竹荪提取液、发酵胞外液和发酵胞内液的制备方法及其应用
【专利摘要】本发明属于菌类提取技术领域，涉及一种竹荪提取液、发酵胞外液和发酵胞内液的制备方法及其应用。制备方法包括步骤A、取竹荪的菌盖和/或菌托，热风烘干至恒重，粉碎过筛，得到待提粉末，密封保存，B、将待提粉末和乙醇水溶液混合，在60?80℃的恒温下浸提1.5?3.5hr，C、过滤，取清液，即为竹荪提取液；还包括在抑制食品腐败菌中的应用。本发明实现了变废为宝，竹荪的附加值便大大提高，同时也避免了对环境造成的污染。
【专利说明】
竹荪提取液、发酵胞外液和发酵胞内液的制备方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于菌类提取技术领域，涉及一种竹荪提取液、发酵胞外液和发酵胞内液 的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 竹苏为担子菌亚门（Basidiomycotina)鬼笔科（Phallaceae)竹苏属 (Dictyophora)的统称，民间把其常比喻为带有面纱的曼妙女郎、真菌中的宠妻皇后、真菌 中的花之仙子。竹荪分布极其广泛，遍布美洲、非洲、亚洲、欧洲等地。竹荪子实体在组成上 分为4部分，分别为遍布网络的菌盖，海绵状的菌裙、状如碗形的菌柄以及遍布外周的菌托， 多数高为l〇cm-20cm。菌盖呈钟形，高约3cm，宽2cm_5cm，上面覆有孢体，暗绿色、光滑、透明、 粘稠，顶端平整，有孔口存在。菌裙白色，在菌盖边沿呈下垂状，宛如婀娜少女的纱裙，其中 竹荪裙子长短因菌种差异存在区别。菌柄呈现白色，中空，酷似纺缍形，直径约为3cm。菌托 围绕于菌柄四周，高约5cm，粗约4cm，3个组成部分：内膜、膜间胶质和外膜内外依次分布
[3] 。据统计，全世界竹荪种类大约为12种，其中在我国发现了 7种，具体种类和分布地区如 下：皱盖竹苏（Dictyophora me rulina)在广东、海南可见；棘托竹苏（Dictyophora echinovlvata)在四川、贵州等地多见。
[0003] 市场上销售的竹荪只是竹荪的可食部分菌裙和菌柄，而菌盖和菌托在采收加工时 常被作为废弃部分，不仅是资源浪费，更造成对环境的污染。研究表明：竹荪菌托和菌盖两 部分的鲜重占子实体总量60%，可见，变废为宝已经变成了提高竹荪附加值的一种有效途 径。
[0004] 目前对于菌盖菌托的研究进展如下:檀东飞等采用水蒸汽蒸馏法和石油醚冷浸提 获得棘托竹荪菌盖和菌托的挥发油和石油醚浸提物，通过HP-5MS柱分离和质谱解析，得到 主要成分，发现菌盖石油醚提取物与挥发油存在21种相同成分，菌托中有35种成分初次从 竹荪属中检测到，抑菌试验表明两个部位的挥发油对供试菌种霉菌、细菌以及酵母菌均存 在较强的抑制能力；熊彬等研究了长裙竹荪托盖液剂量差异对大鼠免疫功能方面的的增免 作用，经过一定处理后采血测免疫指标，解剖后取胸腺、脾脏进行指数测定，发现辐射损伤 大鼠胸腺、脾脏指数相对于对照组显著增加，存在明显扩张作用，两类剂量药物:大剂量与 小剂量对Π -2和NK两种细胞表现出来的激活效应更优;黎璐等研究了长裙竹荪鲜品的菌 盖、子实体和菌托石油醚提取物，通过气质分析对3部分的石油醚提取物的成分做了比较， 共检出69种成分，其中菌盖、子实体、菌托分别检测出了 36、46、31种成分，脂肪酸占检出总 量依次为86.15%、84.03%、86.42%，不饱和脂肪酸与脂肪酸总检出量比值则为56.00%、 65.79%、63.40% ;赵凯等把红托竹荪菌托提取的粗多糖与菌丝体和除去子实体的其他部 位进行了对比，发现菌托部位最高，粗多糖经过进一步分离纯化和结构分析并进行体外试 验，得出多糖的组分DRVP1是β-型甘露糖苷，这种组分对小鼠 S180肉瘤存在一定程度的抑制 效果;郭渝南等进行了长裙竹荪托盖液修复大鼠免疫损伤的实验，发现竹荪托盖液对最敏 