一种有效杀灭超声杀菌过程中产生的活的不可培养状态微生物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种有效杀灭超声杀菌过程中产生的活的不可培养状态微生物的方法，包括：将金黄色葡萄球菌用无菌生理盐水洗涤后涡旋到弱酸性电位水中，立刻对该细菌悬浮液进行超声处理。本发明提供的方法，是将金黄色葡萄球菌菌体涡旋到弱酸性电位水中，然后再进行超声处理，大大降低了活的不可培养状态细菌的比例。本发明的实验证明，利用超声波联合弱酸性电位水技术处理细菌，可有效降低超声杀菌过程中活的不可培养状态细菌的比例，增强了超声杀菌工艺的安全性，有利于推广超声杀菌技术的产业应用。
【专利说明】
一种有效杀灭超声杀菌过程中产生的活的不可培养状态微生物的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种有效杀灭超声杀菌过程中产生的活的不可培养状态微生物的方法，有利于降低活的不可培养状态细菌的比例，优化超声杀菌工艺，进一步推广超声杀菌技术的产业应用，属于食品工程技术领域。
【背景技术】
[0002]作为新兴的非热杀菌技术，超声杀菌具有能耗低、时间短等特点，与其他非热杀菌技术相比，超声波在杀灭微生物过程中，能有效降低亚致死细胞造成的潜在威胁，目前在废水处理、饮用水消毒等领域已被广泛应用。超声波用于食品杀菌除了能有效保存食品营养成分和天然色、香、味外，还能够对食品产生诸如均质、催陈、裂解大分子物质等多种作用，从而能更好的提高和完善食品品质。但是，研究表明超声处理能够诱导细菌形成活的不可培养状态。活的不可培养状态的细菌无法在常用的培养基上正常生长繁殖，能够逃避常规检测而造成假阴性的结果，但仍然具有生命体征和代谢活性，在适宜的条件下可复苏再生长，重新获得感染能力，成为危害食品安全的“隐性污染源”，使超声杀菌技术在食品加工领域的应用面临挑战。
[0003]有效杀灭超声处理过程中产生的活的不可培养状态细菌，是提高超声杀菌效果，增强超声处理食品的安全性的重要手段，然而目前关于超声波在食品杀菌中的应用只局限于评估超声波完全杀灭的细菌，而未涉及超声处理过程中产生的活的不可培养状态的细菌。本发明采用超声波联合弱酸性电位水技术有效杀灭活的不可培养状态的细菌，降低超声处理后活的不可培养状态细菌在适宜条件下复苏再生长的可能性。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种有效杀灭超声杀菌过程中产生的活的不可培养状态微生物的方法，降低超声处理后活的不可培养状态细菌在适宜条件下复苏再生长的可能性。
[0005]—种有效杀灭超声杀菌过程中产生的活的不可培养状态微生物的方法，包括:将金黄色葡萄球菌用无菌生理盐水洗涤后涡旋到弱酸性电位水中，立刻对该细菌悬浮液进行超声处理。
[0006]本发明提供的方法，是将金黄色葡萄球菌菌体涡旋到弱酸性电位水中，然后再进行超声处理，大大降低了活的不可培养状态细菌的比例。本发明的实验证明，利用超声波联合弱酸性电位水技术处理细菌，可有效降低超声杀菌过程中活的不可培养状态细菌的比例，增强了超声杀菌工艺的安全性，有利于推广超声杀菌技术的产业应用。
[0007]优选地，所述无菌生理盐水的质量分数为0.8?0.9%。进一步优选为0.85%。
[0008]优选地，所述弱酸性电位水的有效氯浓度为I?3mg/L。进一步优选为2mg/L。
[0009]优选地，所述弱酸性电位水的pH为6?6.5，ORP为850?880mV;进一步优选地，所述弱酸性电位水的pH=6.I，ORP = 867.4mV。
[0010]更进一步优选地，所述弱酸性电位水由循环浓缩弱酸性电位水生成器电解0.1%HCl和0.03%NaCl溶液Imin制备而得。
