一种猕猴桃酵素及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种高抗氧化活性的猕猴桃酵素的制备方法，该配方以新鲜猕猴桃为原料，清洗去毛后保留果皮进行打浆，加入复合酶制剂（包括果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶）对猕猴桃浆进行酶解，以提高出汁率及生产效率，然后采用多菌株共生发酵技术及分级接种工艺，依次接入酵母菌、醋酸菌、乳酸菌对产品进行发酵、陈酿。最后通过硅藻土过滤、膜过滤等工艺以达到除菌目的，终止产品继续发酵，保证货架期稳定，同时最大限度保持活性成分及酶的活性。该法制得的酵素具有高抗氧化活性、酶类丰富、酶活高的特征。外观澄澈透明，风味酸甜柔和、果香清雅。
【专利说明】
一种猕猴桃酵素及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种酵素的加工生产方法，属于发酵制品加工领域。
【背景技术】
[0002] 酵素又称为酶，是生物体中所产生的具有催化作用的活性大分子。生物体内的各 种生理生化反应，几乎都要在酵素的催化作用下进行，人体的新陈代谢、能量摄取、成长 和繁殖等生命现象，都必须通过酵素的帮助才能完成。
[0003] 猕猴桃是一种高级的营养保健水果，含有大量抗衰老物质、多种氨基酸、矿物质、 猕猴桃碱活性物质和维生素等，其Vc含量达200mg/100g以上，是"果中之王"。猕猴桃酵素是 以新鲜猕猴桃浆为原料，经多菌株分级共生发酵而产生的，其代谢产物中含有丰富的超 氧化歧化酶、蛋白酶、多酚类物质、有机酸等活性成分，具有抗氧化、消炎抗菌、提高体液免 疫、美容养颜、促进新陈代谢等功效。
[0004] 目前市场上酵素种类繁多，如水果酵素、蔬菜酵素、综合酵素等，但制作工艺大致 相同。各类酵素依靠原材料表面携带的微生物或人为添加菌种，在发酵过程中繁殖形成一 定菌落结构、初级和次生代谢产物，其代谢产物中由于含有多种类、高活性的酶类而具有相 应功效。但市售酵素多为常温储藏，为了保证货架期产品未定，通常在产品出厂前需有灭菌 环节以终止发酵，常见灭菌方式为巴氏杀菌、UHT(高温瞬时杀菌)等，经杀菌后的产品，其酶 活大部分或者几乎全部丧失，同时也失去了其相应功效，因此，市售酵素实则多为发酵液或 者发酵调配饮料。但酵素产品若不杀菌，产品后期稳定性则无法控制，或只能通过冷链进行 销售，但冷链产品生命周期短，实现难度较大。
【发明内容】
[0005] 针对以上问题，本发明的目的是提供一种不需巴氏以及UHT(高温瞬时杀菌)杀菌， 同时具有高抗氧化活性、酶类丰富、酶活高、稳定性高的猕猴桃酵素及制备方法，该配方以 新鲜猕猴桃为原料，清洗去毛后保留果皮进行打浆，加入复合酶制剂(包括果胶酶、纤维素 酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶)对猕猴桃浆进行酶解，以提高出汁率及生产效率，然后采 用多菌株共生发酵技术及分级接种工艺，依次接入酵母菌、醋酸菌、乳酸菌对产品进行发 酵、陈酿。最后通过硅藻土过滤、膜过滤等工艺以达到除菌、同时最大限度保持酶活的目的。 该法制得的酵素具有高抗氧化活性、酶类丰富、酶活高的特征。
[0006] 本发明目的的技术由以下措施实现： 一种高抗氧化活性的猕猴桃酵素的制作方法包括以下步骤： (1) 预处理 挑选新鲜饱满，无虫害腐烂猕猴桃，然后对其进行清洗、脱毛、带皮打浆； (2) 酶解 向猕猴桃浆中添加0.1%-〇. 3%的复合酶制剂进行酶解，酶解温度37-40Γ，酶解时间1-2.5h； (3) 成分调整 猕猴桃浆在发酵前，应调整其成分，以利于糖类物质转化和维生素等多种营养成分的 保持，形成独特口味。猕猴桃根据品种及成熟度不同含糖量不同，范围约在5%_15%之间。