包含乳酸菌和保护剂的新型组合物的制作方法

包含乳酸菌和保护剂的新型组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于乳酸菌的干燥组合物，并且具体地涉及包含109至1013cfu/g组合物的乳酸菌细胞的干燥组合物，其中所述组合物的特征在于其还包含下列含量的保护剂(以下所有量的保护剂均相对于所述组合物中1g乳酸菌细胞确定)：6?9g海藻糖、0.1?1g菊粉和0.5?3g水解酪蛋白,并且其不包含藻酸盐。所述组合物具有改善的感兴趣细胞的储存稳定性。在含有藻酸盐和不含藻酸盐的组合物间进行了比较试验，并且已经发现就稳定性而言在含藻酸盐或不含藻酸盐的组合物之间基本上没有差异。此外，本发明涉及制备干燥乳酸菌组合物的方法。
【专利说明】
包含乳酸菌和保护剂的新型组合物
[0001 ]本申请是申请日为2012年6月30日、
【申请人】为科.汉森有限公司、发明名称为"新型 组合物"的中国专利申请201280032195.7的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及用于乳酸菌的干燥组合物的领域，制备干燥乳酸菌组合物的方法以及 可以通过所述方法制备的组合物。
【背景技术】
[0003] 诸如例如微生物的细胞涉及大量工业相关过程。例如细菌培养物，特别是通常归 类为乳酸菌(LAB)的细菌的培养物在制备所有发酵乳制品、奶酪和黄油中是至关重要的。此 类细菌的培养物可以称为起子培养物并且它们通过执行许多功能而将特定的特征赋予各 种乳制品。
[0004] 许多乳酸菌已知具有益生性质（即，它们当被摄入时对人类具有有益的健康效 应）。在大多数情况下，必要的是微生物在长期储存后保持活力，以便这些微生物在摄取时 发挥它们的有益效应。已经做出尝试，其中冻干的细菌与充当潮湿屏障的添加剂或充当冷 冻细胞所需要的保护剂(所谓的冷冻保护剂)混合。在使它们更稳定的尝试中已经向微生物 添加了多种类型的添加剂。
[0005] 对于一些应用-可以说优选应当具有储存非常稳定的乳酸菌组合物/制剂。
[0006] 例如-如果LAB组合物与奶粉混合以制备合适的婴儿奶粉，通常需要储存非常稳定 的LAB组合物-其根本原因是婴儿奶粉产品本身通常是储存非常稳定的并且可以在其实际 制造日期后相当长的时间给予婴儿。因此，如果婴儿奶粉在其实际制造日期后例如30周(或 更晚)给予婴儿-显然掺入到婴儿奶粉中的LAB组合物应当是储存十分稳定的以便维持LAB 细胞的活力。
[0007] W02010/138522A2(Advanced Bionutrition Corporation)记载了LAB细胞培养组 合物，其被说明为可用于掺入到婴儿奶粉产品中。优选的组合物包含藻酸盐、菊粉、海藻糖 和水解蛋白质（参见第[0094]段表1，）。
[0008] 可以说，W02010/138522A2的表1的LAB组合物包含相对高的量的可以称为保护剂 的物质-即，可以帮助提高乳酸菌细胞的储存稳定性的试剂。
[0009] 例如-可以说W02010/138522A2的表1的LAB组合物包含相对高的量的海藻糖。
[0010] W02010/138522A2 的第[0097]段写到：
[0011 ] "嗜酸乳杆菌(Lactobacillus Acidophilus)(100g来自实验室发酵收获物的冷冻 浓缩物)在37 °C融化。蛋白水解产物预混料(100g，表1)…"
[0012]如技术人员已知的那样，LAB细胞浓缩物，如该段落[0097]中所述，可以经常包含 约10%的细胞干物质。在这种假设下-可以说在此段落[0097]中描述的干燥LAB组合物是包 含比LAB细胞本身约10倍多保护剂的LAB组合物-根据本领域技术，这可以被认为是具有相 对高的量的保护剂的LAB组合物。
[0013] 这种具有相对高的量的保护剂的LAB组合物所存在的问题可以是它们本身经常十 分难以适宜地干燥-例如不能显著地使相关的LAB细胞失活。
[0014] W02010/138522A2记述了用于干燥例如段落[0097]中所述的LAB组合物的方法，如 上所述所述LAB组合物可以被认为是具有相对高的量的保护剂的LAB组合物。
[0015] W02010/138522A2的第[0081]段写到（着重部分被标明）：
[0016] "用于保存生物活性微生物诸如活的或减毒的微生物的典型方法包括冷冻和真空 条件的组合，其可以导致膜损害和细胞成分的变性。现有技术教导使用较高真空压力（例 如，小于lOOTorr)，添加特定冷冻保护剂，获得稠厚溶液(浆)的浓缩步骤，和/或较高的初始 温度以防止冻结。"
[0017] W02010/138522A2的此段落[0087]可以被认为提供了现有技术关于合适的本文相 关干燥过程的通常所教导内容的总体概述。
[0018] 本文可以说相关的是注意到TO2010/138522A2中直接和明确地记载的干燥方法例 如不涉及冷冻步骤以形成固体冷冻颗粒/小丸。
[0019] TO2010/138522A2(Advanced Bionutrition Corporation)记述了包含藻酸盐、菊 粉、海藻糖和水解蛋白质的细胞培养组合物(参见第[0094]段表1)。
[0020] 然而，仍然存在对能够承受提高的湿度/高水活度的改良的组合物的需求。

【发明内容】

[0021] 本发明要解决的问题涉及提供一种用于制备包含乳酸菌(LAB)细胞并且可以被认 为是相对高的量的保护剂的干粉组合物的新方法以及提供在潮湿条件下长时间地储存稳 定的组合物。
[0022]在优选的实施方案中，本发明涉及包含109_1013cfu/g组合物的乳酸菌细胞的干燥 组合物，其中所述组合物的特征在于其还包含下列量的保护剂（以下所有量的保护剂均相 对于所述组合物中lg乳酸菌细胞确定）：
[0023] (i):6_9g 海藻糖，
[0024] 0.1-lg 菊粉和
[0025] 0.5_3g水解酪蛋白，并且其特征在于
[0026]其不包含藻酸盐。
[0027]参照本文中的工作实施例，其中证明了LAB细胞鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus)LG.G?(其可从Chr. Hansen A/S，Hoersholm，Denmark商购）的储存稳定性在如 本文所述的组合物中被显著提高。本发明人还采用LAB细胞干酪乳杆菌（L.ca Sei)43.2⑩ (类干酪乳杆菌类干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei))进行了实验-并且对于如本文所述的干燥组合物也证明了良好的储存稳定性。
[0028] 如在本文工作实施例中所说明的，如本文所述的新型组合物导致细胞的提高的储 存稳定性。具体地，所述组合物在提高的湿度/高水活度下更为稳定。本发明提供了在具有 0.3的水活度的婴儿奶粉中包含LAB的组合物，其中当在30%RH在35°C保存并且在13周后测 试时活性细胞的对数损失〈2.5。优选地，在17周后组合物活性细胞的对数损失〈2.5。
[0029] 如在实施例中所证明，就稳定性而言，在含有或不含有藻酸钠的组合物之间基本 上没有差异。然而，对于已经接受热处理的含有藻酸钠的组合物，与没有藻酸钠的组合物相 反，热处理对稳定性有负面影响。
