用于乳凝胶流变特性的筛选方法

用于乳凝胶流变特性的筛选方法
【专利摘要】本发明涉及乳品技术领域，特别地，其涉及用于评估酸化乳凝胶(乳凝胶)的流变特性的方法，包括确定剪切应力、凝胶硬度和持水量。该方法可用于快速可靠地确定酸化乳例如酸乳酪和新鲜乳酪的流变特性。本发明还涉及筛选产生具有期望流变特性的发酵乳之微生物培养物的方法。通过使用在每个吸移管的排气筒内装配有压力传感器的自动化微量滴定板吸移平台，可以在吸取和分配乳凝胶时实时监测压力变化，然后将所得压力相对于时间数据与乳凝胶流变特性例如剪切应力、凝胶硬度和持水量相关联。
【专利说明】
用于乳凝胶流变特性的筛选方法
技术领域
[0001] 本发明涉及乳品技术领域，特别地，其涉及用于评估酸化乳凝胶(乳凝胶）的流变 特性的方法，包括确定剪切应力、凝胶硬度和持水量。
[0002] 该方法可用于快速可靠地确定酸化乳例如酸乳酪和新鲜乳酪的流变特性。本发明 还涉及筛选产生具有期望流变特性的发酵乳之微生物培养物的方法。
【背景技术】
[0003] 乳凝胶是一种软固体。其网络为易于发生结构重排的相对动态的体系。乳凝胶的 物理特性可采用酪蛋白相互作用模型来描述，所述酪蛋白相互作用包括吸引力与排斥力之 间的平衡。吸引力可以是例如疏水相互作用、来源于磷酸钙纳米团簇的酪蛋白交联和酪蛋 白与变性乳清蛋白之间的共价二硫化交联。排斥力可以是例如静电排斥或电荷排斥，在发 酵开始时大多数为负。
[0004] 乳凝胶例如酸乳酪通过用由嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus)和德氏 乳酸杆菌亚种保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp·bulgaricus)的混合 物组成的细菌培养物使乳发酵来制备。细菌发酵将乳糖及其他糖转化为乳酸，这降低乳的 pH。在乳的酸化期间，pH从约6.7降至<4.6,导致乳凝胶形成。该酸化过程导致形成由酪蛋 白簇和链组成的三维网络。主要有两种类型:凝固型酸乳酪(set yogurt)和搅拌型酸乳酪。 凝固型酸乳酪形成在零售罐(retail pot)中，因为乳酸菌将乳糖及其他糖发酵成乳酸，在 消费者容器中呈现连续凝胶结构。对于搅拌型酸乳酪，通过搅拌来搅乱(disrupt)在大型发 酵器中孵育期间形成的酸化乳凝胶，经搅拌产物通常经栗和管转移至缓冲器和冷却器。
[0005] 食品流变学研究食材的变形和流动。酸乳酪可归类为假塑性物质（含流动起始所 必需超出的屈服应力），其可为粘弹性流体(搅拌型酸乳酪或饮用型酸乳酪)或粘弹性固体 (凝固型酸乳酪）。粘弹性表示该物质具有理想固体的一些弹性特性和理想(粘性)液体的一 些流动特性(Lee和Lucey，2010)。通常使用流变仪和/或质构分析仪来评估酸乳酪的流变特 性，例如复数模量和剪切应力。大变形流变特性是重要的，这是因为大多数产品为搅拌型， 其中初始凝胶被剪切和搅拌。一种类型的大变形测试为应力过冲实验或恒定剪切速率测 试。感官质构属性常常与大变形仪器测试的结果相关联，例如剪切应力与粘度相关，复数模 量与凝胶硬度相关。收集关于酸化乳的流变特性之数据的能力为乳品生产商提供重要的 "产品维度"。关于流变性质（物质流动）的知识对于预测可栗性和可倾倒性、在浸渍 (dipping)或涂覆操作中的性能或其可处理、加工或使用的容易度有价值。
[0006] 酸乳酪的物理属性，包括缺乏可视乳清分离和感知粘度，是酸乳酪的质量和消费 者总体感官接受度的重要方面。由于这些原因，对剪切应力、凝胶硬度和乳清分离的测量通 常是生产/加工及递送发酵乳品用于进一步用途的几乎所用领域中所采用质量控制的整体 部分。
[0007] 质构是发酵乳品例如酸乳酪的重要质量因素，而消费者接受度常常与质构特性非 常紧密地相关。酸乳酪质构随加工参数而变化，并且尤其受对细菌培养物的选择影响。质构 可通过感官分析（由接受过培训人员小组进行)或通过提供关于产品的流动行为和粘性/弹 性之信息的流变学方法来描述。在用乳酸菌(LAB)进行的乳发酵中，乳糖及其他糖被转化为 乳酸，导致pH降低，随后酪蛋白胶束及其他乳蛋白质聚集。将乳的pH降低至pH4.6导致酪蛋 白颗粒中和(损失电荷），这随后导致酪蛋白颗粒聚集，最终导致增加的粘度和凝胶形成。凝 胶可通过例如复数模量（与感官描述词凝胶硬度相关）和剪切应力（与感官描述词口稠度 (mouth thickness)相关)来表征。由于由LAB酸化导致的蛋白质网络结构变化及LAB导致的 胞外多糖(EPS)的产生，不同发酵乳品的质构显著不同。
[0008] 对质构的感官评价通常作为完整感官谱分析的一部分实施，所述全部感官分析在 一项分析中提供关于酸乳酪的气味(odor)、风味(flavor)、味道(taste)和质构的信息。酸 乳酪的重要质构特性为凝胶硬度、口稠度和粘稠度(ropiness)。
[0009] 凝胶硬度:通过将一匙酸乳酪缓慢置于未触动过的酸乳酪表面并评价其在流出前 保持结构多长时间来进行视觉评价一一时间越长，凝胶硬度越高。
[0010] 口稠度:在以"正常高"食用速率食用酸乳酪时评价一一吞下酸乳酪所花费的时间 越长，口稠度越高。
[0011] 粘稠度:通过将一匙酸乳酪拉起并评价多长的线(绳状物(rope))挂在匙上来进行 视觉评价一一绳状物越长，粘稠度越高。
[0012] 对于凝固型酸乳酪，凝胶硬度和口稠度是最重要的参数，而对于搅拌型酸乳酪，口 稠度和粘稠度是关键参数。一般而言，粘稠酸乳酪更为乳脂状、更滑(颗粒较少）、更稠且硬 度较低。乳脂状常常与高粘稠度相关。感官质构属性常常与大变形仪器测试结果相关联，例 如，剪切应力与粘度相关，复数模量与凝胶硬度相关。乳凝胶的持水量是凝固型酸乳酪和新 鲜乳酪的重要质量参数。
[0013] 用于描述发酵乳流变性质的常用流变技术是粘度测定法，其中测量抗剪切力。该 测量在流变仪上实施，可在广泛范围的剪切速率下得到流动特性，提供完整的粘度测定表 征。剪切应力（由平行于物体表面作用的力而产生的变形)作为剪切速率(应变改变速率)的 函数测量，得到流动曲线。更多信息可获自通过增加剪切应力并随后将其降低得到的双流 动曲线(参照Mezger，2006中的图1)。向上流动曲线与向下流动曲线之间的环形区域称为滞 后，描述酸乳酪在变形后恢复结构的能力。表观粘度可计算为剪切应力除以剪切速率。对于 牛顿流体，例如水，剪切应力和剪切速率简单地成比例，因此，粘度恒定。然而，许多食物产 品例如酸乳酪剪切变稀，意味着提高剪切速率导致剪切应力小于比例增加。因此，这些产品 的粘度必须表示为指定剪切速率下的多个表观粘度。
[0014]在振荡测量中，使取自发酵乳产品的样品经历振荡运动(正弦应力）。该方法是非 破坏性的，并且以非常小的变形实施。因此，得到了操作(例如在口中）之前的酸乳酪起始硬 度的信息。被测量的参数是储能模量G'（表示弹性性能）和损耗模量G"（表示粘性特性）。由 此可计算出复数模量G*，其为总凝胶硬度的量度。