为 了保证初始菌种酵母菌的最适生长条件，以及发酵初始糖度的统一性，向酶解后的猕猴桃 浆添加蔗糖，使其含糖量达20%，并用柠檬酸将pH值调至4-5; (4) 酒精发酵 称取占猕猴桃浆质量1%_3%的酵母粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37 °C-40 °C活化 40min-60min，然后植入猕猴桃浆中，搅拌均匀，密封，酒精发酵这一过程要避免与空气接 触，在25°C±2°C条件下发酵至酒精度大于3%结束，得一级发酵液； (5) 醋酸发酵 称取占猕猴桃浆质量2%_6%的醋酸菌粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37°C_40°C活化 40min-60min，然后植入猕猴桃一级发酵液中，温度保持35 °C ± 2 °C发酵，醋酸发酵过程中要 逐渐加大通风量，后期醋酸菌大量繁殖，氧化酶大量分泌，催化酒精与空气中的氧气结合形 成乙酸，发酵至pH为2.2-3时结束，得二级发酵液； (6) 乳酸发酵 称取占猕猴桃浆质量1%_3%的乳酸菌粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37°C-40°C活化 40min-60min，然后植入猕猴桃二级发酵液中，密封，温度保持30°C±2°C发酵至酸度不再升 高时发酵结束，得三级发酵液； (7) 板框过滤 发酵结束后，利用400目板框过滤对三级发酵液进行过滤，除去其中未分解的猕猴桃果 皮果肉浆渣，得发酵液； (8) 陈酿 将发酵液于阴凉处陈酿30-90天； (9) 娃藻土过滤 陈酿后利用硅藻土过滤除去陈酿过程中形成的冷凝固物及其他杂质； (10) 膜过滤 经硅藻土过滤后的发酵液继续进一步进行膜过滤，采用内压式中空纤维超滤系统，膜 材质为聚偏氟乙稀，孔径为〇.l-〇.25ym; (11) 灌装、包装 对膜过滤后的发酵液进行无菌灌装、包装，得最终成品猕猴桃酵素。
[0007] 本发明具有以下优点： 1.本发明解决了酵素制作过程中活性物质难以保留的技术难题(采用常规灭菌方法如 巴氏杀菌、UHT杀菌等会破坏活性物质）。膜过滤采用PVDF膜内压式中空纤维超滤系统，孔径 为0.1-0.25μπι。由于该法过滤于常温下进行，条件温和无成分破坏，因而特别适宜对热敏感 的物质，既可有效除菌，终止产品继续发酵，保证货架期产品稳定性，同时又最大限度保持 酵素中生物活性成分及酶的活性。
[0008] 2.本发明解决了猕猴桃果皮废物利用的问题。由于猕猴桃保留了果皮进行打浆， 果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶的加入使细胞壁在复合酶制剂的共同作用更易破 碎，低温下快速有效的提高出汁率，增加充填量，果皮利用率大大提高，同时也使其中的 果胶质、淀粉、蛋白质等成分有效地降解，使微生物更易代谢，加快发酵速率。
[0009] 3.本发明采用多菌株共生发酵技术，利用酵母菌、醋酸菌和乳酸菌的共生关系进 行发酵。首先，酵母菌将糖类物质转化为乙醇，醋酸菌再将乙醇氧化成醋酸，乳酸菌利用葡 萄糖生成乳酸。多菌株共生能将猕猴桃中糖类物质转化成人体易于吸收的乳酸、醋酸、葡萄 糖酸、柠檬酸等多种有机酸，也可将少量蛋白质转化成人体易于吸收的多肽和氨基酸类物 质，营养丰富。较单一菌种发酵而言，发酵产物种类更加丰富，发酵各阶段酶的活性也显著 提尚。
[0010] 4.本发明以新鲜猕猴桃为原料，由于猕猴桃中含有多种氨基酸、矿物质、活性物质 等，V c含量高。经发酵后的猕猴桃酵素中含有丰富的超氧化歧化酶、多酚类物质，具有高抗 氧化活性，同时具有消炎抗菌、提高免疫、促进新陈代谢等功效。风味上具有酸甜爽口、柔 和、果香清雅等特点。
【附图说明】
[0011]图1为两种猕猴桃酵素的ABTS自由基清除活性图示。
[0012] 图2为两种猕猴桃酵素的DPPH自由基清除活性图示。
[0013] 图3为两种猕猴桃酵素的还原力图示。
【具体实施方式】
[0014] 下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于 对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员 可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