[0030] 因此，本发明的一个方面涉及包含109-1013Cfu/g组合物的乳酸菌细胞的干燥组合 物，其中所述组合物的特征在于其还包含相对高的量的保护剂，如下面进一步所详细说明 的。优选地，出于随后进一步详细解释的原因，所述组合物不包含藻酸盐诸如藻酸钠。
[0031] 如本文所讨论-如本文所述的干燥组合物可以用于例如具有高水活度(aw = 0.3) 的婴儿奶粉或用于其他高aw应用如谷类、坚果麦片条(muesli bars)或巧克力中。
[0032]该方案基于以下:本发明人已经利用大量不同的用于干燥这些组合物的参数进行 了广泛的研究并且认识到通过使用如本文所述的干燥方法，能够以有效方式适宜地干燥这 些组合物，所述方式可以采用相对大量的LAB组合物以工业规模应用-即，其可以以相对低 的成本制备并且干燥可以在相对短的时期内（例如15-30小时内）进行。
[0033] 如上所讨论-W02010/138522A2中直接和明确地记载的干燥方法例如不涉及冷冻 步骤以形成固体冷冻颗粒/小丸。如本文所述的干燥方法还包括与W02010/138522A2中直接 和明确地记载的不同的其他方法步骤。
[0034]例如-在本发明的第一方面的方法的初次干燥步骤(e)中使用0.7-2毫巴(mbar) (对应于525mT0RR-1500mT0RR)的真空压力。如本文所讨论-此0 · 7-2mbar的真空压力范围的 使用可以视作本文中本发明的方法的必要要素。如本文所讨论-其仅通过在步骤(e)中在此 0.7-2mbar的真空压力范围内工作就得到了本文令人满意的用于干燥本文相关LAB的方法。 [0035]在W02010/138522A2或任何其他本文相关的本发明人已知的现有技术中没有记载 或提示如在本文步骤(e)中所进行的此0.7-2mbar范围的使用。
[0036]简言之，提出本发明的干燥方法代表了相对于例如W02010/138522A中直接和明确 地记载的干燥方法的显著改进。
[0037]因此，本发明的第一个方面涉及一种制备干粉组合物的方法，所述干粉组合物包 含：
[0038] (i):108-1014cfu/g组合物的乳酸菌(LAB)细胞;和
[0039] (ii)2g_40g的量的一种或多种保护剂-其中一种或多种保护剂的量相对于该干燥 组合物中lg乳酸菌细胞确定，
[0040]其中所述制备干粉组合物的方法包括以下步骤：
[0041 ] (a):发酵所述LAB细胞和收获所述细胞以得到包含所述LAB细胞和水的LAB细胞浓 缩物-其中所述浓缩物包含1 〇8_l〇14cf u/g浓缩物干物质的乳酸菌(LAB)细胞；
[0042] (b):将适当量的一种或多种保护剂与所述LAB细胞浓缩物混合以形成浆料-其中 所述浆料包含2g_40g的量的一种或对于保护剂-其中一种或多种保护剂的量相对于所述浆 料中lg乳酸菌细胞确定，并且一种或多种保护剂和乳酸菌细胞的量两者均以浆料中的干物 质被测量；
[0043] (c):冷冻所述浆料以形成固体冷冻颗粒/小丸；
[0044] (d):用2kg/m2-50kg/m2的冷冻颗粒/小丸装载托盘以在所述托盘上得到本文相关 的材料；
[0045] (e):在其中材料的温度不会达到那么高以致超过75%的所述LAB细胞失活的温度 下，在0.7-2毫巴(mbar)的真空压力下初次干燥所述托盘上的材料，持续一时间段直至步骤 (b)的浆料的至少90%的水被移除；以及
[0046] (f):在其中材料的温度不会达到那么高以致超过75%的所述LAB细胞失活的温度 下，在0.01-0.6毫巴(mbar)的真空压力下二次干燥步骤(e)的材料，持续足以将水活度(aw) 减少至小于0.30的时间段，从而获得所述干粉组合物，所述干粉组合物包含：
[0047] (i): 108-1014cf u/g组合物的乳酸菌(LAB)细胞;和
[0048] (ii)2g_40g的量的一种或多种保护剂-其中一种或多种保护剂的量相对于所述干 燥组合物中lg乳酸菌细胞确定。
[0049] 术语"保护剂"在本文中应当理解为可以有助于改善感兴趣乳酸菌细胞的储存稳 定性的任何试剂。关于如本文所述的干粉组合物和干燥这样的干粉组合物的方法-术语"保 护剂"还可以被视作所述干粉组合物本身（其不是乳酸菌(LAB)细胞本身）中存在的任何试 剂。
[0050] 在本文上下文中如技术人员所理解-术语"其中一种或多种保护剂的量相对于所 述干燥组合物中lg乳酸菌细胞确定意指如果第一方面的干粉组合物例如包含2g乳酸菌 细胞，则所述干粉组合物还应当包含4g_80g的一种或多种保护剂-因为第一方面的方法提 到应当存在2g-40g的一种或多种保护剂/lg乳酸菌细胞。
[0051] 同样，在本文上下文中如技术人员所理解-术语"以下所有量的保护剂均相对于组 合物中lg活性乳酸菌细胞确定"意指如果所述组合物例如包含2g乳酸菌细胞，则所述组合 物应当例如还包含4_8g蔗糖。
[0052]由于所述组合物是干粉组合物-对于技术人员显然的是对组合物的单一组分（例 如乳酸菌细胞和保护剂)所确定的量以干物质测量。
[0053]如本文所述的组合物可以包括在合适的包装中-例如，瓶子、盒子、小瓶、胶囊等。 在本文上下文中如技术人员将理解-当本文提到组合物的重量(例如，称到"g组合物"），则 提到所述组合物本身的重量-即，不包含合适的包装的可能重量。
[0054]下面仅通过实施例的方式，描述本发明的实施方案。下面进一步描述本文相关的 干燥组合物-其中可以说它们中的每一个的特征在于具体优选的量的保护剂。
[0055]本发明的一个方面涉及一种干燥组合物，其包含109-1013cfu/g组合物的乳酸菌细 胞，其中所述组合物的特征在于其还包含下列量的保护剂（以下所有量的保护剂均相对于 所述组合物中lg乳酸菌细胞确定）：
[0056] (i) :2-5g蔗糖、l-3g麦芽糖糊精和0.75-2g抗坏血酸钠。
[0057]本发明的第二方面涉及一种干燥组合物，其包含109-1013cfu/g组合物的乳酸菌细 胞，其中所述组合物的特征在于其还包含下列量的保护剂（以下所有量的保护剂均相对于 所述组合物中lg乳酸菌细胞确定）：
[0058] (i) :5-9g蔗糖、l-3g麦芽糖糊精和0.75-2g抗坏血酸钠。
[0059]本发明的第三个方面涉及一种干燥组合物，其包含109_1013cfu/g组合物的乳酸菌 细胞，其中所述组合物的特征在于其还包含下列量的保护剂（以下所有量的保护剂均相对 于所述组合物中lg乳酸菌细胞确定）：
[0060] (i): 3-6g蔗糖、4-8g海藻糖和0 · 0(优选0 · 1 )-0 · 5g抗坏血酸钠。
[0061]本发明的第四个方面涉及一种干燥组合物，其包含109-1013cfu/g组合物的乳酸菌 细胞，其中所述组合物的特征在于其还包含下列量的保护剂（以下所有量的保护剂均相对 于所述组合物中lg乳酸菌细胞确定）：
[0062] (i): 0.5-3.5g麦芽糊精、0.0(优选0.1 )-0.5g抗坏血酸钠、6-9g海藻糖和0.1-0.5g 改性淀粉。
[0063] 术语"改性淀粉"为技术人员所熟知，并且技术人员知晓感兴趣的具体试剂是否是 改性淀粉。如技术人员所知-改性淀粉，也称为淀粉衍生物，是通过物理处理、酶学处理或化 学处理天然淀粉制备的。本文中合适的市售改性淀粉是市售的Remy HC-P改性淀粉产品。 [0064]本发明的第五个方面涉及一种干燥组合物，其包含109-1013cfu/g组合物的乳酸菌 细胞，其中所述组合物的特征在于其还包含下列量的保护剂（以下所有量的保护剂均相对 于所述组合物中lg乳酸菌细胞确定）：