[0015]乳中脂肪和蛋白质减少通常与发酵乳品的许多质构和功能缺陷相关。一些产品例 如酸乳酪和乳酪可示出自发脱水收缩作用，其中在发酵期间在产品表面上形成乳清层。该 乳清层可在冷却期间被吸收。一些产EPS或其他聚合物的微生物培养物能够通过结合水/乳 清从而增加水含量来增加乳凝胶的持水量。这是一个重要功能，因为脂肪和蛋白质减少导 致脱脂物质中较少的水分。乳清分离(脱乳清)被定义为从网络中除去乳清，其随后变得作 为表面乳清可见。脱乳清不利地影响酸乳酪的消费者认知，因而酸乳酪生产商使用稳定剂 (例如，果胶、明胶、淀粉)或增加乳的总固体含量，尤其是蛋白质含量来防止脱乳清。自发脱 水收缩作用是未施加任何外力(例如，离心）的凝胶收缩，其为乳清分离的常见原因。自发乳 清分离与不稳定的网络相关，其可以是由于凝胶基质重排的增加或者其可以由对弱凝胶网 络的破坏(例如，通过振动或切割）引起。从发酵乳产品去除乳清或脱水缩合作用通过采用 离心、经筛或网眼对乳清去水或者利用虹吸法来测量。离心法测量作为高的外力之结果的 持水量，即，凝胶对压缩的抵抗。
[0016] 标准流变测量要求较大的待测发酵乳样品。虽然这些测量方法精确且可重复，但 是它们对每个样品所需时间、技术技能和精确度有高要求。用于测量粘度的现有设备对于 每个样品花费约20分钟，并且对于所有这样的设备，无论是自动机械实施该过程还是半自 动地或手动地，常见的是一次可测试仅一个样品。这些测量非常耗时，这是由于各个样品间 的清洗和更换步骤使其难以用于高通量筛选。
[0017] 在许多吸移应用中，为了各种目的在自动吸移过程期间进行压力监测，例如为了 丢弃不规律吸移过程(102002073215 ;他11^1切118〇11&(11^46)，或者为了提供对吸移过程的 完全自动控制（EP1614468;Hamilton Bonaduz AG)〇
[0018] W02011107472(Novozymes)中描述了通过测量两个或更多个样品的粘度随时间的 变化得到的液体中的酶活性。
[0019] 需要用于确定在一种或更多种菌株的存在下制备的乳凝胶的剪切应力、凝胶硬度 和/或持水量和用于筛选能够有助于剪切应力、凝胶硬度和/或持水量的菌株的改进方法。 本发明利用乳凝胶的吸移压力曲线测量，使得能够进行小样品体积乳凝胶流变特性的快速 确定，从而给出菌株改进乳凝胶质构的潜能的提示。

【发明内容】

[0020] 在食品工业，如所提及的，乳凝胶的流变性质是重要的质量参数。在乳的发酵中， 常常向乳中添加乳酸菌或其他细菌以提供具有期望口味及质构的产品，以延长乳的保质 期。筛选提供具有特定和期望质构的产品的微生物因现有粘度测量方法的缺点而耗时且耗 力。本发明人发现本发明方法对确定乳凝胶的流变性质特别有用。特别地，该方法还可用于 确定乳凝胶的一些流变性质，包括剪切应力、凝胶硬度和持水量。
[0021] 在一个方面，本发明提供了用于确定乳凝胶的剪切应力、凝胶硬度和持水量中至 少之一的方法，所述方法包括：
[0022] (i)提供一个或更多个样品，每一个均包含样品容器和样品，其中至少一个样品是 所述乳凝胶；
[0023] (ii)在步骤（i)所述样品的吸取和/或分配期间测量顶部空间压力以得到压力相 对于时间数据;和
[0024] (iii)由步骤（ii)的压力相对于时间数据确定所述乳凝胶的剪切应力、凝胶硬度 和持水量中至少之一；
[0025]其中在步骤(iii)中通过将所述压力相对于时间数据与剪切应力相关联来确定所 述剪切应力；在步骤（iii)中通过将由非混合样品或离心样品得到的吸取曲线上的最小压 力与复数模量相关联来确定所述凝胶硬度；以及在步骤（iii)中通过将由非混合样品或离 心样品得到的吸取曲线上的拐弯时间点(bend-time-point)与持水量相关联来确定所述持 水量。
[0026]本发明使得可以在使用96孔微型容器例如微量滴定板时，通过高通量筛选在发酵 乳中选择具有期望质构特性的最佳菌株，例如在少于60秒内同时测量96个不同样品，所述 质构特性包括剪切应力、凝胶硬度和持水量。通过使用在每个吸移管的排气筒（air displacement barrel)内装配有压力传感器的自动化微量滴定板吸移平台（pipetting station)(来自Hamilton Robotics TADM系统，描述于EP2009449和US6938504中），可以监 测吸取和分配乳凝胶时压力的实时变化，然后将所得压力相对于时间数据与乳凝胶流变特 性例如剪切应力、凝胶硬度和持水量相关联。压力监测通过TADM(总吸取和分配监测）工具 进行，其为上述液体处理自动机械中的任选装置。
[0027] 最近指出化?2009449;他11^1切118〇1^(11^46)，液体的表面张力和粘度越大，则液 体开始流入吸移管尖端时吸移管尖端内的压力越低，并且活塞移动而尚未发生任何液体流 动时压力的时间性质斜率的绝对值越大。作为另一一般规则，指出液体的粘度越大，活塞移 动已停止但液体流动仍继续时压力的时间性质斜率一般越小。然而，结论是所有这些一般 规则更为定性，因此，尽管他们似乎相当直观，但在准备使用吸移装置给出具有不同物理性 质的液体时，却难以对它们进行定量评估以计算待用工艺变量的差异。
[0028]用于确定乳凝胶的剪切应力、凝胶硬度和持水量中至少之一的方法可以不同的操 作模式实现。在一个实施方案中，本发明方法用于确定剪切应力。在另一实施方案中，该方 法用于确定凝胶硬度。在另一实施方案中，本发明方法用于确定剪切应力和凝胶硬度二者。 在另一实施方案中，本发明方法用于确定持水量。
[0029]因此，根据具体样品及期望定量的粘性，相应地进行样品操作和计算。
[0030]使用液体处理自动机械使得能够对样品进行统一处理，还使得可以对低体积样品 快速起效。本发明方法使得可以自动处理许多样品，适用于针对若干流变特性一一剪切应 力、凝胶硬度和持水量(脱乳清)一一;决速、可靠且可重复地对乳凝胶进行高通量筛选。
[0031] 质构极其重要，尤其是对于低脂和低蛋白质产品，其可通过使用产EPS培养物改 进，以补偿脂肪和蛋白质损失。在产生产高EPS培养物的开发过程中，所见粘度增加是递增 的，这突出了对精确测量的需要以区分和确定最佳候选物。本发明方法可区分粘度相近的 乳凝胶例如酸乳酪，还可在乳酪制备期间使用，如W02008153387中所述（Nizo Food Research B.V.)〇
[0032] 本发明在确定、预测或选择对于产生具有期望质量的发酵乳产品（例如酸乳酪或 乳酪)最佳的微生物例如细菌或这样的微生物的混合物非常有用。特别地，基于本发明方法 可鉴定出产生具有非期望特性(例如极稠、非均匀粘度等)的发酵乳的微生物(例如细菌)及 其混合物。
[0033] 因此，在第二方面，本发明提供了根据微生物有助于在所述微生物存在下制备的 乳凝胶的剪切应力、凝胶硬度和/或持水量的能力对所述微生物进行分级的方法：
[0034] (i)提供在至少一种微生物的存在下制备的乳凝胶的两个或更多个样品，每一个 均包含样品容器和样品；
[0035] (ii)在步骤（i)所述两个或更多个样品的吸取和/或分配期间测量顶部空间压力 以得到压力相对于时间数据;和
[0036] (iii)根据在所述至少一种微生物的存在下制备的乳凝胶的相对压力相对于时间 数据对所述微生物进行分级；
[0037] 其中
[0038]剪切应力a)与吸取曲线上的压力相对于时间数据成反比，并且b)与分配曲线上的 压力相对于时间成正比；
[0039] 凝胶硬度与由非混合样品或离心样品得到的吸取曲线上的最小压力成反比；和