[0011]与传统电位水生成器相比，循环浓缩弱酸性电位水生成器通过加入一个循环装置将生成的电位水重新压入电解槽中进行重复电解得到循环浓缩弱酸性电位水。通过电解0.I %HCl和0.03 %NaCl溶液Imin，制备得到弱酸性电位水(pH = 6.I，ORP = 867.4mV，ACC =SOmg/LhpH-ORP测定仪用于测定弱酸性电位水的pH和ORP值，有效氯测定仪测定弱酸性电位水有效氯浓度(ACC)，通过蒸馏水梯度稀释得到所需的弱酸性电位水浓度。
[0012]常规的超声杀菌是细菌悬浮于0.85%生理盐水中，然后对菌悬液进行超声处理，本发明用弱酸性电位水替换生理盐水，利用其强氧化性不仅能够提高杀菌效率，还能有效降低超声杀菌过程中产生的活的不可培养状态的细菌。
[0013]优选地，所述超声处理的条件为:处理频率为15?25kHz，处理功率为300?500W，处理时间为Ι-lOmin，处理温度15?25°C。
[0014]进一步优选地，所述超声处理的条件为:处理频率为20kHz，处理功率为400W，处理时间为Imin，处理温度为20 °C。
[0015]或:处理频率为20kHz，处理功率为400W，处理时间为1min，处理温度为20 V。
[0016]或:处理频率为20kHz，处理功率为400W，处理时间为5min，处理温度20 V。
[0017]该优选超声条件与弱酸性电位水悬浮之间具有更好的协同效果，最优选地组合为:
[0018]所述弱酸性电位水的pH = 6.1，0RP = 867.4mV，ACC = 2mg/L;所述超声处理的条件为:处理频率为20kHz，处理功率为400W，处理时间为Imin，处理温度为20 °C。该条件下可将金黄色葡萄球菌的活的不可培养状态菌比例从30%左右降低至5%左右。
[0019]在超声联合弱酸性电位水处理后，还包括以下步骤:检测弱酸性电位水添加前后的金黄色葡萄球菌的活菌数和可培养菌数;其中，检测金黄色葡萄球菌活菌数采用PI/cFDA双染法，检测金黄色葡萄球菌可培养菌数采用平板计数法。
[0020]本发明的实验证明，本发明开发了一种有效杀灭超声杀菌过程中产生的活的不可培养状态微生物的方法，降低超声处理后活的不可培养状态细菌在适宜条件下复苏再生长的可能性，进一步优化了超声杀菌工艺，有利于推广超声杀菌技术的产业应用。
【具体实施方式】
[0021 ]下面结合具体实施例，进一步说明本发明。
[0022]实施例1
[0023]一超声联合弱酸性电位水处理
[0024](I)细菌悬浮液制备
[0025]将金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923接种于普通肉汤培养基中，37°C摇床培养至对数生长期。
[0026]实验组:采用质量分数为0.85%的无菌生理盐水洗涤对数生长期的菌体两次，然后将菌体重悬到2mg/mL的弱酸性电位水中，使菌体浓度约为108CFU/mL，作为实验组细菌悬浮液；
[0027]对照组:采用质量分数为0.85%的无菌生理盐水洗涤对数生长期的菌体两次，然后将菌体重悬到0.85%的无菌生理盐水中，使菌体浓度约为108CFU/mL，作为对照组细菌悬浮液；
[0028](2)超声处理
[0029]用超声波SCIENTZ-1ID型杀菌装置立即对金黄色葡萄球菌悬浮液进行处理，具体步骤:将30mL细菌悬浮液装入玻璃超声管中，直径为1mm的超声探头深入液面2cm，将超声管放入20 °C水浴锅中，对菌液进行超声处理，处理频率为20kHz，处理功率为100W，处理时间为lmin，最后使用中和剂(0.5%硫代硫酸钠和0.85%氯化钠溶液)停止杀菌，得到处理后菌液。
[0030]二检测
[0031](I)活菌数测定方法
[0032]采用PI/cFDA双染法:具体步骤:实验组和对照组的金黄色葡萄球菌菌液与30_01/1的？1在冰浴中孵育10111丨11，然后与50_01/1的0?04在37°(:孵育10111丨11，4°(:、6000\8离心1min，用0.85 %的无菌生理盐水洗涤去除过量的染料，孵育完成后用流式细胞仪进行分析，每个样品收集20000个细菌检测。
[0033](2)可培养菌数测定方法