[0065] (i) :6-9g海藻糖、0· Ι-lg菊粉和0.5-3g水解酪蛋白。
[0066]本发明的第六个方面涉及一种干燥组合物，其包含109-1013cfu/g组合物的乳酸菌 细胞，其中所述组合物的特征在于其还包含下列量的保护剂（以下所有量的保护剂均相对 于所述组合物中lg乳酸菌细胞确定）：
[0067] (i): 0.5-3.5g麦芽糖糊精、0.0(优选0.1 )-0.5g抗坏血酸钠和2-5g海藻糖。
[0068]本发明的第七个方面涉及一种干燥组合物，其包含109-1013cfu/g组合物的乳酸菌 细胞，其中所述组合物的特征在于其还包含下列量的保护剂（以下所有量的保护剂均相对 于所述组合物中lg乳酸菌细胞确定）：
[0069] (i):2-5g蔗糖、1 ·5-3·5g麦芽糖糊精和0·0(优选0· 1 )-0·5g抗坏血酸钠。
[0070]本发明的第八个方面涉及一种干燥组合物，其包含109-1013cfu/g组合物的乳酸菌 细胞，其中所述组合物的特征在于其还包含下列量的保护剂（以下所有量的保护剂均相对 于所述组合物中lg乳酸菌细胞确定）：
[0071 ] (i):4.5-7.5g蔗糖、2.5-5.5g麦芽糖糊精和0.0(优选0.1 )-0.5g抗坏血酸钠。
[0072]本发明的第九个方面涉及一种干燥组合物，其包含109-1013cfu/g组合物的乳酸菌 细胞，其中所述组合物的特征在于其还包含下列量的保护剂（以下所有量的保护剂均相对 于所述组合物中lg乳酸菌细胞确定）：
[0073] (i): 2.5-5.5g麦芽糖糊精和0.0(优选0.1 )-0.5g抗坏血酸钠和4.5-7.5g海藻糖。
[0074]本发明的第十个方面涉及一种干燥组合物，其包含109-1013cfu/g组合物的乳酸菌 细胞，其中所述组合物的特征在于其还包含下列量的保护剂（以下所有量的保护剂均相对 于所述组合物中lg乳酸菌细胞确定）：
[0075] (i): 1 · 5-4· 5g麦芽糖糊精和0 · 0(优选0 · 1 )-0 · 5g抗坏血酸钠和3-6g海藻糖。
[0076]本发明的第十一个方面涉及一种干燥组合物，其包含109-1013cfu/g组合物的乳酸 菌细胞，其中所述组合物的特征在于其还包含下列量的保护剂（以下所有量的保护剂均相 对于所述组合物中lg乳酸菌细胞确定）：
[0077] (i): 0.5_3g麦芽糖糊精和0.0(优选0.1 )-0.5g抗坏血酸钠和l_4g海藻糖。
[0078]实验结果已经证明所有上述干燥组合物均具有非常良好的储存稳定性。
[0079] 总体上如本文所述的包含乳酸菌(LAB)细胞的组合物的具体优选工业用途将通常 取决于所考虑细胞的具体特性。
[0080] 所述组合物可以给予人、动物或鱼类用于促进健康的目的。如果细胞具有益生性 质这通常是最相关的，并且当细胞是益生LAB细胞时特别相关。
[0081] 因此，本发明的进一步方面涉及一种将乳酸菌(LAB)细胞给予人、动物或鱼类的方 法，包括施用如本文所述的任一独立干燥组合物方面的至少一种干燥组合物。
【附图说明】
[0082]图1示出在35°C的储存温度下在具有aw:0.3的婴儿奶粉中的干酪乳杆菌43丨_和组 合物的储存稳定性。
[0083]图2示出在35°C的储存温度下在具有aw:0.3的婴儿奶粉中的6种不同的干酪乳杆 菌431?组合物的储存稳定性。
[0084] 图3示出在35°C的储存温度下在具有aw:0.3的婴儿奶粉中的干酪乳杆菌431?组 合物的储存稳定性。
[0085] 图4示出在35°C的储存温度下在具有aw:0.3的婴儿奶粉中的IGGK组合物的储存 稳定性。
[0086] 图5示出在40°C的储存温度下在具有aw:0.3的婴儿奶粉中的干酪乳杆菌431?组 合物的储存稳定性。
[0087] 图6示出在40 °C的储存温度下在具有aw: 0.3的婴儿奶粉中的LGG⑧组合物的储存 稳定性。
[0088] 图7示出在35 °C的储存温度下在具有aw: 0.25的婴儿奶粉中的LGCdt组合物的储 存稳定性。
【具体实施方式】 [0089] 干粉组合物
[0090] 技术人员理解在本文上下文中干燥组合物的含义。为了定量对其说明-如本文所 述的干粉组合物的水活度(aw)小于0.30。更优选地-如本文所述的干粉组合物的水活度(a w) 小于0.25,甚至更优选地小于0.20和最优选地如本文所述的干粉组合物的水活度(aw)小 于0.15。技术人员知晓如何确定如本文所述的干燥组合物的水活度(a w)。
[0091] 技术人员知晓如何制备如本文所述的干燥组合物。如本文所述的干燥组合物的制 备涉及例如将细胞培养物与保护剂混合。第二步骤涉及干燥所述混合物。所述干燥可以通 过冷冻干燥、喷雾干燥、改进的喷雾干燥和/或真空干燥来进行。其他干燥方式也是可能的。
[0092] 在冷冻干燥或真空干燥的情况下，混合物优选地通过本领域中已知的方法形成小 丸。一种方法可以是使混合物的小滴落入液氮中。形成小丸的另一种方法可以是通过挤压。 所述小丸可以随后使用上述干燥方法进行干燥。优选地，所述组合物使用本文所述的用于 制备干粉组合物的方法进行干燥。
[0093]干燥组合物可以是粉末形式。
[0094]干燥组合物的重量（例如，称为"g组合物"）通常将取决于不同的因素诸如组合物 的用途(例如，用于制备如下面所讨论的婴儿奶粉产品）。
[0095]如本文所述的干燥组合物的重量可以例如为lg-1000kg。
[0096] 例如-如果干燥组合物要用作婴儿产品-则所述干燥组合物通常与奶粉和其他补 充剂混合以得到包含乳酸菌细胞的婴儿奶粉产品。
[0097] 如技术人员已知-婴儿奶粉产品的生产可以以相当大的规模进行-例如通过将1-l〇kg的如本文所述的干燥组合物与合适量的奶粉和其他补充剂混合。
[0098] 因此，优选地，如本文所述的干燥组合物的重量可以为50g_10000kg，诸如例如 100g-1000kg或lkg-5000kg或100kg-1000kg。
[0099] 如在本文上下文中对于技术人员显然是-为了在第一方面的方法的步骤(f)中获 得具有例如l〇〇kg的重量的干粉组合物-需要在第一方面的步骤(b)中使用相应相对高的量 的LAB细胞浓缩物和在第一方面的步骤(c)中使用相应相对高的量的一种或多种保护剂。
[0100] 本发明的干粉组合物可以被包封，例如，在明胶胶囊中，或被配制成例如片剂，或 小袋(sachet)。如果所述组合物用于膳食补充剂中，则这个方面是特别相关的。
[0101] 乳酸菌细胞
[0102] 可优选地是，如本文所述的干粉组合物包含109-1013Cfu/g组合物的乳酸菌(LAB) 细胞。
[0103] 乳酸菌(LAB)细胞可以原则上是感兴趣的任何合适的LAB细胞。
[0104] 优选地，LAB细胞是益生细胞。
[0105] 表述"益生细胞"是指这样的一类细胞(例如，微生物），其被定义为通过改善宿主 人类或动物的胃肠微生物平衡来有益地影响宿主人类或动物的微生物食品或饲料补充剂。 已知的有益效应包括由于益生生物体的耗氧和产酸所引起的针对有害微生物菌群的定植 抗性的提高。在研究中显示了益生活性生物体防止潜在病原体的过度生长并因此防止腹泻 的功效的实例，在该研究中向在埃及旅行的旅行者给予含有有活力的益生活性生物体的胶 囊导致对旅行者腹泻的39.4%保护率(Black等人1989)。对益生菌和它们在人类和动物中 的效应的综述可参见Fuller ,1989和1994。