[0040] 持水量与由非混合样品或离心样品得到的吸取曲线上的拐弯时间点成反比。
[0041] 在第三方面，本发明提供了用于确定乳凝胶的剪切应力、凝胶硬度和持水量中至 少之一的设备，所述设备包含在吸移管顶部空间装配有压力传感器的自动化吸移系统和在 所述方法的步骤(ii)期间调度样品操作和记录压力相对于时间测量结果的软件控制系统。
[0042] 本发明的其他目的和优点将由以下描述及权利要求而显而易见。
【附图说明】
[0043] 图1:具有不同粘度的5种商业酸乳酪培养物随时间[ms]推移测量的分配压力。
[0044] 图2:具有不同粘度的5种商业酸乳酪培养物随时间[ms]推移测量的吸取压力。
[0045] 图3:相对于通过吸移于6秒监测的分配压力绘出的用流变仪测量的300^1时剪切 应力。
[0046]图4:相对于通过吸移于13秒监测的吸取压力绘出的用流变仪测量的300(1时剪切 应力。
[0047] 图5:剪切应力不同的单株乳酸杆菌的两个重两个重复样品品的吸取曲线。
[0048] 图6:剪切应力不同的6种低脂酸乳酪的两个重两个重复样品品的吸取曲线。
[0049]图7:剪切应力不同的6种低脂酸乳酪的两个重两个重复样品品在吸取期间的压力 变化速率。
[0050] 图8:剪切应力不同的6种低脂酸乳酪的两个重复样品的分配曲线。
[0051] 图9:剪切应力不同的6种低脂酸乳酪的两个重复样品在分配期间的压力变化速 率。
[0052] 图10:用回归模型得到的剪切应力预测值(横轴)相对于观察值(纵轴）。
[0053] 图11:用回归模型得到的复数模量预测值(横轴)相对于观察值(纵轴）。
[0054]图12:通过在微量滴定板(每孔lm)中直接发酵乳制备用于筛选目的的乳凝胶样品 的吸取压力与大规模(奶瓶，200ml)用于乳发酵的相同微生物培养物的剪切应力值之间的 相关性。A.通过用14种不同乳球菌(Lactococcus)菌株直接在微量滴定板（lml)中于30°C发 酵乳20小时制备的并然后于4°C储存1天的乳凝胶样品的TADM吸取曲线。吸取500μ1的体积。 Β.(Α)的14个样品于1秒的吸取压力值与使用由相同培养物以200ml规模制备的乳凝胶样品 于流变计上测量的300JT 1时剪切应力之间的相关性，其中接种样品然后孵育12至15小时直 至其达到pH 4.55。
[0055]图13:使用TADM在96孔板中筛选乳球菌菌株。A.通过两个重复示出的微量滴定板 中96个样品的TADM吸取和分配曲线。通过用多至96个乳球菌(Lactococcus)菌株直接在微 量滴定板（lml)中于30°C发酵乳20小时制备乳凝胶样品，然后于4°C储存1天。吸取500μ1的 体积。Β.将来自两个重复的每种样品于1秒和1.2秒的吸取压力值求平均值，根据压力值分 级(从最低到最高)并绘图。来自（A)的菌株1(在板上作为高剪切应力对照出现两次)和菌株 2出现在(B)的标度下段，而乳样品和未酸化乳的菌株出现在较高压力标度(仅示出一个代 表性样品）。在现有测量条件下，已酸化乳但未导致高粘度乳凝胶的大多数菌株位于约-2000至-2500Pa。
[0056]图14:使用TADM分析乳凝胶的持水量。A.方法构思。基于测量用三种不同嗜热链球 菌(Streptococcus thermophilus)菌株发酵的乳中乳清相长度和TADM曲线拐弯的时间点 来计算相关系数R，每个菌株作16个重复。B.通过用三种不同菌株发酵乳得到的乳凝胶的 TADM曲线，使用未发酵乳作为对照。吸取700μ1的体积。
[0057]图15:Α.通过用单株嗜热链球菌于96孔微量滴定板发酵乳得到的乳凝胶TADM曲 线。B.导致具有高至中度复数模量(G*)值(与凝胶硬度相关)之乳凝胶的来自（A)的所选样 品。吸取500μ1的体积。TADM曲线标记有相应样品的G*值。
【具体实施方式】
[0058] 在第一方面，本发明提供了用于确定乳凝胶的剪切应力、凝胶硬度和持水量中至 少之一的方法，所述方法包括：
[0059] (i)提供一个或更多个样品，每一个均包含样品容器和样品，其中至少一个样品是 所述乳凝胶；
[0060] (ii)在步骤（i)所述样品的吸取和/或分配期间测量顶部空间压力以得到压力相 对于时间数据;和
[0061] (iii)由步骤（ii)的压力相对于所选时间数据确定所述乳凝胶的剪切应力、凝胶 硬度和持水量中至少之一；
[0062] 其中在步骤(iii)中通过将所述压力相对于时间数据与剪切应力相关联来确定所 述剪切应力；在步骤（iii)中通过将由非混合样品或离心样品得到的吸取曲线上的最小压 力与复数模量相关联来确定所述凝胶硬度；以及在步骤（iii)中通过将由非混合样品或离 心样品得到的吸取曲线上的拐弯时间点与持水量相关联来确定乳凝胶的所述持水量。
[0063] 术语"乳"意在指可根据本发明方法进行发酵的任何原料乳和/或经加工乳物质。 因此，可用乳基质包括但不限于任何乳或乳样产品的溶液/混悬液，例如全脂乳或低脂乳、 脱脂乳、酪乳、复原乳粉、炼乳、奶粉、乳清、乳清渗透物、乳糖、乳清蛋白浓缩物或奶油。乳基 质可来源于任何哺乳动物(例如牛、羊或猪)或复原乳粉。乳还包括来自可用乳酸菌发酵以 提供乳凝胶的具有相似外观的植物物质。在另一实施方案中，原料选自低至高脂乳和低至 高蛋白质乳。在另一实施方案中，原料是由雌性哺乳动物的乳腺分泌的乳。
[0064] 本文所用术语"乳凝胶"意在指任何具有高或低质构的酸化乳凝胶及其混合物，其 用酸化剂例如微生物酸化，具有在乳例如乳产品例如发酵乳产品（例如，酸乳酪、酪乳或酸 奶油）、乳酪(例如，新鲜乳酪）中进行发酵的至少一种微生物(例如细菌、酵母或霉菌）。
[0065] 本文所用术语"酸化剂"意在指固体、流体或液体形式的任何试剂，其在施用于(微 量)容器后能够降低容器中的pH(与添加酸化剂前容器中的pH相比），所述酸化剂例如微生 物或酸。在另一实施方案中，所述酸化剂选自微生物，所述微生物选自细菌，例如乳酸菌。
[0066] 在一个实施方案中，本发明方法用于确定剪切应力、凝胶硬度和持水量。
[0067] 在另一实施方案中，样品中至少有一些被吸取和/或分配多于一个吸取和/或分配 循环。
[0068] 在另一实施方案中，所述乳凝胶包含多于一个相，例如液相和软固相。
[0069] 在另一实施方案中，在第一吸取和/或分配循环后第二吸取和/或分配循环前混合 样品，例如通过反复吸取和/或分配，或者通过引入样品容器的混合装置。
[0070] 在另一实施方案中，对于至少一种样品，基本上全部样品体积在步骤（ii)中被吸 取和/或分配。
[0071 ] 在另一实施方案中，每个所述样品的体积小于lml、小于0.75ml、约0.5ml或约 0.35ml〇
[0072] 在另一实施方案中，样品中至少有一些被吸取和分配多于一个吸取和/或分配循 环。
[0073] 在另一实施方案中，乳凝胶是发酵乳品。在另一实施方案中，乳凝胶是酸乳酪、酪 乳、酸奶油或新鲜乳酪。在另一实施方案中，乳凝胶是酸乳酪。
[0074]如实施例1和4所示，乳凝胶的剪切应力与吸取曲线上所选时间点的顶部空间压力 成反比，并且与分配曲线上所选时间的顶部空间压力成正比。因此，可通过选择吸取或分配 曲线(取决于吸取/分配速度和体积)上的时间点和使用通过流变计测量结果编制的模型将 该时间点的顶部空间压力与剪切应力相关联来确定剪切应力。