感的具备免疫活性C细胞具有修复辐射损伤作用，提高C淋巴细胞数量和生长因子指数，激 活免疫调节细胞(DE)，推测出免疫作用的增强是多糖与微量元素共同作用的结果;吴雪艳 等采用Box-Benhnken响应面法对竹荪菌托多糖的提取工艺进行优化实验，获得多糖最佳浸 提工艺:提取温度82 °C、液料比62: lmL. g'提取时间lh、提取1次，提取率达13.016 % ;庄永 亮等对长裙竹荪的菌盖多糖进行提取，评价了其抗氧化能力，发现菌盖多糖还原能力和和 羟基自由基抑制能力较强，对于超氧阴离子抑制能力表现较弱。
[0005] 但现有的研究未对涉及到对竹荪的菌盖和/或菌托的提取、发酵胞外液、发酵胞内 液的制备及其应用，尤其是没有应用于食品防腐中。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种基于竹荪的废弃物的竹荪提取液 的制备方法。
[0007] 本发明的另一目的是提供一种基于竹荪的废弃物的竹荪发酵胞外液的制备方法。
[0008] 本发明的再一目的是提供一种基于竹荪的废弃物的竹荪发酵胞内液的制备方法。
[0009] 本发明还有一个目的是提供竹荪提取液在抑制食品腐败菌中的应用。
[0010] 本发明还有一个目的是提供竹荪发酵胞外液在抑制食品腐败菌中的应用。
[0011] 本发明还有一个目的是提供竹荪发酵胞内液在抑制食品腐败菌中的应用。
[0012] 为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案:一种竹荪提取液的制备方法，包括 以下步骤：
[0013] A、取竹荪的菌盖和/或菌托，热风烘干至恒重，粉碎过筛，得到待提粉末，密封保 存，
[0014] B、将待提粉末和乙醇水溶液混合，在60-80 °C的恒温下浸提1.5-3.5hr，
[0015] C、过滤，取清液，即为竹苏提取液。
[0016] 在上述的竹荪提取液的制备方法中，包括以下步骤：
[0017] A、取竹荪的菌盖和/或菌托，60°C热风烘干至恒重，粉碎过80目筛，得到待提粉末， 密封保存，
[0018] B、将待提粉末和浓度为60-95%乙醇水溶液以1:10-30的料液比，在60-80°C的提 取温度下浸提1.5-3.5hr，
[0019] C、过滤，取清液，即为竹苏提取液。
[0020] 在上述的竹荪提取液的制备方法中，所述的乙醇水溶液的浓度为90%，所述的料 液比为1:20,所述的浸提温度为75°C，所述的浸提时间为2hr。
[0021] -种竹荪发酵胞外液的制备方法，包括以下步骤：
[0022] A、菌种活化
[0023]将竹荪的菌盖和/或菌托接种于斜面培养基，24°C恒温培养，进行活化，
[0024] B、准备菌丝
[0025] 把活化后的竹荪菌种接种于TOA平板上，待长出孢子后用无菌水洗下分生孢子，制 备成106-108个.ml/ 1的孢子悬液，把孢子悬液与冷却至45-50°C的PDA培养基混合均匀，倒于 各个培养皿中，待菌丝长满后低温保存待用，
[0026] C、发酵
[0027]将长满菌丝的PDA培养基用无菌打孔器制成若干菌饼，将其接入液体TOA培养基， 于24°C、120r/min摇床培养10d，得发酵培养基，
[0028] D、发酵胞外液的制备
[0029] 发酵培养基低温离心取上清液，过滤，获得发酵胞外液。
[0030] 在上述的竹荪发酵胞外液的制备方法中，步骤D中，发酵培养基的离心温度为4°C， 离心速率为8000r/min，离心时间为lOmin。
[0031] -种竹荪发酵胞内液的制备方法，包括以下步骤：
[0032] A、菌种活化
[0033]将竹荪的菌盖和/或菌托接种于斜面培养基，24°C恒温培养，进行活化，
[0034] B、准备菌丝