[0106] 在本文上下文中，表述"乳酸菌"是指一组革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、不动的、 微需氧的或厌氧的细菌，其发酵糖(包括乳糖），产生酸类包括乳酸作为主要产生的酸、乙 酸、甲酸和丙酸。下文中说明优选的LAB。
[01 07] 工业上最有用的乳酸菌发现于乳球菌属（L a c t 〇 c 〇 c c u s )种、链球菌属 (Streptococcus)种、肠球菌属(Enterococcus)种、乳杆菌属(Lactobacillus)种、明串珠菌 属(Leuconostoc)种、双歧杆菌属(Bifidobacterium)种、丙酸菌(Propioni)和片球菌属 (Pediococcus)种。因此，在优选的实施方案中，乳酸菌选自由这些乳酸菌组成的组。
[0108]在优选的实施方案中，乳酸菌是选自由下列组成的组中的乳酸菌：鼠李糖乳杆菌、 乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lacti s subsp . lact i s )、乳酸乳球菌乳脂亚种 (Lactococcus lactis subsp · cremoris)、乳明串珠菌（Leuconostoc lactis)、肠膜明串珠 菌乳月旨亚种（Leuconostoc me sent ero ides subsp · cremoris)、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus)、乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酰生物突变株（Lactococcus lactis subsp · lactis biovar .diacetylactis)、干酪乳杆菌干酪亚种（Lactobacillus casei 81^8卩.〇386；〇、嗜热链球菌（31：代卩1：0〇0〇〇118 1：1161'1110卩11；[1118)，肠球菌属，诸如屎肠球菌 (Enterococcus faecum)、动物双歧杆菌（Bifidobacterium animal is)、乳双歧杆菌 (Bifidobacterium lactis)、长双歧杆菌（Bifidobacterium longum)、乳酸乳杆菌 (Lactobacillus lactis)、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus)、发酵乳杆菌 (Lactobacillus fermentum)、唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius)、德氏乳杆菌保加 利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)和嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus)。在此组内，最优选的乳酸菌是鼠李糖乳杆菌。
[0109]所述组合物可包含乳酸菌的一种或多种菌株，所述菌株可以选自包含下列的组： Β·Β-1:2.?.(动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp lactis)BB-12?)、 DSM 15954;ATCC 29682、ATCC 27536、DSM 13692和DSM 10140、LA-5_? (嗜酸乳杆菌 LA-5? )、DSM 13241、LGG?(鼠李糖乳杆菌LGG? )、ATCC 53103、GR-1? (鼠李糖乳杆 菌GR-丨 ?)、ATCC 55826、.RC-14? (罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri) R.C-14?)、 ATCC 55845、干酪乳杆菌（L.casei)431?(类干酪乳杆菌类干酪亚种（Lactobacillus paracasei subsp.pracasei)干酷乳杆菌 431·?)、ΑΤ(Χ 55544、F.1.9?(类干酷乳杆菌 (Lactobacillus paracasei ) F1.9?)、LMG_ 17806、Τ?-4.?:(嗜热链球菌TH-4:?)、DSM 15957、PCC? (发酵乳杆菌PCC? )、匪02/31074、LP-33? (类干酪乳杆菌类干酪亚种 LP-33?:)、CCTCC M204012。
[0110] LAB培养物可以是"混合乳酸菌(LAB)培养物"或"纯乳酸菌(LAB)培养物"。术语"混 合乳酸菌(LAB)培养物"，或"LAB"培养物，是指包含两种以上不同的LAB种的混合培养物。术 语"纯乳酸菌(LAB)培养物"是指包含仅单一 LAB种的纯培养物。因此，在一个优选的实施方 案中，LAB培养物是选自由这些培养物组成的组的LAB培养物。
[0111] LAB培养物可以是在与保护剂混合前经洗涤的或未洗涤的。如果所述组合物包含 藻酸盐诸如藻酸钠，则经常需要在添加保护剂之前用软化水洗涤细胞以避免形成藻酸钙。
[0112] 保护剂
[0113] 术语"保护剂"在本文中应当理解为可以有助于改善感兴趣的乳酸菌细胞的储存 稳定性的任何试剂。关于如本文所述的干粉组合物和干燥这样的干粉组合物的方法-术语 "保护剂"还可以被视作所述干粉组合物本身(其不是乳酸菌(LAB)细胞本身）中存在的任何 试剂。
[0114]可优选的是，第一方面的第（ii)点的一种或多种保护剂的量是4g_20g，诸如5g-15g或6g-12g。
[0115] 在优选的实施方案中-至少30% (更优选至少50%，甚至更优选至少70% (诸如例 如至少80%或至少90%)的第一方面的第（i i)点的保护剂是碳水化合物。
[0116] 优选地，所述碳水化合物是糖类且优选的糖类是例如蔗糖、麦芽糖糊精、海藻糖 和/或菊粉。
[0117] 在本文的工作实施例中描述了LAB组合物的干燥，其中超过80 %的保护剂是糖类， 因为所述组合物包含75.3g海藻糖+5.0g菊粉/100g存在于组合物中的所有保护剂。
[0118] 此外，下面讨论了本文中其他优选的干粉LAB组合物，其中超过70%的保护剂是糖 类。不受限于理论-据信所有这些本文所述的"超过70%的保护剂是糖类"的LAB组合物具有 非常良好的储存稳定性-换句话说，通过使用(如本文中所述)相对高的量的碳水化合物(诸 如例如糖类)作为保护剂，可以获得具有商业上相关的非常良好的储存稳定性的干粉LAB组 合物(例如，用作婴儿奶粉中的组分）。
[0119] 当在本文中使用时，术语"婴儿"是指大约出生至12个月的年龄的人。在本文上下 文中，术语"婴儿配方"是指液体或粉末状形式的组合物，其作为人奶的替代品满足婴儿的 营养物需求。这些制剂受EU和US规章管理，所述规章规定了大量营养素、维生素、矿物质和 其他成分水平，以试图模拟人母乳的营养和其他性质。显然，所述配方应当不含有任何潜在 致敏性物质。因此，当使用水解酪蛋白时，其应当优选地被水解以致超过90 %的肽具有小于 1，000道尔顿的分子量，超过97 %的具有小于2，000道尔顿的分子量。