[0015] 实施例1 一种高抗氧化活性的猕猴桃酵素的制作方法包括以下步骤： (1) 预处理 挑选新鲜饱满，无虫害腐烂猕猴桃，然后对其进行清洗、脱毛、带皮打浆； (2) 酶解 向猕猴桃浆中添加0.1%的复合酶制剂进行酶解，酶解温度37°C，酶解时间Ih;其中，复 合酶制剂是由质量比为3:2:2:2:1的果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶以及淀粉酶组 成； (3) 成分调整 猕猴桃浆在发酵前，对其进行成分调整，为了保证初始菌种酵母菌的最适生长条件，以 及发酵初始糖度的统一性，向酶解后的猕猴桃浆添加蔗糖，使其含糖量达20%，并用柠檬酸 将pH值调至4; (4) 酒精发酵 称取占猕猴桃浆质量1%的酵母粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37 °C活化40min，然后植 入猕猴桃浆中，酒精发酵这一过程要避免与空气接触，加入活化的酵母菌后搅拌均匀，密 封，在25°C条件下发酵至酒精度大于3%结束，得一级发酵液； (5) 醋酸发酵 称取占猕猴桃浆质量2%的醋酸菌粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37 °C活化40min，然后 植入猕猴桃一级发酵液中，温度保持35°C发酵至pH为3时结束，得二级发酵液； (6) 乳酸发酵 称取占猕猴桃浆质量1%的乳酸菌粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37 °C活化40min，然后 植入猕猴桃二级发酵液中。密封，温度保持30°C发酵至酸度不再升高时发酵结束，得三级发 酵液； (7) 板框过滤 发酵结束后，利用400目板框过滤对三级发酵液进行过滤，除去其中未分解的猕猴桃果 皮果肉浆渣，得发酵液； (8) 陈酿 将发酵液放置于阴凉处陈酿30天，以降低刺激性酸味，使口味更加柔和； (9) 娃藻土过滤 陈酿后利用硅藻土过滤除去陈酿过程中形成的冷凝固物及其他杂质； (10) 膜过滤 经硅藻土过滤后的发酵液继续进一步进行膜过滤，采用内压式中空纤维超滤系统，膜 材质为PVDF(聚偏氟乙烯），孔径为0.1-0 ·25μπι; (11) 灌装、包装 对膜过滤后的发酵液进行无菌灌装、包装，得最终成品猕猴桃酵素。
[0016] 实施例2 一种高抗氧化活性的猕猴桃酵素的制作方法包括以下步骤： (1) 预处理 挑选新鲜饱满，无虫害腐烂猕猴桃，然后对其进行清洗、脱毛、带皮打浆； (2) 酶解 向猕猴桃浆中添加0.1%的复合酶制剂进行酶解，酶解温度37°C，酶解时间Ih;其中，复 合酶制剂是由质量比为8:4:3:3:2的果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶以及淀粉酶组 成； (3) 成分调整 猕猴桃浆在发酵前，对其进行成分调整，为了保证初始菌种酵母菌的最适生长条件，以 及发酵初始糖度的统一性，向酶解后的猕猴桃浆添加蔗糖，使其含糖量达20%，并用柠檬酸 将pH值调至4; (4) 酒精发酵 称取占猕猴桃浆质量1%的酵母粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37 °C活化40min，然后植 入猕猴桃浆中，酒精发酵这一过程要避免与空气接触，加入活化的酵母菌后搅拌均匀，密 封，在25°C条件下发酵至酒精度大于3%结束，得一级发酵液； (4)酒精发酵 称取原料猕猴桃浆1%的酵母粉，用浓度为5%的蔗糖溶液37°C活化40min，然后植入猕猴 桃浆中，酒精发酵这一过程要避免与空气接触，加入活化的酵母菌后搅拌均匀，密封，在25 °C条件下发酵至酒精度大于3%结束，得一级发酵液。
[0017] (5)醋酸发酵 称取占猕猴桃浆质量2%的醋酸菌粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37 °C活化40min，然后 植入猕猴桃一级发酵液中，温度保持35°C发酵至pH为3时结束，得二级发酵液； (6) 乳酸发酵 称取占猕猴桃浆质量1%的乳酸菌粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37 °C活化40min，然后 植入猕猴桃二级发酵液中。密封，温度保持30°C发酵70天。当酸度不再升高时发酵结束，得 三级发酵液； (7) 板框过滤 发酵结束后，利用400目板框过滤对三级发酵液进行过滤，除去其中未分解的猕猴桃果 皮果肉浆渣，得发酵液； (8) 陈酿 将发酵液放置于阴凉处陈酿90天，以降低刺激性酸味，使口味更加柔和； (9) 娃藻土过滤 陈酿后利用硅藻土过滤除去陈酿过程中形成的冷凝固物及其他杂质； (10) 膜过滤 经硅藻土过滤后的发酵液继续进一步进行膜过滤，采用内压式中空纤维超滤系统，膜 材质为PVDF(聚偏氟乙烯），孔径为0.1-0 ·25μπι; (11) 灌装、包装 对膜过滤后的发酵液进行无菌灌装、包装，得最终成品猕猴桃酵素。