[0075]因此，在另一实施方案中，在步骤(iii)中通过将所选时间点测量的顶部空间压力 与剪切应力相关联来确定乳凝胶的所述剪切应力。
[0076]如所示，在实施例3中，剪切应力与TADM压力曲线特征之间的线性回归模型具有非 常高的预测能力。
[0077]在又一实施方案中，通过吸取获得压力相对于时间数据。
[0078]在另一实施方案中，通过分配获得压力相对于时间数据。
[0079] 在又一实施方案中，通过吸取和分配二者获得压力相对于时间数据。
[0080] 在又一实施方案中，用于步骤(ii)的装置是在每个吸移管的排气筒内装配有压力 传感器的自动化吸移平台。通常而言，该装置是Hamilton Robotics MicroLab Star。
[0081] 在另一实施方案中，所确定的流变特性选自复数模量和剪切应力中的一种或更多 种。通常而言，所确定的流变特性选自复数模量和剪切应力。
[0082] 对于乳凝胶质构特性的高通量测量，通常直接在微量容器中发酵乳，并于恒定温 度例如4°C下于4°C储存1至30天，所述微量容器通常是96孔微量滴定板或384孔微量滴定 板。约1个月的长时间储存会导致一些样品的自发乳清分离，其可利用本发明方法测量为乳 凝胶的持水量。其他样品在乳发酵期间将显示已出现的乳清分离。或者，为了避免在能够分 析持水量之前的长时间储存，对微量滴定板中的样品施加外力例如离心以加速乳清分离。 轻柔离心（例如，500xg，5至10分钟)通常将引起乳清分离，但离心条件可能不同，这取决于 乳凝胶特性和乳内容物。例如，由具较低量脂肪和蛋白质的乳制成的乳凝胶网络会比由具 较高量脂肪和蛋白质的乳制成的乳凝胶弱。添加到乳中的稳定剂例如果胶将稳定乳凝胶网 络，并且其因而需要更猛烈的离心(更快的加速度，更长的时间）以增加脱乳清。过于猛烈的 离心会对凝胶网络造成如此大的损失以至于所有乳凝胶样品将得到类似的乳清相长度，无 论用于发酵乳的菌株为何。
[0083]在另一实施方案中，所述样品容器是多孔板中的一个孔。
[0084] 在一个实施方案中，步骤(ii)中样品的吸取和/或分配来自吸移管。
[0085] 在另一实施方案中，所述吸移管尖端在刚好低于样品的表面处吸取样品，使得吸 取速率匹配吸移管尖端垂直移动入样品内的速度。
[0086] 在另一实施方案中，在步骤（ii)的至少一个吸取和/或分配循环期间的所述测量 之前对样品中的至少一些进行离心。
[0087] 在又一实施方案中，使所述样品在尚未离心的情况下进行步骤(ii)中的第一吸取 和/或分配循环，离心所述样品，然后对其进行步骤(ii)中的进一步的吸取和/或分配循环。
[0088] 在另一实施方案中，至少一种样品是标准品。
[0089] 在另一实施方案中，在60秒内、30秒内或5秒内对每个样品完成步骤(i i)的一次或 更多次吸取和/或分配循环而不进行任何离心。
[0090] 如果在自发乳清分离发生前确定尚未于4°C储存多于一天的样品的持水量，该方 法由以下步骤组成：（i)对含发酵乳的微量滴定板离心。由于离心，形成了两个相:水样的 (乳清)和粘性的/固体；（ii)具有传导吸移管尖端的96孔自动机械头部进入管(96个样品同 时)并采用液面检测寻找样品表面。如果使用非传导性吸移管尖端，则有必要限定距离管底 部的距离，在此处96孔头部将开始吸取样品；（iii)一旦所述尖端感受到样品表面，其开始 吸取样品同时缓慢向下移动入管，首先进入乳清相然后进入粘性/固相。同时记录TADM; (iv)记录TADM曲线拐弯的时间点，其表示从乳清相到固相的转变，然后将该时间点与乳清 相长度相关联。较短的时间表示较小的乳清相长度及因而较高的持水量(图15)。
[0091] 为了确定乳凝胶样品（通常在a)于4°C储存或b)离心后于96孔微量滴定板中）的持 水量、剪切应力和凝胶硬度，对该板进行一个或若干个后续吸取和/或分配步骤，同时记录 TADM。在第一吸取循环期间，TADM压力曲线以绘图表示，其中纵轴上为压力(Pa)，横轴上为 时间（毫秒）。具V样曲线的样品通常具有高凝胶硬度（图15)。将对具有V形样曲线的每个样 品所观察到的最低压力与具中至高凝胶硬度的乳凝胶之凝胶硬度相关联。对于具有低凝胶 硬度但较高剪切应力的样品而言，该关联不显著，因为这些压力曲线使V形松散，这使得难 以进行凝胶硬度测量。然而，因为可以利用该方法分辨出具高凝胶硬度至中度凝胶硬度的 样品，所以其为筛选具有高凝胶硬度的菌株的良好工具。
[0092] 在通过将吸移管尖端缓慢移动进样品同时吸取的第一轮吸取期间一一此时存在 两个相(水相和固相），于非混合样品中确定持水量，并记录TADM压力曲线拐弯时的时间点， 该时间点表示固相的开始(参见图14)。
[0093] 所述发酵乳凝胶可含有一种微生物，或若干种不同的微生物。
[0094] 所述发酵乳凝胶可以是两种或更多种乳凝胶的混合物，或者可以将其他添加剂与 乳混合，所述添加剂例如稳定剂、凝胶形成剂、蛋白质例如脱脂乳粉、淀粉、碳水化合物。
[0095] 在另一些实施方案中，当从乳凝胶吸取和/或分配样品时，其通常在短时间区间内 完成，例如用96通道吸移头，96个样品可以在几秒内检测。标准流变测量要求每个样品20分 钟，因此，96个样品需要32小时。
[0096] 因此，当采用本发明方法确定流变性质时，可分析显著增加数目的样品，因而可对 用于产生乳凝胶的相当高数量的乳组合物和微生物进行分析、归类和选择。
[0097] 在又一些实施方案中，当从乳凝胶吸取和/或分配样品时，这样的样品通常选自 100微升(μL)至10毫升(ml)的体积。通常而言，当乳凝胶是酸乳酪时，吸取和/或分配的样品 选自100μΙ至lml的体积。
[0098]从乳凝胶吸取和/或分配样品在一定温度区间内且在一定压力下完成，所述温度 区间和压力可根据待测试乳凝胶而不同。乳凝胶通常储存在低温下，例如4°C至13°C，但通 过TADM进行的压力测量通常在室温下进行，例如20°C。
[0099] 如果所述乳凝胶是酸乳酪，则在4 °C至30°C的温度区间内从液体中吸取和/或分配 样品，优选地在4°C至18°C的温度区间内，以约latm的环境大气压力。
[0100]因为乳凝胶的剪切应力与吸取曲线上的压力相对于时间数据成反比，与分配曲线 上的压力相对于时间数据成正比（乳凝胶的剪切应力与吸取曲线上所选时间点（取决于吸 取速度和体积）的顶部空间压力成反比，与分配曲线上所选时间点（取决于分配速度和体 积)的顶部空间压力成正比），所以乳凝胶的凝胶硬度与获自非混合样品或离心样品的吸取 曲线上的最小压力成反比，乳凝胶的持水量与获自非混合样品或离心样品的吸取曲线上的 拐弯时间点成反比(参见本文中的实施例），乳凝胶样品的剪切应力、凝胶硬度和/或持水量 可容易地通过比较乳凝胶样品的相对压力相对于时间数据来进行比较。
[0101] 在第二方面，本发明提供了用于根据微生物有助于在所述微生物存在下制备的乳 凝胶的剪切应力、凝胶硬度和/或持水量的能力对所述微生物进行分级的方法：
[0102] (i)提供在至少一种微生物的存在下制备的乳凝胶的两个或更多个样品，每一个 均包含样品容器和样品；