[0120] 当在本文中使用时，"儿童"被定义为高于约12个月龄至约12岁的人。本发明的婴 儿奶粉组合物可以用于婴儿配方、后续配方(f〇ll〇w-〇n formula)、成长奶（growing up milk)和特殊配方（special formula)以及用于婴儿和儿童的营养产品以改善其肠道微菌 群同时向婴儿或儿童提供营养。
[0121] 在此合适的保护剂是选自由下列组成的组的保护剂:抗坏血酸钠、改性淀粉、水解 酪蛋白和藻酸盐(例如藻酸钠）。
[0122] 藻酸，也称为藻胶(algin)或藻酸盐，是广泛分布在褐藻的细胞壁中的阴离子多 糖。藻酸盐作为藻酸的钙盐、镁盐和钠盐存在于褐藻的细胞壁中。藻酸与单价阳离子形成水 溶性盐但在酸化作用下沉淀。
[0123] 许多二价阳离子特别是Ca2+、Sr2+和Ba2+的藻酸盐，在水中是不溶的并且当NaAlg 的钠离子被二价和三价阳离子替换时可以被制备。此性质用于从藻类中分离藻酸。提取过 程的目的是获得干燥的、粉末状的藻酸钠。钙盐和镁盐不溶于水，而钠盐则溶于水。
[0124]由于它们的物理和化学性质，藻酸的单价盐诸如hydrogen alginate(藻酸氢， HAlg)、藻酸钾(KaAlg)和藻酸钠(NaAlg)，已经广泛用于食品加工、医药工业中。相反，藻酸 钙是不溶于水的、胶状的、奶油色物质，其可以通过向藻酸钠水溶液中添加水性氯化钙来生 成。
[0125] 当所述组合物要用于婴儿奶粉中时，优选的是其不包含改性淀粉或多糖诸如藻酸 钠，因为作为从藻类中提取的产物，藻酸钠不被批准在用于小于1岁的婴儿的婴儿奶粉(婴 儿配方）中使用。因此原因，已准备了许多不含藻酸盐的组合物的比较，并且已经发现如在 实施例中所证明，这些组合物表现出良好的稳定性。在含有和不含有藻酸盐的组合物之间 已经进行了进一步的比较试验，并且已经发现就稳定性而言，在含有或不含有藻酸盐的组 合物之间基本上没有差异。
[0126] 使用如上所述作为从藻类中提取的产物的藻酸盐的重大缺点是关于粘度而言具 有很大的批次-批次间的变化，并且该产物可能含有细菌，意味着不得不施加一些处理，例 如热处理以便使所述细菌失活。热处理可以是温度和持续时间的任何指定组合，其实现log 6或更多的减少(F0值等于或大于6)，即其可以是在具有加热罩的加压罐中的间歇热处理， 利用直接进入保护剂溶液中的无菌蒸汽注入/凝结（均在110-121Γ相当长的持续时间）或 连续通过UHT-处理装置(在高温下短持续时间，即在132 °C 30秒）。
[0127] 此处理导致藻酸盐的解聚，并且热处理通常对含有藻酸钠的组合物的稳定性有负 面的影响，如实施例9中所证明。
[0128] 因此，与本领域中的常规教导在组合物中包含藻酸盐诸如藻酸钠用于在严厉条件 期间稳定化和保护活细菌相反，出于上述原因提供不包含藻酸盐诸如藻酸钠的组合物是有 利的。因此，本发明的组合物优选地不包含藻酸盐诸如藻酸钠。
[0129] 在优选的实施方案中，本发明涉及一种干燥组合物，其包含109-1013cfu/g组合物 的乳酸菌细胞，其中所述组合物的特征在于其还包含下列量的保护剂（以下所有量的保护 剂均相对于所述组合物中lg乳酸菌细胞确定）：
[0130] (i):6_9g 海藻糖，
[0131] 0.1-lg 菊粉和
[0132] 0.5_3g水解酪蛋白，并且其特征在于
[0133] 其不包含藻酸盐。
[0134] 具体地，所述组合物不包含藻酸氢、藻酸钾或藻酸钠。
[0135] 在特别优选的实施方案中，根据本发明的干燥组合物包含75-80% (w/w)海藻糖、 3-10% (w/w)菊粉和15-20% (w/w)水解酪蛋白，并且不包含藻酸盐诸如藻酸钠。
[0136] 在本说明书和权利要求书中关于组合物和方法所述的全部公开内容显然地关于 上述优选的实施方案和特别优选的实施方案而被涵盖在内。具体地，本发明涉及包含根据 上述优选实施方案和特别优选的实施方案的组合物的婴儿奶粉、食品或膳食补充剂。
[0137] 本发明进一步涉及制备根据本发明的干燥组合物的方法，其中制备所述干燥组合 物的方法包括以下步骤：
[0138] (a):发酵所述LAB细胞和收获所述细胞以得到包含所述LAB细胞和水的LAB细胞浓 缩物-其中所述浓缩物包含1 〇8_l〇14cf u/g浓缩物干物质的乳酸菌(LAB)细胞；
[0139] (b):将适当量的一种或多种保护剂与所述LAB细胞浓缩物混合以形成浆料-其中 所述浆料包含6_9g海藻糖、Ο.Ι-lg菊粉和0.5-3g水解酪蛋白的量的保护剂并且不包含藻酸 盐-其中所述保护剂的量相对于所述浆料中lg乳酸菌细胞确定，并且保护剂和乳酸菌细胞 的量两者均以衆料中的干物质被测量；
[0140] (c):冷冻所述浆料以形成固体冷冻颗粒/小丸；
[0141] (d):用2kg/m2-50kg/m2的冷冻颗粒/小丸装载托盘以在所述托盘上得到本文相关 的材料；
[0142] (e):在其中材料的温度不达到那么高以致超过75%的所述LAB细胞失活的温度 下，在0.7-2毫巴(mbar)的真空压力下初次干燥所述托盘上的材料，持续一时间段直至步骤 (b)的浆料的至少90%的水被移除；以及
[0143] (f):在其中材料的温度不达到那么高以致超过75%的所述LAB细胞失活的温度 下，在0.01 -0.6毫巴（mbar)的真空压力下二次干燥步骤(e)的材料，持续足以将水活度 (aw)减少至小于0.30的时间段，从而获得所述干粉组合物，所述干粉组合物包含：
[0144] (i)109-1013cfu/g组合物的乳酸菌细胞，其中所述组合物的特征在于其还包含下 列量的保护剂（以下所有量的保护剂均相对于所述组合物中lg乳酸菌细胞确定）：
[0145] 6_9g 海藻糖，
[0146] Ο.Ι-lg 菊粉和
[0147] 0.5_3g水解酪蛋白，并且其特征在于
[0148] 其不包含藻酸盐。
[0149] 与其中组合物包含藻酸钠的方法相比，混合步骤b)较为容易，因为浆料具有较低 的粘度，并且还较容易在步骤c)中制粒，意味着颗粒常常是均质的并且具有适宜的尺寸，如 下面关于步骤c)的进一步详细解释那样，甚至无需研磨步骤。
[0150] 向组合物中添加其他化合物:
[0151 ]如本文所述的干燥组合物可以包含感兴趣的另外的化合物。
[0152]这可以例如是维生素(例如，生育酚)或可能感兴趣在最终组合物中存在的其他化 合物。此类化合物的实例可以是去湿剂诸如例如马铃薯淀粉。
[0153] 尽管上述干燥方法是优选的，但如上所述存在可替代的方法。取决于待使用何种 干燥方法，添加粘度调节剂可能是必不可少的。如果例如计划真空带式干燥，则增加粘度可 能是必不可少的。相反地，如果计划喷雾干燥，则降低粘度可能是必不可少的。
[0154] 粘度调节剂的合适实例是例如水(用于降低粘度）、果胶、预糊化淀粉、树胶(例如， 阿拉伯树胶、黄原胶、瓜尔豆胶、刺槐豆胶）、甘油(例如，丙三醇）；二醇类(例如，聚乙二醇、 丙二醇）；植物来源的蜡(例如，巴西棕榈蜡、米糠蜡、小烛树蜡），非植物蜡(蜂蜡）；卵磷脂； 植物纤维;脂质;和硅石(例如，二氧化硅）。
[0155] 根据本发明的组合物的用途:
[0156] 总体上如本文所述的含有细胞的组合物的具体优选的工业用途将通常取决于所 考虑的细胞的具体特性。