[0034]采用平板计数法:具体步骤:参照GB4789.2-2010方法，将实验组和对照组的金黄色葡萄球菌菌液用0.85%无菌生理盐水进行梯度稀释，取稀释样ImL于灭菌平皿中，倒入约20mL PCA培养基摇匀，待培养基凝固后倒置于37°C培养箱中培养24h，然后记录菌落数。
[0035](3)活的不可培养状态细菌
[0036]采用上述的方法分别测定实验组和对照组的活菌数和可培养菌数，从而计算活的不培养状态菌数(活菌数一可培养菌数)。
[0037]结果如下:实验组金黄色葡萄球菌活菌比例为5.69%,可培养菌比例为0.52%，活的不可培养状态菌比例为5.17%。对照组金黄色葡萄球菌活菌比例为94.32%，可培养菌比例为63.10%，活的不可培养状态菌比例为31.22%。由此可见，本发明的方法能有效杀灭超声杀菌过程中产生的活的不可培养状态微生物，降低了活的不可培养状态细菌的比例，增强了超声杀菌工艺的安全性。
[0038]实施例2
[0039]一超声联合弱酸性电位水处理
[0040](I)细菌悬浮液制备
[0041 ]与实施例1中的一的步骤(I)的方法相同。
[0042](2)超声诱导
[0043]与实施例1中的一的步骤(2)的方法基本相同，仅将处理时间变为lOmin。
[0044]二检测
[0045]与实施例1中的二的方法相同。
[0046]结果如下:实验组金黄色葡萄球菌活菌比例为0.09%，可培养菌比例为0.021%，活的不可培养状态菌比例为0.069%。对照组金黄色葡萄球菌活菌比例为89.40%，可培养菌比例为43.65%,活的不可培养状态菌比例为45.75 %。由此可见，本发明的方法在联合处理1min时杀灭了很大比例活的不可培养状态细菌，使活的不可培养状态的金黄色葡萄球菌的比例降至0.069%。
[0047]本实施例同实施例1相比，杀灭活的不用可培养状态细菌的效果更好。
[0048]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种有效杀灭超声杀菌过程中产生的活的不可培养状态微生物的方法，其特征在于，包括:将金黄色葡萄球菌用无菌生理盐水洗涤后涡旋到弱酸性电位水中得悬浮液，立刻对悬浮液进行超声处理。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述无菌生理盐水的质量分数为0.8?0.9%。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述弱酸性电位水的有效氯浓度为I?3mg/L04.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述弱酸性电位水的pH为6?6.5，ORP为850?880mVo5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述超声处理的条件为:处理频率为15?25kHz，，处理功率为300?500W，处理时间为Ι-lOmin，处理温度15?25°C。6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述超声处理的条件为:处理频率为20kHz，处理功率为400W，处理时间为Imin，处理温度为20 °C。7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述超声处理的条件为:处理频率为20kHz，处理功率为400W，处理时间为1min，处理温度为20 °C。8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述超声处理的条件为:处理频率为20kHz，处理功率为400W，处理时间为5min，处理温度20 °C。
【文档编号】A23L3/358GK105995375SQ201610365148
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】丁甜, 李娇, 廖新浴, 刘东红, 叶兴乾, 陈健初, 胡亚芹, 陈士国
【申请人】浙江大学