[0103] (ii)在步骤（i)所述两个或更多个样品的吸取和/或分配期间测量顶部空间压力 以得到压力相对于时间数据;和
[0104] (iii)根据在所述至少一种微生物的存在下制备的乳凝胶的相对压力相对于时间 数据对所述微生物进行分级，
[0105] 其中剪切应力a)与吸取曲线上的压力相对于时间数据成反比，并且b)与分配曲线 上的压力相对于时间数据成正比;凝胶硬度与由非混合样品或离心样品得到的吸取曲线上 的最小压力成反比；以及持水量与由非混合样品或离心样品得到的吸取曲线上的拐弯时间 点成反比。
[0106] 当本发明方法用于确定或预测哪些微生物例如细菌或者所述微生物的混合物适 于产生发酵乳(例如酸乳酪)时，它是非常有用的，所述微生物或这样的微生物的混合物带 来期望的剪切应力、凝胶硬度和持水量，从而为发酵乳产品带来期望的质量。特别地，可鉴 定出导致具有非期望特性的乳凝胶的微生物(例如细菌)及其混合物，所述非期望特性例如 较低或较高的粘度、较低或较高的凝胶硬度或者较低或较高的持水量。
[0107] 在另一实施方案中，用于根据微生物有助于在所述微生物存在下制备的乳凝胶的 剪切应力、凝胶硬度或持水量的能力对所述微生物进行分级的方法还包括步骤（iv):如果 所述至少一种微生物有助于在所述至少一种微生物的存在下制备的乳凝胶之相对高剪切 应力、相对高凝胶硬度和/或相对高持水量，则选择所述至少一种微生物。
[0108] 在另一实施方案中，用于根据微生物有助于在所述微生物存在下制备的乳凝胶的 剪切应力、凝胶硬度或持水量的能力对所述微生物进行分级的方法还包括步骤（iv):如果 所述至少一种微生物有助于在所述至少一种微生物的存在下制备的乳凝胶之相对低剪切 应力、相对低凝胶硬度和/或相对低持水量，则选择所述至少一种微生物。
[0109] 在另一实施方案中，所述样品中至少有一些被吸取和/或分配多于一个吸取和/或 分配循环。
[0110] 在另一实施方案中，所述乳凝胶包含多于一个相，例如液相和软固相。
[0111] 在另一实施方案中，在第一吸取和/或分配循环后第二吸取和/或分配循环前混合 样品，例如通过反复吸取和/或分配，或者通过引入样品容器的混合装置。
[0112] 在另一实施方案中，对于至少一个样品，基本上全部样品体积在步骤（ii)中被吸 取和/或分配。
[0113] 在另一实施方案中，每个所述样品的体积小于lml、小于0.75ml、约0.5ml或约 0.35ml〇
[0114] 在另一实施方案中，样品中至少有一些被吸取和/或分配多于一个吸取和/或分配 循环。
[0115] 在另一实施方案中，乳凝胶是发酵乳品。在另一实施方案中，乳凝胶是酸乳酪、酪 乳、酸奶油或新鲜乳酪。在另一实施方案中，乳凝胶是酸乳酪。
[0116] 在又一实施方案中，通过吸取获得所述压力相对于时间数据。
[0117] 在另一实施方案中，通过分配获得所述压力相对于时间数据。
[0118] 在又一实施方案中，通过吸取和分配二者获得所述压力相对于时间数据。
[0119] 在另一实施方案中，用于步骤(ii)的装置是在每个吸移管的排气筒内装配有压力 传感器的自动化吸移平台。通常而言，该装置是Hamilton Robotics MicroLab Star。
[0120] 在另一实施方案中，所述样品容器是多孔板中的一个孔。
[0121] 在一个实施方案中，步骤(ii)中样品的吸取和/或分配来自吸移管。
[0122] 在另一实施方案中，所述吸移管的尖端在刚好低于样品的表面处吸取样品，使得 吸取速率匹配吸移管尖端垂直移动入样品内的速度。
[0123] 在另一实施方案中，在步骤（ii)的至少一个吸取和/或分配循环期间的所述测量 之前离心样品中的至少一些。
[0124] 在又一实施方案中，使所述样品在尚未离心的情况下进行步骤(ii)中的第一吸取 和/或分配循环，离心所述样品，然后对其进行步骤(ii)中的进一步的吸取和/或分配循环。
[0125] 在另一实施方案中，至少一个样品是标准品。
[0126] 在另一实施方案中，在60秒、30秒或5秒内对每个样品完成步骤(ii)的一个或更多 个吸取和/或分配循环而不进行任何离心。
[0127] 所述发酵乳凝胶可含有一种微生物，或若干种不同的微生物。
[0128] 所述发酵乳凝胶可以是两种或更多种乳凝胶的混合物，或者可以将其他添加剂与 乳混合，例如稳定剂、凝胶形成剂、蛋白质例如脱脂乳粉、淀粉、碳水化合物。
[0129] 在另一些实施方案中，当从乳凝胶吸取和/或分配样品时，其通常在短时间区间内 完成，例如用96通道吸移头，96个样品可以在几秒内检测。标准流变测量要求每个样品20分 钟，因此，96个样品需要32小时。
[0130] 在又一些实施方案中，当从乳凝胶吸取和/或分配样品时，这样的样品通常选自 100微升(μL)至10毫升(ml)的体积。通常而言，当乳凝胶是酸乳酪时，吸取和/或分配的样品 选自100μΙ至lml的体积。
[0131] 当从乳凝胶吸取和/或分配样品时，其在一定温度区间内且在一定压力下进行，所 述温度区间和压力可根据待测试乳凝胶而不同。乳凝胶通常储存在低温下，例如4°C至13 °C，但通过TADM进行的压力测量通常在室温下进行，例如20°C。
[0132] 如果所述乳凝胶是酸乳酪，则在4 °C至30°C的温度区间内从液体中吸取和/或分配 样品，优选地在4°C至18°C的温度区间，以约latm的环境大气压力。
[0133] 此外，本发明对筛选适于用于获得乳凝胶的特定流变特性的微生物(例如细菌)或 这样的微生物的混合物非常有用。
[0134] 因此，该确定剪切应力的方法还可视为通过如本文所述确定剪切应力来确定乳凝 胶的质量的方法。
[0135] 乳凝胶可以在装有各乳凝胶样品的具有1、2或多至384个容器的样品容器中进行 测量，且单位面积可能有甚至更高的孔密度。在另一实施方案中，高通量筛选在微量容器中 进行，例如在具有至少1个、8个例如至少24个、例如至少48个、例如至少96个、例如至少384 个孔的微量滴定板中进行。通常而言，高通量筛选在具有96个孔的微量滴定板中进行。
[0136] 在上述监测方法中使用的微生物通常选自乳酸菌、酵母、霉菌，所述乳酸菌例如乳 球菌（Lactococcus)、乳杆菌（Lactobacillus)、链球菌（Streptococcus)、明串珠菌 (Leuconostoc)、片球菌（Pediococcus)、双歧杆菌（Bifidobacterium )、芽抱杆菌 (Bacillus)、酒球菌（Oenococcus);所述酵母例如酵母菌（Saccharomyces)、毕赤酵母 (卩；[(311丨&)、克鲁维酵母(1(1115^61'01115^68)、假丝酵母(0&11(1丨(1&)和地丝菌(6601：1'；[。1111111);所述 霉菌例如曲霉(Aspergillus)和青霉(PeniciIlium) 0
[0137] 本文所用术语"TADM"意在指总吸取和分配监测，即样品吸取和分配期间对压力的 测量。
[0138] 本文所用术语"添加剂"意在指用于影响乳凝胶的流变性和持水量的待测试的任 何合适的添加剂。这样的添加剂可以是待与乳混合的一种添加剂或者两种或更多种添加剂 的混合物，例如但不限于稳定剂、凝胶形成剂、蛋白质例如脱脂乳粉、淀粉、碳水化合物和水 胶体。