[0157] 所述组合物可以给予人、动物或鱼类用于促进健康的目的。如果细胞具有益生性 质这通常是最相关的，并且当细胞是益生LAB细胞时特别相关。
[0158] 本发明的优选制剂是婴儿奶粉的形式，据此组合物与奶粉混合。如本领域中已知-奶粉还可以包含其他补充剂。
[0159] 另一用途涉及在谷类诸如坚果麦片(muesli)或其他干食品中使用如本文所述的 组合物。
[0160]因此，在进一步的方面，本发明涉及食品，诸如谷类、坚果麦片条、糖棒（candy bar)或巧克力棒，其掺入了根据本发明的组合物。其还可以用于计划在饮料诸如运动饮料 或能量饮料中混合的粉末(例如，所谓的运动粉(sport powder))中。
[0161] 在另一方面，本发明涉及包含如本文所述的干燥组合物的膳食补充剂。
[0162] 下面讨论更多的本文相关的合适保护剂的实例。
[0163] 在本文中使用的保护剂通常是在本领域中一般用作例如低温添加剂的那些，例 如，糖类，诸如海藻糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖或葡萄糖;肌醇;或其他所谓的冷冻保护 剂，诸如聚乙二醇、二甲亚砜、甘油或右旋糖酐。优选的保护剂是蔗糖和/或麦芽糖糊精。
[0164] 其他添加剂，例如抗氧化剂诸如抗坏血酸盐也可以存在。为了本发明的目的，抗坏 血酸盐可以称为保护剂。
[0165] 如本文所讨论-本文所述的用于制备干粉组合物的新方法的优点是通过使用如本 文所述的方法，可以有效地干燥具有相对高的量的碳水化合物(诸如例如糖类)作为保护剂 的这种LAB组合物。
[0166] 发酵LAB细胞得到LAB细胞浓缩物-步骤(a)
[0167] 如上面所讨论的-第一方面的方法的步骤(a)写到：
[0168] "(a):发酵所述LAB细胞和收获所述细胞以得到包含所述LAB细胞和水的LAB细胞 浓缩物-其中所述浓缩物包含1 〇8_l〇14cf u/g浓缩物干物质的乳酸菌(LAB)细胞"
[0169] 对于技术人员来说发酵感兴趣的LAB细胞以便例如大规模生产/生长所述LAB细胞 是常规工作。
[0170] 如本领域中已知的-收获发酵的细胞通常涉及离心步骤以去除发酵培养基的相关 部分，从而得到LAB细胞浓缩物。
[0171] 如本领域中已知的-对于本文相关的LAB细胞生产，在此阶段可以获得具有约10% 细胞干物质的LAB细胞浓缩物-即，所谓的10%浓缩物。则浓缩物的其余部分通常主要是水- 即，将存在约90 %的水。LAB细胞浓缩物当然有时还可以含有较少的水-例如约50 %水。一般 地，步骤(b)中的LAB细胞浓缩物包含至少10% (诸如至少20%或至少50%)的水。在一些实 施方案中，浓缩物可以包含甚至少于10%干物质，诸如在5-10%的范围内，例如约5%。
[0172]在本文上下文中，通过如本文所述的干燥方法被去除以获得本文所述的干粉LAB 组合物的水基本上是LAB细胞浓缩物中的这种水。
[0173]在收获细胞后-可优选的是包括额外的洗涤步骤以便移除尽可能多的发酵培养基 组分/化合物本身-即以得到更"纯的" LAB细胞浓缩物，其基本上仅包含LAB细胞本身。
[0174] 步骤(a)写到："其中所述浓缩物包含108-1014cfu/g浓缩物干物质的乳酸菌(LAB) 细胞"。术语"cfu/g干物质"内的术语"干物质"应当如技术人员将在本文的上下文中对其理 解的那样被理解-即，LAB浓缩物包含相对于LAB浓缩物的干物质重量（即，不包括LAB浓缩物 中存在的液体的重量)的指定量的LAB细胞。
[0175] 如果需要，可以加入例如以固体冷冻颗粒/小丸形式冷冻LAB浓缩物的步骤，并且 LAB浓缩物可以作为冷冻浓缩物保持一段时间，然后被融化，并且该过程继续步骤b)。可选 地，该过程可以从步骤(b)开始，例如基于市售的LAB细胞浓缩物。
[0176] 将保护剂与LAB细胞浓缩物混合-步骤(b):
[0177] 如上面所讨论的-第一方面的方法的步骤(b)写到：
[0178] "(b):将适当量的一种或多种保护剂与所述LAB细胞浓缩物混合以形成浆料-其中 所述浆料包含2g_40g的量的一种或对于保护剂-其中所述一种或多种保护剂的量相对于所 述浆料中lg乳酸菌细胞确定，并且一种或多种保护剂和乳酸菌细胞的量两者均以浆料中的 干物质被测量"。
[0179]术语"浆料"应当如技术人员将在本文的上下文中对其理解的那样被理解-即，为 固体在液体中的相对稠的混悬液。
[0180] 对于技术人员来说，将合适量的保护剂与LAB细胞浓缩物混合以得到浆料中的想 要的保护剂浓度/量是常规工作。
[0181] 冷冻浆料以形成固体冷冻颗粒/小丸-步骤(c)
[0182] 如上面所讨论的-第一方面的方法的步骤(c)写到：
[0183] "(c):冷冻所述浆料以形成固体冷冻颗粒/小丸"。
[0184] 对于技术人员来说，进行此冷冻浆料以形成固体冷冻颗粒/小丸步骤本身是常规 工作。如本领域中已知的-其可以利用例如液氮来完成，其中利用液氮冷冻浆料来得到固体 冷冻颗粒/小丸。
[0185] 如本文中的工作实施例中所示-本发明人测试了不同粒度的冷冻颗粒/小丸，并且 发现太大的颗粒不能得到令人满意的干燥结果。因此，在优选的实施方案中，步骤(c)中的 至少95% (更优选至少97% )的冷冻颗粒/小丸是能够穿过具有10mm的开口/孔最大尺寸的 筛网/筛的颗粒/小丸。
[0186] 更优选地，步骤(c)中的至少95% (更优选至少97%)的冷冻颗粒/小丸是能够穿过 具有7.5mm的开口 /孔最大尺寸，更优选具有5mm的开口 /孔最大尺寸和最优选具有3mm的开 口 /孔最大尺寸的筛网的颗粒/小丸。
[0187] 对于技术人员来说，通过筛网筛分相关颗粒(在此是冷冻颗粒/小丸)是常规工作。 对于技术人员来说，测试特定的冷冻颗粒/小丸样品是否是其中至少95% (更优选至少 97%)的冷冻颗粒/小丸是能够穿过具有指定的开口 /孔最大尺寸的筛网的颗粒/小丸的样 品是常规工作。
[0188] 如本领域中已知的-可以简单地将感兴趣的特定冷冻颗粒/小丸样品放置在合适 的筛网上，然后以适宜的方式移动/振动筛网直至没有更多的显著量的冷冻颗粒/小丸穿过 筛网-如果多于95%的冷冻颗粒/小丸已经穿过了筛网，则该感兴趣的特定冷冻颗粒/小丸 样品是其中至少95%的冷冻颗粒/小丸是能够穿过具有指定的开口 /孔最大尺寸的筛网的 颗粒/小丸的样品。
[0189] 用冷冻颗粒/小丸装载托盘-步骤(d):
[0190] 如上面所讨论的-第一方面的方法的步骤(d)写到：
[0191] "(d):用2kg/m2-50kg/m2的冷冻颗粒/小丸装载托盘以在所述托盘上得到本文相关 的材料"。
[0192] 在优选的实施方案中-第一方面的步骤(d)中的托盘装载有5kg/m2-30kg/m2的冷冻 颗粒/小丸(诸如例如7kg/m 2-15kg/m2的冷冻颗粒/小丸）。
[0193] 在本文的上下文中，可以使用任何本文中合适的托盘。如已知的-有技术人员可用 的数种本文相关的合适托盘，其中这些托盘中的一些也是市售的。
[0194] 在本文上下文中如技术人员所理解的-托盘一般以下面的方式装载冷冻颗粒/小 丸，其中在托盘中得到相对均匀/类似分布的冷冻颗粒/小丸-即，优选地不使所有冷冻颗 粒/小丸位于例如仅托盘的一个边缘处。