[0035] 把活化后的竹荪菌种接种于TOA平板上，待长出孢子后用无菌水洗下分生孢子，制 备成106-108个.ml/ 1的孢子悬液，把孢子悬液与冷却至45-50°C的roA培养基混合均匀，迅速 倒于各个培养皿中，待菌丝长满后低温保存待用，
[0036] C、发酵
[0037]将长满菌丝的PDA培养基用无菌打孔器制成若干菌饼，将其接入液体TOA培养基， 于24°C、120r/min摇床培养10d，得发酵培养基，
[0038] D、发酵胞内液的制备
[0039] 发酵培养基低温离心，取离心后的沉淀用蒸馏水反复洗涤3次，收集菌丝体，菌丝 体加蒸馏水经过超声细胞破碎后，再加入无水乙醇，置于80°C水浴锅中水浴2h，过滤除菌， 即为发酵胞内液。
[0040] 在上述的竹荪发酵胞外液的制备方法中，步骤D中，所述的步骤D中，发酵培养基的 离心温度为4°C，离心速率为8000r/min，离心时间为lOmin。
[0041] 根据上述的制备方法制备的竹荪提取液在抑制食品腐败菌中的应用。
[0042]根据上述的制备方法制备的竹荪发酵胞外液在抑制食品腐败菌中的应用。
[0043]根据上述的制备方法制备的竹荪发酵胞内液在抑制食品腐败菌中的应用。
[0044] 与现有的技术相比，本发明的优点在于:把采摘时作为废弃物的竹荪菌盖和菌托 进行有效利用，实现了变废为宝，竹荪的附加值便大大提高，同时也避免了对环境造成的污 染;竹荪提取液、竹荪发酵胞外液和竹荪发酵胞内液均具有明显的抑菌作用，可用于食品防 腐，提供了一种天然的防腐剂，为食品安全提供了一种创新思路和方法。
【具体实施方式】
[0045] 下述实施例中所用的试剂，如无特殊说明，可以从常规生化试剂商店购买得到。以 下实施例中的定量数据，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0046] 实施例1
[0047] -种竹荪提取液的制备方法，包括以下步骤:A、取竹荪的菌盖和/或菌托，100 °C以 下用鼓风机热风烘干至恒重，粉碎过筛，得到待提粉末，密封保存，B、将待提粉末和乙醇水 溶液混合，在60-80°C的恒温下浸提1.5-3.5hr，C、过滤，取清液，即为竹荪提取液。
[0048] 实施例2
[0049] -种竹荪提取液的制备方法，包括以下步骤:A、取竹荪的菌盖和/或菌托，60 °C热 风烘干至恒重，粉碎过80目筛，得到待提粉末，密封保存，B、将待提粉末和浓度为60-95 %乙 醇水溶液以1:10-30的料液比，在60-80°C的提取温度下浸提1.5-3.5hr，C、过滤，取清液，即 为竹荪提取液。
[0050]不同提取液抑菌活性测定
[0051 ] (1)牛津杯法：吸取0.2mL供试细菌悬液在LB平板上进行涂布，37 °C培养18-24h， 0.2mL啤酒酵母悬浮液在PDA平板上进行涂布，30°C培养48h，采用祖若夫等的牛津杯法测定 抑菌圈，按照下述公式计算其抑菌率，重复三次。
[0052] 抑菌圈直径(mm)=处理组的抑菌圈直径-对照组的抑菌圈直径。
[0053] (2)分光光度法:每个小锥形瓶里放入体积为10mL的LB或者PDA液体培养基，于121 °C下灭菌20min，吸取0.2mL菌悬液分别加人带有0.2mL提取液的液体培养基与对照培养基 中，细菌置于37°C，啤酒酵母置于28°C下的120r/min恒温振荡培养箱里培养20h，于560nm下 测定其培养液的吸光值，按照下述公式测定其抑菌率。
[0054] 抑制率（％ )=(对照菌液0D值一处理菌液0D值)/(对照菌液0D值）X 100%。
[0055] 乙醇浓度分别为60%、70%、80%与90%时，抑菌圈直径显著增加（？〈0.05)，而乙 醇浓度分别为90%、100%时，抑菌圈直径增加不显著，因此确定90%乙醇水溶液为竹荪提 取溶剂。
[0056] PDA固体培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g。马铃薯去皮切成小块煮约 30min，用4层纱布过滤，添加葡萄糖、琼脂，定容至1000mL，pH自然。