[0139] 与确定乳凝胶的流变特性例如剪切应力、凝胶硬度和持水量的方法相关的上述所 有实施方案也适用于该监测乳凝胶剪切应力变化的方法。
[0140] 本文所引用的所有参考文献包括出版物、专利申请和专利均以引用方式并入本 文，其程度就如同每篇参考文献个别地且明确地指明以引用方式并入并且在本文中以其整 体给出一样。
[0141] 本文所用所有标题和小标题仅为了方便起见并且不应解释为以任何方式限制本 发明。
[0142] 除非在本文中另有指明或者与上下文明显矛盾，否则上述要素所有可能变化形式 的任何组合均由本发明涵盖。
[0143] 除非本文中另有指明，否则本文述及的范围值仅旨在作为单独提及落入该范围内 的每个单独的值的简捷方法，并且每个单独的值均并入说明书中，如同其在本文中单独引 用一样。除非另有说明，否则本文中提供的所有确切值代表相应的近似值(例如，针对特定 因素或测量结果提供的所有示例性确切值均可视为还提供相应的近似测量结果，在适当时 用术语"约"修饰）。
[0144] 本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行，在本文中另有指明或者与上下 文明显矛盾除外。
[0145] 在描述本发明的上下文中使用的"a/an"和"所述"及类似指称均应理解为涵盖单 数和复数，本文中另有指明或者上下文明显矛盾除外。因此，"a/an"和"所述"可以指至少一 或者一或更多。
[0146] 本文提供的任意和全部实施例或示例性语言(例如，"例如"）的使用仅旨在更好地 阐明本发明而不对本发明的范围构成限制，另有指明除外。说明中的语言均不应理解为表 示任一要素对实践本发明必不可少，除非同样明确地陈述。
[0147] 本文中专利文献的引用和并入仅为了方便起见，并不反映该专利文献的任何有效 性、可取得专利性、和/或可实施性。
[0148] 本文中在提及一个或更多个要素时使用术语例如"包含"、"具有"、"包括"或"含 有"对本发明的任意方面或实施方案进行的描述旨在为"由该特定的一个或更多个要素组 成"、"基本上由该特定的一个或更多个要素组成"或"主要包含该特定的一个或更多个要 素"的本发明类似方面或实施方案提供支持，上下文中另有指明或明显矛盾除外（例如，本 文所述包含特定要素的组合物应理解为还描述由该要素组成的组合物，上下文另有指明或 者明显矛盾除外）。
[0149] 本发明在适用的法律所允许的最大程度上包括在本文所示各个方面或权利要求 中引用的主题的所有修改和等同形式。
[0150]以上描述中公开的特征可单独地及以其任意组合为用于以其多种形式实现本发 明的材料。
[0151] 实施例
[0152] 本文描述和要求保护的本发明不限于本文所公开的特定方面的范围，因为这些方 面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等同方面旨在落在本发明的范围内。事实上，对于 本领域技术人员而言，除本文示出和描述的那些之外的本发明多种修改将通过以上描述而 显而易见。这些修改也旨在落在所附权利要求的范围内。在存在矛盾的情况下，以本公开内 容(包括定义)为准。
[0153] 用于吸移的设备
[0154] 在以下实验中使用装配有TADM工具的液体处理平台Hamilton Robotics MicroLab Star〇
[0155] 所述Hamilton Robotics MicroLab Star具有4、8、12或16个吸移通道及96孔头， 其基于排气技术构建，与手持电子吸移管相似。每个通道可吸取多至lml的体积，并且对于 一些吸移通道而言，多至5ml。为了在不同体积范围内吸移，96孔头可适应体积为10、50、300 至lOOOyl的一系列尖立而。
[0156] 该液体处理器具有位于每个吸移通道的顶部空间的压力传感器。通过在计算机上 运行的合适的软件收集来自每个传感器的压力数据，例如，通过Hamilton Robotics MicroLab Star液体处理器(Hamilton Robotics)的"总吸取分配监测"（TADM)软件。
[0157] 实施例1 一商业酸乳酪培养物
[0158] 乳的发酵
[0159] 使用酸乳酪培养物的冷冻浓缩物接种添加有2%脱脂乳粉的脱脂乳。将该乳于90 °C加热20分钟，然后用0.02 %冷冻浓缩物接种。孵育在43 °C发生直至pH达到4.55，此时发生 乳的凝固。随后，利用后处理单元(PTU)向酸乳酪施加2巴的后处理。然后将发酵乳冷却至5 Γ。
[0160] 发酵乳的流变学测量
[0161] 流变学:孵育次日，使发酵乳达到13°C，并用装配有穿孔盘的棍状物轻柔搅拌直至 样品均勾。在流变计上评估样品的流变特性(Anton Paar Physica Rheometer with ASC, Automatic Sample Changer，Anton'Paar5CGmbH,Austria) 〇设置如下：
[0162] 等待时间（为了重建至几分原始结构）
[0163] 5分钟，不进行振荡或旋转
[0164] 振荡（为了测量G'和G"以计算G*)
[0165] =0.3%，频率(f) = [0.5 …8]Hz [0166] 经60秒6个测量点(每10秒一个）
[0167] 旋转(为了测量300 Ι/s时的剪切应力）
[0168] =[0·3-300]Ι/s和=[275-0·3]1/s
[0169] 经210秒21个测量点(每10秒一个），升至300 1/s。
[0170] 和
[0171] 经210秒21个测量点(每10秒一个），降至0.3 1/s。
[0172]选择300 Ι/s时的剪切应力进行进一步分析。
[0173]样品还由经培训感官评审小组评价，其中按照前述通过将一匙酸乳酪缓慢置于未 触动过的酸乳酪表面上并评价在流出前保持其结构多久一一时间越长，凝胶硬度越高一一 来视觉评价凝胶硬度、口稠度和粘稠度。
[0174]吸移:均匀搅拌用质构特性不同的培养物制备的发酵乳以在将样品转移至测试管 前获得均匀性。每管只进行一次吸取和分配，因为酸乳酪的结构将在尖端进入时发生变化。 以20μ 1 /秒的速率吸取500μ 1的体积并以50μ 1 /秒分配，实时记录压力变化。
[0175] 结果和结论
[0176] 用目前在乳品业使用且具有不同剪切应力的酸乳酪培养物浓缩物孵育的发酵乳 可通过常规流变计测试和通过吸移下监测的吸取和/或分配压力二者来明显区分(参见图1 和2)。此外，在流变计上测量的300JT 1时的剪切应力(Pa)与分配压力(Pa)之间的关联示出相 关系数为〇 · 92(参见图3)。在流变计上测量的300(1时的剪切应力(Pa)与13秒时的吸取压力 之间的关联示出相关系数为0.95(参见图4)。
[0177] 实施例2-单株乳酸杆菌
[0178] 乳的发酵
[0179] 将剪切应力不同的两株乳酸杆菌在MRS肉汤中于37°C培养过夜。在干物质含量为 9.5%且在分批工艺中以15分钟热处理至99°C的复原乳中按照1%v/v接种该菌株，一式两 份。在37°C进行孵育直至pH达到4.55,此时乳发生凝固。轻柔搅拌发酵乳至均匀，冷却至5 °C，次日转移至烧杯。
[0180] 发酵乳质构的确定