[0018] 为进一步验证猕猴桃酵素产品的抗氧化活性，本发明以实施例1制得样品（膜过滤 猕猴桃酵素)作为样品1，巴氏杀菌猕猴桃酵素作为样品2,抗氧化剂BHT作为阳性对照。研究 其总酚含量、ABTS自由基清除能力、还原力的大小。三者是表征抗氧化能力的重要指标，总 酚含量越高，自由基清除能力越强，还原力越强，抗氧化活性越高。
[0019] 1总酚含量的测定 (1)测定方法 标准曲线绘制：将没食子酸标准品采用梯度稀释法稀释至不同浓度:0.0625、0.125、 0.25、0.5、1 mg/mL。取各浓度标准溶液0.1 mL，分别加入20 mg/mL的碳酸钠溶液2 mL。〗 min后，加入0.9 mL对倍稀释的Folin-Ciocalteu溶剂，反应30 min后，测定其在750 nm处的 吸光度值。以吸光度值为y，没食子酸浓度为X绘制总酚含量标准曲线，经线性拟合得回归 方程y=l. 0082X-0.0131，（R2=O. 9997)。样品测定，计算没食子酸当量。
[0020] (2)结果如表1所示： 表1两种猕猴桃酵素中总酚含量
2 ABTS自由基清除活性测定 (1)测定方法 取19 mg ABTS自由基与3.3 mg过硫酸钾反应，在室温、避光条件下静置过夜。使用前加 水稀释使其在734 nm波长下吸光度为0.70±0.02,形成ABTS工作液。将30 ml含不同浓度受 试物的溶液与2.97 mL ABTS自由基工作液混合，避光放置30 min后，在734 nm处测定吸光 度，计算清除率。以BHT作为阳性对照，同时设立阴性对照。
[0021] ABTS自由基清除率S%计算公式如下：
式中一待测样品的吸光度值;^M一阴性对照的吸光度值。
[0022] (2)结果 两种猕猴桃酵素及阳性对照BHT对ABTS自由基清除率如图1所示，由图可知，两种酵素 虽然自由基清除能力都不及阳性对照ΒΗΤ，但样品1(膜过滤除菌）的清除能力显著高于样品 2(巴氏杀菌），当浓度为1.4mg/mL时，膜过滤除菌酵素清除率超60%，而巴氏杀菌酵素清除率 约40%，体现了膜过滤猕猴桃酵素具有较好ABTS自由基清除活性。
[0023] 2 DPPH自由基清除活性测定 (1)测定方法 取DPPH 1.18 mg溶解于甲醇中，使其终浓度为0.3 mM，避光室温保存。将1.0 mL含不同 浓度受试物的溶液与2.0 mLDPPH自由基甲醇溶液混合。避光静置30min后于520 nm下测定 各反应液的吸光值，并计算清除率。以BHT作为阳性对照，同时设立阴性对照。
[0024] DPPH自由基清除率S %计算公式如下：
式中:一待测样品的吸:光度值;一对·照i且样品的吸:光度值。
[0025] (2)测定结果 两种猕猴桃酵素及阳性对照BHT对DPPH自由基清除率如图2所示，由图可知，样品1 (膜 过滤除菌）的清除能力也显著高于样品2(巴氏杀菌），这与ABTS自由基清除能力排序、总酚 含量排序一致。体现了膜过滤猕猴桃酵素除对ABTS自由基外兼具较好的DPPH自由基清除活 性。
[0026] 3还原力测定 (1)测定方法 将样品按照梯度浓度溶解于I HiL甲醇中，依次加入2.5 mL PBS(0.2 M，pH 6.6)溶液 和2.5 mL 1%铁氰化钾溶液。混匀后置于50°C水浴中20 min后快速冷却，再加入2 mL 10%三 氯乙酸溶液，以2 000 r/min的转速离心15 min，取上清液2.5 mL。依次加入2.5 mL蒸馏水， 0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，在700 nm下测定其吸光度值[10]，以Vc作为阳性对照，同时设 立阴性对照。
[0027] (2)结果 两种酵素的还原力情况如图3所示。可见，样品1(膜过滤）的还原力仍明显高于样品2 (巴氏杀菌)的还原力。膜过滤除菌猕猴桃酵素具有很好的还原能力，试样浓度在0 · 9mg/mL~ 1.5mg/mL范围内时，体现了与Vc相当的还原力。