[0057] PDA液体培养基:与PDA固体培养基同，只是不添加琼脂。
[0058] LB固体培养基:胰化蛋白胨10g，酵母提取物58爲(311(^，最终定容至100〇1111^咱 然。
[0059] LB液体培养基:与LB固体培养基同，只是不添加琼脂。
[0060] 培养基均经高压蒸汽灭菌（121°C、20min)备用。
[0061] 经过检测，得到以下结论：
[0062] 随着乙醇浓度加大，抑菌效果不断增强，乙醇浓度分别为60%、70%、80%与90% 时，抑菌圈直径显著增加(P〈〇. 05)，而乙醇浓度分别为90%、100%时，抑菌圈直径增加不显 著，因此确定90%乙醇水溶液为提取溶剂；
[0063]随着料液比的增加，浸提液的抑菌效果不断上升，料液比从1:10g. ml/1增加到1: lSg.mL-1，从1 JOg.mL-1增加到1JOg.mL-1，抑菌圈直径增加均不显著，而料液比 从mSg.ml/ 1增加至IjlJOg.ml/1，抑菌圈直径表现为显著增加(P〈0.05)，因此料液比被确定 为l:20g.mL-、
[0064] 随着浸提时间增加，提取液的抑菌效果表现为不断上升，提取时间从1.5h增加到 2. Oh，从2.5h增加到3.0h、3.5h，抑菌圈直径增加均不显著，而提取时间从2. Oh增加到2.5h， 抑菌圈直径显著增加(P〈0.05)，因此确定提取时间为2.5h。
[0065] 随着浸提温度的升高，提取液的抑菌效果不断上升，提取温度从60°C增加到65°C、 70°C，抑菌圈直径显著增加(P〈0.05)，而提取温度从70°C增加到75°C、80°C，抑菌圈直径增 加均不显著，因此确定提取温度为70°C。
[0066]由此，确定最佳的提取条件：乙醇水溶液的浓度为90%，料液比为1:20,浸提温度 为75°C，浸提时间为2hr。
[0067] 实施例3-4
[0068] 本实施例与实施例2的制备方法基本相同，不同之处在于，实施例3的步骤A中单独 取竹荪的菌盖进行热风烘干，实施例4的步骤A中单独取竹荪的菌托进行热风烘干。
[0069] 实施例5
[0070] -种竹荪发酵胞外液的制备方法，包括以下步骤:A、菌种活化，将竹荪的菌盖和/ 或菌托接种于斜面培养基，本领域技术人员应当理解，竹荪的菌盖、菌托可以单独接种，也 可以合并接种，24°C恒温培养，进行活化，B、准备菌丝，把活化后的竹荪菌种接种于PDA平板 上，待长出孢子后用无菌水洗下分生孢子，制备成1〇 6-1〇8个.ml/1的孢子悬液，把孢子悬液 与冷却至45-50°C的固体或液体PDA培养基混合均匀，倒于各个培养皿中，待菌丝长满后低 温保存待用，C、发酵，将长满菌丝的PDA培养基用无菌打孔器制成若干菌饼，将其接入液体 PDA培养基，于24°C、120r/min摇床培养10d，得发酵培养基，D、发酵胞外液的制备，发酵培养 基低温离心取上清液，过滤，获得发酵胞外液。
[0071] 优选方案，步骤D中，发酵培养基的离心温度为4°C，离心速率为8000r/min，离心时 间为lOmin。本领域技术人员应当理解，发酵胞外液可进行浓缩也可不浓缩，浓缩后的浓度 变大，在作为防腐剂时添加量可适量减少。
[0072] 本实施例对5种食品腐败菌:大肠杆菌、金黄色葡萄杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢 杆菌、啤酒酵母进行了抑菌测试，抑菌率分别为70.5%、100%、100%、100%、18.5%。
[0073] 热稳定好坏常作为食品防腐剂应用的重要指标之一，发酵胞外液经过一定的热处 理（121°C高压灭菌20min)后对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性影响不显著（P> 〇. 05 )，说明发酵胞外液具有良好的热稳定性。