[0181] 吸移:均匀搅拌用质构特性不同的培养物制备的发酵乳以在将样品转移至测试管 前获得均匀性。每管只进行一次吸取和分配，以20μ1/秒的速度吸取500μ1的体积并以50μ1/ 秒分配，实时记录压力变化。
[0182] 结果和结论
[0183] 用具有不同流变特性的单株乳酸杆菌孵育的发酵乳可通过在吸移期间监测到的 吸取压力明显地区分(参见图5)。
[0184] 实施例3-低脂酸乳酪质构的分析
[0185] 低脂酸乳酪
[0186] 使用酸乳酪培养物的冷冻浓缩物接种添加有2%脱脂乳粉的脱脂乳(0.1%脂肪）。 将该乳于90°C加热20分钟，然后用0.02 %冷冻浓缩物接种。孵育在43°C发生直至pH达到 4.55,此时发生乳的凝固。随后，利用后处理单元(PTU)向酸乳酪施加2巴的后处理。然后，将 发酵乳冷却至5 °C。
[0187] 低脂酸乳酪的流变学测量
[0188] 流变学:孵育次日，使酸乳酪达到13°C，并用装配有穿孔盘的棍状物轻柔搅拌直至 样品均勾。在流变计上评估样品的流变特性(Anton Paar Physica Rheometer with ASC, Automatic Sample Changer,AntonPaar?GmbH,Austria)。设置如下：
[0189] 等待时间（为了重建至几分原始结构）
[0190] 5分钟，不进行振荡或旋转
[0191] 振荡（为了测量G'和G"以计算G*)
[0192] =0.3%，频率(f) = [0.5 …8]Hz [0193] 经60秒6个测量点(每10秒一个）
[0194] 旋转(为了测量300 Ι/s时的剪切应力）
[0195] = [0 · 3-300] Ι/s和=[275-0 · 3] 1/s
[0196] 经210秒21个测量点(每10秒一个），升至3001/s。
[0197] 和
[0198] 经210秒21个测量点(每10秒一个），降至0 · 31 /s。
[0199]选择3001/s时的剪切应力进行进一步分析。
[0200] 吸移:将按照上述制备的低脂酸乳酪转移至测试管。每管只进行一次吸取和分配， 因为酸乳酪的结构将在尖端进入时发生变化。吸取500μ1的体积（25μ1/秒)并分配(65μ1/ 秒），实时记录压力变化。
[0201] 压力曲线特征提取：
[0202] 获自6种不同低脂酸乳酪(一式两份)的吸取和分配曲线可见于图6和图8。
[0203]选择压力曲线特征的不同方法代替固定的任意时间点。根据压力曲线（图6)计算 压力变化速率(图7和9)。然后，如下所述评估最大速率及获得该速率的时间：
[0204]
[0205] 最大吸取速率=最大(吸取速率）
[0206] 吸出tmax = t(最大吸出速率）
[0207]
[0208] 最大分配速率=最大(分配速率）
[0209] 分配tmax = t (最大分配速率）
[0210] 这些描述词(特征）用于偏最小二乘法分析(参见下述和图10至12)。尤其对于分配 曲线，在分配结束时发生时间偏移。这被称为下降(drop-off)，并且将其用作变量（以毫秒 计）（参见图1和图8)。
[0211]结果和讨论
[0212]用目前乳品业中使用的酸乳酪培养物浓缩物孵育的并且具有不同流变特性的低 脂搅拌型酸乳酪可以通过常规流变计测试和通过在吸移下监测吸取和/或分配压力二者明 显区分(参见图6和8)。
[0213]此外，使用从这些曲线提取的特征构建偏最小二乘（PLS) (Wold, Svante ;Ruhe， Axel ;Wold,Herman;Dunn，W.J. (1984) .SIAM J.Sci.Stat.Comp.5(3) :735-743)模型。这些 模型检查这些特征与300 1/s时的剪切应力和1Hz时的复数模量之流变计结果的线性回归 关系。
[0214]通过 Umetrics 用 SB1CA 13.0 构建模型。
[0215]使用来自压力曲线的计算特征作为X变量(潜在的），使用流变计参数作为Y(参考） 变量。
[0216]然后建立X变量与Y变量之间的线性回归模型，并针对每个X变量计算线性回归系 数。
[0217]在下表中针对所得模型描述(R2)和预测(Q2)的能力对所得模型进行了描述：
[0218]
[0219] RMSEE(估值的均方根误差)表示观察结果至模型的拟合。RMSEcv是类似量度，但采 用交叉验证(排除样品）步骤评估并反映预测误差。它们示出模型的精确度。"剪切应力"的 模型误差在合理范围内（<10% )，而"复数模量"（G*)的预测不那么精确（11.5%)。该不精 确是由于参考方法(流变计)>20 %的偏差，尤其在低水平G* (〈50)时。
[0220]此外，通过利用吸移压力特征在流变计上测量的300 l/s(Pa)时的剪切应力的预 测能力示出相关系数为0.97(参见图10)。通过吸移特征得到的复数模量的相应预测模型示 出相关系数为0.924(参见图11)。
[0221 ]实施例4 一针对质构化LAB菌株的高通量筛选 [0222]乳的发酵
[0223]用不同的乳球菌菌株接种含具有1 %乳糖和1 %葡萄糖之M17肉汤的96孔微量滴定 板并在Galaxy R C02孵育器(RS Biotech)中于30°C孵育过夜。用不同的嗜热链球菌菌株接 种含具有2%乳糖之M17肉汤的另一96孔微量滴定板并在Galaxy R C02孵育器中于37°C孵 育过夜。利用Hami 1 ton自动机械使用来自含添加剂之M17肉汤的1 %过夜培养物接种含乳和 pH指示剂的96孔微量滴定板，并于30°C孵育乳球菌菌株20小时及于43°C孵育链球菌菌株18 小时。利用pH指示剂进行的pH确定确定大多数样品的pH低于5.0。所述板作两次重复。将含 酸化乳的板在4°C储存1天。
[0224]使用所选乳球菌和链球菌菌株接种200mL体积的乳，用于通过流变计进行流变分 析。在干物质含量为9.5%且在分批工艺中以15分钟热处理至99°C的复原乳中按照1%v/v 接种该菌株，一式两份。对于乳球菌孵育发生在30°C，对于链球菌孵育发生在43°C直至pH达 到4.55,此时乳发生凝固。轻柔搅拌发酵乳样品至均匀，冷却至4°C，5日后于4°C转移至烧 杯。
[0225] 发酵乳质构的分析
[0226] 乳酸化并在4 °C储存1天后，利用Hamilton自动机械对微量滴定板进行TADM压力分 析（图12A，13A)。使用大口径尖端吸取500μ1的体积(350yl/s)。对来自两个重复的每种样品 1秒及1.2秒时的吸取压力值求均值、根据压力值分类(最低至最高)并绘图（图13Β)。
[0227] 利用流变计（具有自动样品更换器ASC的Anton Paar Physica Rheometer,Anton Paaif GmbH，Austria)来评估样品的流变特性，采用实施例1中的设置。选择剪切速率300s 4时的剪切应力分析来将获自流变计与TADM分析的流变性质相关联(图12B)。
[0228] 结果与结论
[0229] 通过在微量滴定板中使用不同的单一菌株进行乳酸化并通过TADM分析所得乳凝 胶的质构化特性，可以选择导致高粘度乳凝胶（图13)的菌株和具有高凝胶硬度的乳凝胶 (图 15)。
[0230]在图13上，高剪切应力候选菌株--来自图13A的菌株1 (在板上作为高剪切应力 对照出现两次)和菌株2-一二者出现在图13B的标度下段，而乳样品和未酸化乳的菌株出 现在较高压力标度(仅示出一个代表性样品）。使乳酸化但未导致高粘度乳凝胶的大多数菌 株在现有测量条件下位于约_2000Pa至-2500Pa。