[0195] 对于例如工业相关地大规模生产相对大量的本文相关的干粉组合物（例如， 100kg-10000kg的干粉组合物)-在例如本文的装载(d)中一般可优选同时使用多于一个(诸 如例如多于10个或多于100个)托盘-即，其中在步骤(d)中多于一个(诸如例如多于10个或 多于100个)托盘装载2kg/m 2-50kg/m2的冷冻颗粒/小丸。
[0196] 初次干燥-步骤(e):
[0197] 如上面所讨论的-第一方面的方法的步骤(e)写到：
[0198] "(e):在其中材料的温度不达到那么高以致超过75%的所述LAB细胞失活的温度 下，在0.7-2毫巴(mbar)的真空压力下初次干燥所述托盘上的材料，持续一时间段直至步骤 (b)的浆料的至少90%的水被移除"。
[0199] 在本文上下文中可以使用任何本文中合适的真空干燥机设备。如已知的-有技术 人员可用的数种合适的真空干燥机设备，其中这些真空干燥机设备中的一些也是市售的。
[0200] 在优选的实施方案中-真空干燥机设备是这样的设备，其中该设备中的加热是所 谓的辐照加热。如技术人员已知的，辐照加热被技术人员理解为不同于所谓的接触加热。如 技术人员已知的-可以通过例如靠近(但不直接接触)包含待干燥材料的托盘定位加热盘来 获得辐照加热。换句话说，关于初次干燥步骤（e)_在加热盘和托盘之间存在空间（即，真 空）-即，托盘的加热就是基于辐照加热的。
[0201] 在优选的实施方案中-托盘定位在两个加热盘之间，其中两个加热盘均向托盘提 供辐照加热。
[0202] 对于例如工业相关地大规模生产相对大量的本文相关的干粉组合物（例如， 100kg-10000kg的干粉组合物)_在例如本文的干燥步骤(e)中一般可优选同时使用多于一 个(诸如例如多于10个或多于1〇〇个)托盘-即，其中在步骤(e)中存在多于一个(诸如例如多 于10个或多于100个)包含待干燥材料的托盘。
[0203]简言之，可以将此初次干燥(e)视为这样的步骤，其中将可以被称为"自由"水的水 (即，与可以被称为"结合"水的水相反)移除。在本文上下文中-可以说在此步骤(e)中移除 的此"自由"水代表了在步骤(a)的LAB细胞浓缩物中存在的大部分水。还可以说此"自由"水 比"结合"水更容易移除，可以说在本发明的干燥方法的随后二次干燥步骤(f)中该"结合" 水基本上主要被移除(参见下面对此"结合"水问题的进一步讨论）。
[0204]在此初次干燥步骤中，真空压力为0.7-2毫巴(mbar)_这可以被视作此初次干燥步 骤(e)的必要要素。如在本文工作实施例中所讨论的-本发明人已经认识到如果在此初次步 骤(e)中使用不同于0.7-2毫巴(mbar)范围的真空压力，则不能得到对如本文所述的LAB组 合物(即，具有相对高的量的保护剂)的本文令人满意的干燥。
[0205] 简言之，本发明人认识到如果真空压力低于0.7mbar，则可以说LAB浓缩物中的水 是如此的冷使得所有冷冻颗粒/小丸在此初次干燥步骤(e)的大部分时间段期间仍然是完 全冷冻的-即，可以说此步骤(e)则将是实际上100%所谓的冻干步骤-即，其中所有水通过 升华移除。本发明人认识到为了移除实际上所有水，在此初次干燥步骤中，在本文上下文中 通过升华并不能得到令人满意的结果。
[0206] 简言之，本发明人认识到如果真空压力高于2mbar，则可以说LAB浓缩物中的水是 如此相对"热"使得在此初次干燥步骤(e)的大部分时间段期间大部分的冷冻颗粒/小丸被 融化（即，不再冷冻）_并且本发明人认识到对于在本文上下文中得到令人满意的最终干燥 结果，这是不好的。
[0207] 如技术人员已知的-在2mbar压力下，水（即，冰)的温度为-12°C，在lmbar下水（即， 冰)的温度为_20°C并且在0 · 7mbar压力下，水(即，冰)的温度为-24°C。
[0208] 特别在此初次干燥步骤（e)的开始时-一般待干燥材料具有大量的水，因为步骤 (a)的LAB浓缩物常常具有约例如90 %的水和约10 %的LAB细胞本身。
[0209] 因此，可以说，特别在此初次干燥步骤(e)的开始时，通常水的温度将在一定程度 上控制待干燥材料的温度。
[0210] 可以说，本发明人已经认识到0.7-2mbar的真空压力范围正是用于干燥本文相关 的LAB组合物(即，具有相对高的量的保护剂)的完美/最适范围。
[0211]不受限于理论-此真空压力范围特别好的原因可能是因为在此压力下，水的温度 足够得到步骤(c)的冷冻颗粒/小丸的相对有限的融化，但不存在有冷冻颗粒/小丸的太高 度的融化。不受限于理论-可以说，如果有限量的冷冻颗粒/小丸被融化（即，成为液体形 式)_则至少一些部分的水可以通过蒸发被移除。
[0212]因此，本文优选的实施方案涉及步骤(e)中的有限（例如，至少0.5%至最大5%，更 优选至少1%至最大4%)量的材料被融化为液体材料（即，非冷冻材料）。此外，优选的是对 于初次干燥步骤(e)的大部分时间段(例如，至少3小时期间或至少6小时期间）是这样的。
[0213] 技术人员通过简单地观察在例如冷冻颗粒/小丸的表面上存在有液体水而从视觉 上能够确定是否步骤(e)中的有限量的材料被融化为液体材料(即，非冷冻材料）。
[0214] 如上面所讨论的-在步骤(e)中写到："在其中材料的温度不达到那么高以致超过 75%的所述LAB细胞失活的温度下"。
[0215] 对于技术人员来说，在步骤(e)的时间段期间连续地测量材料本身的温度是常规 工作。一般-简单地在步骤(e)的时间段期间使得在材料本身中存在一个或多个温度计。
[0216]如上面所讨论的-可以说特别在此初次干燥步骤(e)的开始时，通常水的温度将在 一定程度上控制待干燥材料的温度。
[0217]如上面所讨论的-在步骤(e)中使用的0.7-2毫巴(mbar)压力下，水（即，冰)温度大 约为-24°C至_12°C。在此相对冷的温度（即，大约_24°C至_12°C)下，通常没有本文LAB细胞 的显著失活。
[0218] 然而，在步骤(e)的时间段结束时-在此步骤(e)中例如97 %的所谓"自由"水可以 已经被移除-即，在步骤(e)的此时间段比在步骤(e)的时间段开始时存在显著更少的水。
[0219] 因此，可以说特别在步骤（e)的时间段的结束时，非常重要的是良好地控制对托 盘/材料可能施加的加热-即，因此材料的温度不会太高。
[0220] 在本文上下文中，技术人员将通常知晓什么可以被称为感兴趣的本文相关LAB的 热稳定性。换句话说，对于感兴趣的本文相关LAB，确定材料的最大温度应当为多少以便不 使太多的LAB细胞失活是常规工作。
[0221] 例如-当第一方面的第(ii)点的乳酸菌(LAB)细胞是乳杆菌属细胞时-优选的是第 一方面的步骤(e)和(f)的材料的温度是不达到高于40°C的温度。
[0222] 例如-当第一方面的第(ii)点的乳酸菌(LAB)细胞是动物双歧杆菌乳亚种细胞时-据信在不使细胞的失活太高的情况下，所述温度可以稍高一些-即，第一方面的步骤(e)和 (f)的材料的温度是不达到高于例如50°C的温度。
[0223] 如在本文上下文中明显的是-在步骤（e)和步骤(f)中优选地应当尽可能少地使 LAB细胞失活。
[0224] 因此，优选的实施方案涉及步骤(e)，其中材料的温度不达到那么高以致多于50% 的LAB细胞失活，更优选材料的温度不达到那么高以致多于25%的LAB细胞失活，甚至更优 选材料的温度不达到那么高以致多于10%的LAB细胞失活并且最优选材料的温度不达到那 么高以致多于2 %的LAB细胞失活。