[0074] 实施例6
[0075] -种竹荪发酵胞内液的制备方法，包括以下步骤:A、菌种活化，将竹荪的菌盖和/ 或菌托接种于斜面培养基，24 °C恒温培养，进行活化，B、准备菌丝，把活化后的竹荪菌种接 种于PDA平板上，待长出孢子后用无菌水洗下分生孢子，制备成10 6-108个.ml/1的孢子悬液， 把孢子悬液与冷却至45-50°C的PDA培养基混合均匀，迅速倒于各个培养皿中，待菌丝长满 后低温保存待用，C、发酵，将长满菌丝的PDA培养基用无菌打孔器制成若干菌饼，将其接入 液体PDA培养基，于24°C、120r/min摇床培养10d，得发酵培养基，D、发酵胞内液的制备，发酵 培养基低温离心，取离心后的沉淀用蒸馏水反复洗涤3次，收集菌丝体，菌丝体加蒸馏水经 过超声细胞破碎后，再加入无水乙醇，置于80°C水浴锅中水浴2h，过滤除菌，即为发酵胞内 液。
[0076] 优选方案，步骤D中，所述的步骤D中，发酵培养基的离心温度为4°C，离心速率为 8000r/min，离心时间为lOmin。本领域技术人员应当理解，发酵胞内液可进行浓缩也可不浓 缩，浓缩后的浓度变大，在作为防腐剂时添加量可适量减少。
[0077] 本实施例对5种食品腐败菌:大肠杆菌、金黄色葡萄杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢 杆菌、啤酒酵母进行了抑菌测试，抑菌率分别为16.5%、43%、44%、44%、-30%。
[0078] 热稳定好坏常作为食品防腐剂应用的重要指标之一，发酵胞外液经过一定的热处 理（121°C高压灭菌20min)后对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性影响不显著（P> 〇. 05 )，说明发酵胞内液具有良好的热稳定性。
[0079] 对比例1
[0080]本对比例与实施例2的制备方法基本相同，不同之处在于，本对比例的步骤A中单 独取竹荪的菌柄进行热风烘干，然后进行其余的步骤。
[0081 ] 对比例2
[0082]本对比例与实施例2的制备方法基本相同，不同之处在于，浸提用的溶液为水溶 液。抑菌实验结果表明：水提物对各供试菌均未显现出明显抑制作用，而醇取液对细菌抑制 作用明显，对酵母菌和霉菌表现较弱的抑制作用。
[0083] 应用例1
[0084]根据实施例2-4及对比例1制备的不同提取液对猪肉、豆腐、面条和米饭等代表性 食物的防腐作用见表：
[0087]相对于对照组，不同提取液对不同种类食物的防腐效果显著，实施例3和4的提取 液相比于其他两种提取液防腐效果较好，确定其提取液可以应用于实际生产和生活中。在 本应用例中，对比例1、实施例2、实施例3和实施例4中的提取液的加入量占食品重量的 1.5%，本领域技术人员应当理解，加入量还可以根据不同的食材情况进行具体调节，如 0·5%、1·0%、2% 等。
[0088] 应用例2
[0089] 取代表性食物面条、米饭、豆腐、猪肉，以不添加发酵胞外液的食物做对照，测定实 施例5和6的发酵胞外液与发酵胞内液的防腐效果，具体见下表：
[0092] 相对于对照组，实施例5和6提供的发酵胞外液和发酵胞内液对供试代表性食物均 有明显的防腐效果，发酵胞外液和发酵胞内液在实际生产中具有应用价值。在本应用例中， 发酵胞外液和发酵胞内液加入量占食品重量的1 %。
[0093] 本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领 域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替 代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