[0231] 因而，TADM压力分析是用于筛选能够导致具有期望流变特性之乳凝胶的微生物的 合适工具。
[0232] 实施例5-乳凝胶持水量的确定
[0233] 乳凝胶例如凝固型酸乳酪和/或新鲜乳酪的持水量是期望的特征。
[0234] 为了在96孔微量滴定板中确定乳凝胶样品的持水量，对经离心以诱导脱乳清或经 冷存延长时间（例如，30天)的样品进行TADM压力测量。
[0235] 乳的发酵
[0236] 用3种不同的嗜热链球菌菌株接种含具有2%乳糖之M17肉汤的96孔微量滴定板， 每种菌株作若干重复以评估变化水平，并在Galaxy R C02孵育器(RS Biotech)中于37°C孵 育过夜。利用Hamilton自动机械使用来自含2 %乳糖的M17肉汤的1 %过夜培养物接种含乳 和pH指示剂的96孔微量滴定板，并于43 °C孵育18小时。
[0237] 发酵乳持水量的确定
[0238] 将含乳凝胶样品和作为对照之乳的板以500xg于4°C离心10分钟。在通过将吸移管 尖端缓慢移动进样品同时吸取的第一轮吸取期间一一此时存在两个相（乳清和凝胶/固 体），确定非混合样品的持水量，并记录TADM压力曲线显著变化时的时间点，该时间点表示 固相的开始（图14)。使用传导吸移管尖端吸取700μ1的体积(60yl/s)以感知样品的开始(并 由此感知吸取的开始）。
[0239] 结果和结论
[0240]发现了用尺测量的乳清长度与TADM压力曲线显著变化时的时间点（拐弯时间点） 之间的关联(R2 = 〇.79)(图14A和C)，所述乳清长度表示脱水收缩作用(脱乳清或持水量）。 [0241]使用不同菌株在微量滴定板中进行乳酸化是用于为例如凝固型酸乳酪和新鲜乳 酪选择菌株的合适工具，其中期望导致具有高持水量的乳凝胶的菌株。可以以自动方式从 例如Excel文件进行数据的抽取，并且基于所述结果，可以找到具有期望特性的乳凝胶样品 和相应的培养物、添加剂和培养条件。
[0242] 参考文献
[0243] Lee WJ,Lucey JA ( 20 10 ) Format i on and physical properties of yogurt.Asian-Aust J Anim Sci 23:1127-1136
[0244] Mezger T G(2006)The Rheology Handbook:For users of rotational and oscillatory rheometers,2nd revised edition,Hannover Network.
[0245] W02002073215
[0246] EP1614468
[0247] W02011107472
[0248] EP2009449
[0249] US6938504
[0250] W02008153387
【主权项】
1. 用于确定乳凝胶的剪切应力、凝胶硬度和持水量中至少之一的方法，所述方法包括： (i) 提供一个或更多个样品，每一个均包含样品容器和样品，其中至少一个样品是所述 乳凝胶； (ii) 在步骤（i)的所述样品的吸取和/或分配期间测量顶部空间压力以得到压力相对 于时间的数据；以及 (iii) 由步骤（ii)的压力相对于时间的数据确定所述乳凝胶的剪切应力、凝胶硬度和 持水量中至少一个； 其中 在步骤(iii)中通过将所述压力相对于时间的数据与剪切应力相关联来确定所述剪切 应力； 在步骤(iii)中通过将由非混合样品或离心样品得到的吸取曲线上的最小压力与复数 模量相关联来确定所述凝胶硬度； 以及 在步骤(iii)中通过由非混合样品或离心样品得到的吸取曲线上的拐弯时间点与持水 量相关联来确定所述持水量。2. 根据权利要求1所述的方法，其中剪切应力是确定的。3. 根据权利要求1所述的方法，其中凝胶硬度是确定的。4. 根据权利要求1所述的方法，其中剪切应力和凝胶硬度二者是确定的。5. 根据权利要求1所述的方法，其中持水量是确定的。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中对所述样品中的至少一些吸取和/或 分配多于一个吸取和/或分配循环。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述乳凝胶包含多于一个相，例如液 相和软固相。8. 根据权利要求6至7中任一项所述的方法，其中在第一吸取和/或分配循环之后以及 在第二吸取和/或分配循环之前混合所述样品，例如通过反复吸取和/或分配，或者通过引 入所述样品容器的混合装置。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述乳凝胶是发酵乳产品。10. 根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述乳凝胶是酸乳酪、酪乳、酸奶油 或新鲜乳酪。11. 根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中在步骤（ii)的至少一个吸取和/或 分配循环的所述测量之前对至少一些所述样品进行离心。12. 根据权利要求11所述的方法，其中使所述样品在尚未离心的情况下进行步骤（ii) 的第一吸取-分配循环，离心所述样品，然后对其进行步骤（ii)中的进一步的吸取-分配循 环。13. 根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中用于步骤（ii)的设备为Hamilton Robotics MicroLab Star〇14. 用于根据微生物有助于在其存在下制备的乳凝胶的剪切应力、凝胶硬度和/或持水 量的能力对所述微生物进行分级的方法，所述方法包括： (i)提供在至少一种微生物的存在下制备的乳凝胶的两个或更多个样品，每一个均包 含样品容器和样品； (ii) 在步骤（i)所述两个或更多个样品的吸取和/或分配期间测量顶部空间压力以得 到压力相对于时间的数据；以及 (iii) 根据在所述至少一种微生物的存在下制备的乳凝胶的相对压力相对于时间的数 据对所述微生物进行分级， 其中 剪切应力a)与吸取曲线上的压力相对于时间的数据成反比，并且b)与分配曲线上的压 力相对于时间的数据成正比； 凝胶硬度与由非混合样品或离心样品得到的所述吸取曲线上的最小压力成反比；以及 持水量与由非混合样品或离心样品得到的所述吸取曲线上的拐弯时间点成反比。15.根据权利要求14所述的方法，进一步包括步骤(iv):如果所述至少一种微生物有助 于在其存在下制备的乳凝胶具有相对高的剪切应力、相对高的凝胶硬度和/或相对高的持 水量，则选择所述至少一种微生物。
【文档编号】G01N35/10GK105939611SQ201480074400
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2014年12月9日
【发明人】梅泰·康托, 薇拉·波尔森, 贡纳尔·欧尔戈德, 乔治奥斯·特哈斯, 桑德拉·温德, 帕特里克·德克斯
【申请人】科.汉森有限公司