻干粉的制备方法中，所述冻干条件为:温度_20°C ~-35°C，真空度50~200Pa，冻干时间为36~48小时。
[0014] 在本发明提供的芦荟干细胞冻干粉的制备方法中，所述冷冻破碎过程为:将所述 扩增后的芦荟干细胞放入-50~_100°C低温环境下冷冻2~3小时，然后取出解冻，重复3~5 次。
[0015] 在本发明提供的芦荟干细胞冻干粉的制备方法中，所述植物干细胞培养基包括无 机盐、维生素、氨基酸、生长素、糖类和琼脂。
[0016] 在本发明提供的芦荟干细胞冻干粉的制备方法中，所述固体培养基包括无机盐、 维生素、氨基酸、生长素、糖类和活性炭。
[0017] 在本发明提供的芦荟干细胞冻干粉的制备方法中，所述体外培养过程是在恒温培 养摇床中培养7~14天后，再转移至生物反应器中进行大规模培养。
[0018] 在本发明提供的芦荟干细胞冻干粉的制备方法中，所述体外培养的条件为温度为 30°C~37°C，每小时光照5~lOmin。
[0019] 本发明进一步保护上述芦荟干细胞冻干粉的制备方法所获得的芦荟干细胞冻干 粉。
[0020] 本发明进一步保护上述芦荟干细胞冻干粉在制备食品、药品、保健品或化妆品中 的应用。
[0021] 实施本发明提供的芦荟干细胞提取物及其的制备方法，可以达到以下有益效果： 通过从芦荟茎尖中提取芦荟干细胞，对芦荟干细胞进行放大培养后，提取芦荟干细胞提取 物，之后进行冻干处理获得芦荟干细胞，通过该方法制备芦荟干细胞冻干粉周期较短，产率 较高，冻干方法简单易行，提取效率较高，且冻干粉中所含有的芦荟活性成分较高，特别是 芦荟苷，具有较高的医学使用价值。
【具体实施方式】
[0022] 本发明提供的芦荟干细胞冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
[0023] S1、从芦荟中获取含有形成层的组织；
[0024] S2、将步骤S1中获得的含有形成层的组织置于固体培养基中进行培养后，分离出 芦荟干细胞；
[0025] S3、将步骤S2中获得的芦荟干细胞置于植物干细胞培养基中进行体外培养，获得 扩增后的芦荟干细胞；
[0026] 其中，所述植物干细胞培养基包括无机盐、维生素、氨基酸、生长素、糖类和琼脂。 其中，无机盐包括<&(：1 2、1(11屮〇4、謂03、]\%3〇4、順4勵3、(：113〇4*511 20等;糖类为蔗糖或乳糖等； 优选地，植物干细胞培养基中，生长素的浓度为0.5~1.5mg/L、蔗糖或乳糖的质量分数为2 ~5 %，琼脂的浓度为5.5~7.5g/L;植物干细胞培养基为MS培养基。
[0027] S4、步骤S3获得的扩增后芦荟干细胞经冷冻破碎后浓缩，收获芦荟干细胞提取物；
[0028] S5、将步骤S4中获得的芦荟干细胞提取物与甘露醇混合后，除菌，冻干，即获得芦 荟干细胞冻干粉。
[0029] 步骤S1中，由于芦荟茎尖中含有大量的具有自我更新能力又能产生具有持续分裂 能力的干细胞，因此，本发明中优先采用从芦荟茎尖中获取芦荟干细胞。含有形成层的组织 的获取过程，包括以下步骤：
[0030] 取芦荟茎尖，冲洗15~20分钟，酒精消毒，再用升汞液消毒10~20分钟后，无菌水 冲洗数次，剥离获取形成层的组织。
[0031] 步骤S2中，固体培养基包括无机盐、维生素、氨基酸、生长素、糖类和活性炭;其中， 无机盐包括:〇&(：12、10^〇4、謂0 3、]\%3〇4、顺4勵3、〇13〇4.51120等;糖类为蔗糖或乳糖等。优选 地，固体培养基为MS培养基;且生长素的浓度为0.5~1.5mg/L、蔗糖或乳糖的质量分数为2 ~5 % ;更为优选地，固体培养基中还包括萘乙酸和苄氨基腺嘌呤，萘乙酸的浓度为0.5~ 1.5mg/L，苄氨基腺嘌呤的浓度为0.5~1.5mg/L。
[0032] 进一步地，该步骤中，将含有形成层的组织置于固体培养基中进行培养的条件为： 培养温度为23~29 °C，光照10~12小时，光照强度1500~20001x，PH值为5.6~5.9,培养7~ 14天。
[0033] 进一步地，含有形成层的组织经固体培养基培养培养后获得生长良好的形成层干 细胞团，还需要采用酶解法分离出芦荟干细胞。本发明优先采用质量分数为0.2-0.3%纤维 素酶溶液和质量分数为0.2-0.3%果胶酶溶液对形成层干细胞团进行酶解8~12小时。
[0034] 步骤S3中，体外培养芦荟干细胞的过程是在恒温培养摇床中进行的，摇床转速为 100转/分钟~120转/分钟，温度为30°C~37°C，每小时光照5~lOmin，培养时间为7天~14 天后，得到单细胞悬液。然后将单细胞悬液转移至生物反应器进行大规模培养，在生物反应 器中培养第4~7天时，加入新鲜的植物干细胞培养基，继续培养后收获扩增后的芦荟干细 胞。