[0028] 综上，膜过滤除菌酵素相对于巴氏杀菌酵素，总酚含量更高，自由基清除能力越 强，还原力更强强，因此可证明其抗氧化活性越强，活性物质保留得更好。
[0029] 为进一步验证猕猴桃酵素产品的酶活，本发明以实施例1制得样品（多菌株共生发 酵酵素)作为样品1，自然发酵酵素作为样品2,研究其发酵过程中SOD(超氧化物歧化酶）的 活性变化。检测依据参照GB/T 5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测 定》，检测结果如表2所示： 表2不同发酵方式过程中SOD活性平均变化对比(S0D活性U/lOOmL)
由表2可知，在猕猴桃浆发酵过程中植入酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等微生物菌的多菌株 共生发酵方式其发酵各阶段SOD活性远高于自然发酵，且在共生发酵过程中，SOD呈高活性 状态持续时间远长于自然发酵。也进一步验证了该发明酵素的高酶活与高抗氧化活性。
[0030] 对实施例2所制得产品也做了如实施例1产品同样的抗氧化活性以及酶活性的试 验，其试验结果与实施例1实验结果并无明显区别，故在此不作敷述。
[0031] 由此可知，本发明所制得的产品不需巴氏以及UHT(高温瞬时杀菌)杀菌，同样具有 1?抗氧化活性、酶类丰富、酶活1?、稳定性1?等优点D
【主权项】
1. 一种猕猴桃酵素的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤： (1) 预处理 挑选新鲜饱满，无虫害腐烂猕猴桃，然后对其进行清洗、脱毛、带皮打浆； (2) 酶解 向猕猴桃浆中添加0.1%-0.3%的复合酶制剂进行酶解，酶解温度37-40Γ，酶解时间1-2.5h； (3) 成分调整 向酶解后的猕猴桃浆添加蔗糖，使其含糖量达20%，并用柠檬酸将pH值调至4-5; (4) 酒精发酵 称取占猕猴桃浆质量1%_3%的酵母粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37°C-40°C活化 40min-60min，然后植入猕猴桃浆中，搅拌均匀，密封，在25°C ± 2°C条件下发酵至酒精度大 于3%结束，得一级发酵液； (5) 醋酸发酵 称取占猕猴桃浆质量2%_6%的醋酸菌粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37 °C -40 °C活化 40min-60min，然后植入猕猴桃一级发酵液中，温度保持35 °C ± 2 °C发酵，醋酸发酵过程中要 逐渐加大通风量，后期醋酸菌大量繁殖，氧化酶大量分泌，催化酒精与空气中的氧气结合形 成乙酸，发酵至pH为2.2-3时结束，得二级发酵液； (6) 乳酸发酵 称取占猕猴桃浆质量1%_3%的乳酸菌粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37 °C -40 °C活化 40min-60min，然后植入猕猴桃二级发酵液中，密封，温度保持30°C±2°C发酵至酸度不再升 高时发酵结束，得三级发酵液； (7) 板框过滤 发酵结束后，利用400目板框过滤对三级发酵液进行过滤，除去其中未分解的猕猴桃果 皮果肉浆渣，得发酵液； (8) 陈酿 将发酵液于阴凉处陈酿30-90天； (9) 娃藻土过滤 陈酿后利用硅藻土过滤除去陈酿过程中形成的冷凝固物及其他杂质； (10) 膜过滤 经硅藻土过滤后的发酵液继续进一步进行膜过滤，采用内压式中空纤维超滤系统，膜 材质为聚偏氟乙稀，孔径为〇.l-〇.25ym; (11) 灌装、包装 对膜过滤后的发酵液进行无菌灌装、包装，得最终成品猕猴桃酵素。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述复合酶制剂由果胶酶、纤维素酶、半纤 维素酶、蛋白酶以及淀粉酶组成。
【文档编号】A23L33/14GK105962343SQ201610309314
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】赵志峰, 罗雅杰, 谢王俊, 吕芬, 高颖
【申请人】成都兴食尚食品研发设计中心（有限合伙）