【主权项】
1. 一种竹荪提取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： A、 取竹荪的菌盖和/或菌托，热风烘干至恒重，粉碎过筛，得到待提粉末，密封保存， B、 将待提粉末和乙醇水溶液混合，在60-80 °C的恒温下浸提1.5-3.5hr， C、 过滤，取清液，即为竹荪提取液。2. 根据权利要求1所述的竹荪提取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： A、 取竹荪的菌盖和/或菌托，60°C热风烘干至恒重，粉碎过80目筛，得到待提粉末，密封 保存， B、 将待提粉末和浓度为60-95%乙醇水溶液以1:10-30的料液比，在60-80°C的提取温 度下浸提1.5-3.5hr， C、 过滤，取清液，即为竹荪提取液。3. 根据权利要求2所述的竹荪提取液的制备方法，其特征在于，所述的乙醇水溶液的浓 度为90%，所述的料液比为1:20,所述的浸提温度为75°C，所述的浸提时间为2hr。4. 一种竹荪发酵胞外液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： A、 菌种活化 将竹荪的菌盖和/或菌托接种于斜面培养基，24 °C恒温培养，进行活化， B、 准备菌丝 把活化后的竹荪菌种接种于PDA平板上，待长出孢子后用无菌水洗下分生孢子，制备成 IO6-IO8个.ml/1的孢子悬液，把孢子悬液与冷却至45-50 °C的HM培养基混合均匀，倒于各个 培养皿中，待菌丝长满后低温保存待用， C、 发酵 将长满菌丝的PDA培养基用无菌打孔器制成若干菌饼，将其接入液体PDA培养基，于24 °C、120r/min摇床培养IOd，得发酵培养基， D、 发酵胞外液的制备 发酵培养基低温离心取上清液，过滤，获得发酵胞外液。5. 根据权利要求4所述的竹荪发酵胞外液的制备方法，其特征在于，步骤D中，发酵培养 基的离心温度为4°C，离心速率为8000r/min，离心时间为lOmin。6. -种竹荪发酵胞内液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： A、 菌种活化 将竹荪的菌盖和/或菌托接种于斜面培养基，24 °C恒温培养，进行活化， B、 准备菌丝 把活化后的竹荪菌种接种于PDA平板上，待长出孢子后用无菌水洗下分生孢子，制备成 IO6-IO8个.ml/1的孢子悬液，把孢子悬液与冷却至45-50 °C的HM培养基混合均匀，迅速倒于 各个培养皿中，待菌丝长满后低温保存待用， C、 发酵 将长满菌丝的PDA培养基用无菌打孔器制成若干菌饼，将其接入液体PDA培养基，于24 °C、120r/min摇床培养IOd，得发酵培养基， D、 发酵胞内液的制备 发酵培养基低温离心，取离心后的沉淀用蒸馏水反复洗涤3次，收集菌丝体，菌丝体加 蒸馏水经过超声细胞破碎后，再加入无水乙醇，置于80°C水浴锅中水浴2h，过滤除菌，即为 发酵胞内液。7. 根据权利要求6所述的竹荪发酵胞外液的制备方法，其特征在于，步骤D中，所述的步 骤D中，发酵培养基的离心温度为4°C，离心速率为8000r/min，离心时间为lOmin。8. 根据权利要求1-3任意一项所述的制备方法制备的竹荪提取液在抑制食品腐败菌中 的应用。9. 根据权利要求4-5任意一项所述的制备方法制备的竹荪发酵胞外液在抑制食品腐败 菌中的应用。10. 根据权利要求6-7任意一项所述的制备方法制备的竹荪发酵胞内液在抑制食品腐 败菌中的应用。
【文档编号】C12P1/02GK105901681SQ201610250187
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】林海萍, 张爽, 张立钦, 李南羿, 王超, 郑剑
【申请人】浙江农林大学