[0035] 步骤S4中，将步骤S3中获得的扩增后的芦荟干细胞放入-50~-100°C低温环境下 冷冻2~3小时，然后取出解冻，重复3~5次，最后一次解冻后用超声波破碎仪破碎细胞，收 集滤液，真空蒸发浓度，即获得芦荟干细胞提取物。
[0036] 步骤S5中，在对芦荟干细胞提取物进行冻干之前，还需要调整芦荟干细胞提取物 中的蛋白质浓度，使得蛋白质浓度为30~70μg/ml，降低蛋白质浓度。
[0037] 进一步地，甘露醇在芦荟干细胞提取物中的质量分数为4~6 %，芦荟干细胞提取 物的冻干条件为:温度_20°C~_35°C，真空度50~200Pa，冻干时间为36~48小时。
[0038] 本发明进一步保护上述方法所获得的芦荟干细胞冻干粉在制备食品、药品、保健 品或化妆品中的应用。
[0039]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限 定本发明。
[0040] 实施例1
[0041 ]本实施例中，芦荟干细胞冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
[0042] S1、从芦荟中获取含有形成层的组织；
[0043]选择无化肥农药污染、绿色有机种植的芦荟，并选取生长状况较佳的芦荟茎尖，用 无菌水冲洗芦荟茎尖表面附着物15~20分钟，再用75%的酒精进行表面消毒30秒，然后，用 〇. 1 %的升汞液消毒10~20分钟，最后用无菌水反复冲洗5次，洗去植物表面的升汞残液;将 灭菌后的芦荟茎尖切成5_X 5_大小，用接种刀剥离出含有形成层的组织。
[0044] S2、将含有形成层的组织置于固体培养基中进行培养，分离出芦荟干细胞；
[0045] 将步骤S1中剥离出的含有形成层的组织接种至固体培养基中，以每lg组织接种 5cm2固体培养基的密度进行接种，培养后，形成层组织为均一生长的平板状组织，而其他组 织则为不规则的聚集生长物；将再生的形成层组织与其他组织分离开，以每lg组织接种 5cm 2固体培养基的密度，将再生的形成层组织接种至新鲜的固体培养基中进行培养。其中， 固体培养基中还含有浓度为1 .Omg/L的萘乙酸和浓度为1 .Omg/L的苄氨基腺嘌呤，且固体培 养基为MS培养基，含有浓度为232mg/L的CaCl2、140mg/L的KH2P〇4、1642mg/L的KN0 3、 130.54mg/L的MgS〇4、1560mg/L的NH4N03、0.021mg/L的CuS〇4 ? 5H20、60mg/L的维生素C、、2mg/ L的甘氨酸、1. Omg/L的生长素、质量分数为3 %的蔗糖和活性炭;培养条件为:温度26 °C，光 照11小时，光照强度为18001x，PH值为5.6~5.9，培养14天；即可收获形成层组织来源的芦 荟干细胞团；用质量分数为〇. 25%的果胶酶溶液和质量分数为0.25%的纤维素酶对芦荟干 细胞团进行酶解12小时，分离出芦荟干细胞。
[0046] S3、将芦荟干细胞置于植物干细胞培养基中进行体外培养；
[0047] 将步骤S2中酶解后的芦荟干细胞转移至植物干细胞培养液中，并置于恒温培养摇 床上培养。
[0048]其中，植物干细胞培养液为MS培养基，其中含有浓度为372mg/L的CaCl2、181mg/L 的KH2PO4、1790mg/L的KN〇3、173.54mg/L的MgSCk、1840mg/L的NH4N〇3、0.022mg/L的CuS〇4 ? 5H2〇、60mg/L的维生素C、1 ? 58mg/L的甘氨酸、1 ? 5mg/L的生长素、质量分数为3%的鹿糖和浓 度为6. Og/L的琼脂等添加物;摇床的转速为110转/分钟，培养温度为34°C，每小时光照8分 钟，培养第7天，加入新鲜的植物干细胞培养液至细胞密度为IX 107个/ml，然后继续培养， 培养后用100目的不锈钢筛网过滤，除去细胞团、残渣等，得到芦荟干细胞悬液；
[0049]然后，将芦荟干细胞悬液转移至20L生物反应器中进行大规模培养，生物反应器中 添加有5L的植物干细胞培养基，培养第7天时，加入10L的新鲜培养基，继续培养后收获细 胞。对照组培养在生物反应器中持续培养20天，中间不添加培养基。培养后收获细胞，称重。
[0052]步骤S4、芦荟干细胞提取物的制备；
[0053] 收集步骤S3中获得芦荟干细胞悬液，用lum过滤器过滤，去掉培养基，收获截留的 细胞;并将细胞放入-80 °C的超低温冷冻2小时，然后取出解冻30分钟，重复上述操作5次，最 后一次室温解冻后，用超声波破碎仪破碎细胞，过滤器过滤后，搜集滤液，于旋转式真空蒸 发器内浓缩，即可获得芦荟干细胞提取物。
[0054] S5、芦荟干细胞冻干粉的制备；
[0055] 采用BCA法对步骤S4中获得的芦荟干细胞提取物进行蛋白质浓度测定，根据该蛋 白质浓度，加入无菌蒸馏水调节至蛋白终浓度为50.0 ± 0.5iig/ml;再加入甘露醇，使得甘露 醇在芦荟干细胞提取物中的质量分数为5%，然后，进行灭菌和冻干处理，冻干的温度为-30 °C，真空度为150Pa，冻干时间为48小时，即可得到芦荟干细胞冻干粉。
[0056] S6、芦荟干细胞冻干粉质量鉴定；
[0057] 采用HPLC法测定芦荟干细胞冻干粉中芦荟苷的含量
[0058] 色谱条件色谱柱：1^(：111'〇8口61^18(25〇1]1111\4.61]1111，5_)流动相：乙腈-水（25:75); 流速：1 ? OmL ? min-1;柱温:25 °C ;检测波长:355nm;进样量：10LL。
[0059] 将芦荟冻干粉，以75%乙醇提取3次，合并提取液经旋转蒸发、冷冻干燥后，以蒸馏 水溶解后，采用HPLC法测定多酚含量：
[0060] 芦荟干细胞冻干粉中，芦荟苷的含量为150.80mg/g;而直接从芦荟萃取液中，芦荟 苷的含量仅为32.35mg/g;由此可知，通过本发明提供的方法所获得的芦荟干细胞冻干粉 中，芦荟苷的含量显著增加。
[0061] 以上对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方 式，上述的【具体实施方式】仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发 明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这 些均属于本发明的保护之内。
【主权项】
1. 一种芦荟干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 从芦荟中获取含有形成层的组织； 将所述含有形成层的组织置于固体培养基中培养后，分离出芦荟干细胞； 再将所述芦荟干细胞置于植物干细胞培养基中进行体外培养，获得扩增后的芦荟干细 胞； 所述扩增后的芦荟干细胞经冷冻破碎后浓缩，收获芦荟干细胞提取物； 将所述芦荟干细胞提取物与甘露醇混合后，除菌、冻干后，收获芦荟干细胞冻干粉。2. 根据权利要求1所述的芦荟干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于，所述冻干步骤之 前，还需调整所述芦荟干细胞提取物中的蛋白质浓度至30~70μg/ml。3. 根据权利要求2所述的芦荟干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于，所述冻干条件 为:温度_20°C~_35°C，真空度50~200Pa，冻干时间为36~48小时。4. 根据权利要求3所述的芦荟干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于，所述冷冻破碎过 程为:将所述扩增后的芦荟干细胞放入-50~_100°C低温环境下冷冻2~3小时，然后取出解 冻，重复3~5次。5. 根据权利要求1所述的芦荟干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于，所述植物干细胞 培养基包括无机盐、维生素、氨基酸、生长素、糖类和琼脂。6. 根据权利要求1所述的芦荟干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于，所述固体培养基 包括无机盐、维生素、氨基酸、生长素、糖类和活性炭。7. 根据权利要求1所述的芦荟干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于，所述体外培养过 程是在恒温培养摇床中培养7~14天后，再转移至生物反应器中进行大规模培养。8. 根据权利要求7所述的芦荟干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于，所述体外培养的 条件为温度为30°C~37°C，每小时光照5~lOmin。9. 一种根据权利要求1~8任一项所述的芦荟干细胞冻干粉的制备方法所获得的芦荟 干细胞冻干粉。10. 根据权利要求9所述的芦荟干细胞冻干粉在制备食品、药品、保健品或化妆品中的 应用。
【文档编号】A61K36/886GK105852125SQ201610268493
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】曾宪卓, 张哲
【申请人】深圳爱生再生医学科技有限公司