[0225] 在优选的实施方案中-第一方面的步骤（e)的初次干燥在1-2毫巴（mbar)，诸如 1 · 1-1.7毫巴(mbar)的真空压力下进行。
[0226] 在优选的实施方案中-在第一方面的步骤(e)的初次干燥中浆料的至少95 %的水 被移除，更优选浆料的至少97%的水被移除和最优选浆料的至少98%的水被移除。
[0227] 本文优选的实施方案涉及其中第一方面的步骤(e)的时间段为3小时-60小时的时 段-更优选5小时-36小时，甚至更优选5小时-24小时(诸如例如7-15小时）。
[0228] 不受限于理论-据信对于本文工业相关的大规模生产，可能难以在少于3小时内适 当地进行初次干燥步骤(e)。不受限于理论-使用多于60小时用于干燥步骤(e)对于本文工 业相关的大规模生产一般将不是最适的。
[0229] 二次干燥-步骤(f):
[0230] 如上面所讨论的-第一方面的方法的步骤(f)写到：
[0231] "(f):在其中材料的温度不达到那么高以致超过75%的所述LAB细胞失活的温度 下，在0.01-0.6毫巴(mbar)的真空压力下二次干燥步骤(e)的材料，持续足以将水活度(a w) 减少至小于0.30的时间段，从而获得所述干粉组合物，所述干粉组合物包含：
[0232] (i):108-1014cfu/g组合物的乳酸菌(LAB)细胞;和
[0233] (ii)2g_40g的量的一种或多种保护剂-其中一种或多种保护剂的量相对于所述干 燥组合物中lg乳酸菌细胞确定。"
[0234] 如技术人员所理解-以上对于初次干燥步骤(e)所讨论的许多技术问题也可以与 二次干燥步骤(f)相对应地相关。例如-在步骤(f)中使用的真空干燥设备与步骤(e)中使用 的真空干燥设备常常相同（或非常相似）。
[0235] 简言之，可以将此二次干燥(f)看做是这样的步骤，其中将可以被称为"结合"水的 水(即，与如通常在步骤(e)中被移除的可以被称为"自由"水的水相反-参见上面的讨论)移 除。如技术人员已知的-可以说"结合"水比"自由"水更难以移除-因此，与步骤(e)中相比， 在步骤(f)中使用更大的真空(较小的mbar压力）。
[0236]本文优选的实施方案涉及其中第一方面的步骤(f)的二次干燥在0.05-0.4毫巴 (mbar)，诸如0· 1-0.3毫巴(mbar)的真空压力下进行。
[0237] 在本文上下文中-约0.2mbar的压力有时可以被称为"全真空"。
[0238] 如上面所讨论的-在步骤(e)和步骤(f)中应当优选地尽可能少地使LAB细胞失活。
[0239] 因此，优选的实施方案涉及步骤(f)，其中材料的温度不达到那么高以致多于50% 的LAB细胞失活，更优选材料的温度不达到那么高以致多于25%的LAB细胞失活，甚至更优 选材料的温度不达到那么高以致多于10%的LAB细胞失活并且最优选材料的温度不达到那 么高以致多于2 %的LAB细胞失活。
[0240] 如以上关于步骤(e)所讨论的-当第一方面的第(ii)点的乳酸菌(LAB)细胞是乳杆 菌属细胞时-优选的是第一方面的步骤(e)和(f)的材料的温度是不达到高于40°C的温度。
[0241] 例如-当第一方面的第(ii)点的乳酸菌(LAB)细胞是动物双歧杆菌乳亚种细胞时-据信在不使细胞的失活太高的情况下，所述温度可以稍高一些-即，第一方面的步骤(e)和 (f)的材料的温度是不达到高于例如50°C的温度。
[0242] 如上面所讨论的，在初次干燥步骤（e)的时间段结束时-此步骤(e)中所谓的"自 由"水的例如97%可以已经被移除-即，在步骤(e)的结束时比在步骤(e)的时间段开始时存 在显著更少的水。
[0243 ]就此而言-显然在二次干燥步骤(f)期间存在相对少的水。
[0244] 因此，如果在此二次干燥步骤(f)中施加任何加热-例如使用的加热盘(对于例如 辐照加热-见上)通常将被设定为非常接近期望是(待加热)材料本身温度的温度的加热温 度。例如-如果步骤(f)中（待加热)材料本身的温度应当最大为例如37°C -则例如使用的加 热盘将不设定为显著高于此37°C的温度。
[0245] 本文优选的实施方案涉及其中第一方面的步骤(f)的时间段为3小时-60小时的时 段-更优选5小时-36小时，甚至更优选5小时-24小时(诸如例如7-15小时）。
[0246] 不受限于理论-据信对于本文工业相关的大规模生产，可能难以在少于3小时内适 当地进行初次干燥步骤(f)。不受限于理论-使用多于60小时用于干燥步骤(f)对于本文工 业相关的大规模生产一般将不是最适的。
[0247] 在优选的实施方案中-步骤(f)的时间段是足以将水活度(aw)减少至小于0.25,更 优选小于〇. 20和最优选减少至小于0.15的时间段。
[0248] 技术人员知晓如何确定如本文所述的干燥组合物的水活度(aw)。
[0249] 其他任选步骤:
[0250] 如技术人员所理解的-如本文所讨论的第一方面的干燥方法可以包括更多的任选 步骤。
[0251] 本文显然相关的任选额外步骤将是例如适当地包装步骤(f)中获得的干粉组合 物。
[0252] 如本领域中已知的-所述包装可以例如是瓶子、盒子、小瓶、胶囊等-优选地所述包 装是防水的以保持所述干粉组合物的低水活度。
[0253] 此外本文显然相关的任选额外步骤包括步骤(f)中获得的干粉LAB组合物用于本 文商业上相关用途的用途。
[0254] 只作为实例-商业上相关的用途可以例如是用作婴儿奶粉，其中所述干粉LAB组合 物与奶粉混合-或用来制备乳制品。
[0255] 实施例
[0256] 材料和方法
[0257] 鼠李糖乳杆菌LGG?和类干酪乳杆菌类干酪亚种干酪乳杆菌431?的洗涤过的 浓缩物-获自丹麦Chr. Hansen A/S
[0258] 海藻糖来自 Cargill 名称：Treha 16400
[0259] 酶水解酪蛋白来自DMV International
[0260] 藻酸钠来自FMC BioPolymer:Manugel?DMB
[0261] 菊粉来自 BENEO-ORAFTI: 〇rafti?GR
[0262] 麦芽糖糊精:Glucidex IT 12,来自Roquette
[0263] 抗坏血酸钠来自Northeast Pharmaceutical group Co.，
[0264] 鹿糖来自Nordic Sugar:Granulated sugar 550
[0265] Remy HC-P(预糊化大米)淀粉，婴儿食品级，来自Beneo-remy NV
[0266] 婴儿奶粉是源自Mead Johnson LCC,Evansville，IN的EnfaGrow〇
[0267] 实施例1:
[0268] LAB组合物的干燥
[0269] 乳酸菌(LAB)细胞是市售的乳杆菌属细胞LGG?:-可获自丹麦的Chr.Hansen A/ So
[0270] 真空干燥机设备是这样的设备，其中该设备中的加热是所谓的辐照加热。托盘定 位在两个加热盘之间，其中两个加热盘均向托盘提供辐照加热。
[0271] 步骤(a):
[0272] 获得lkg LAB细胞浓缩物-其包含大约10%细胞干物质-即，所谓的具有约90%水 的10 %浓缩物。
[0273] 步骤(b):
[0274] 1kg保护剂混合物（该混合物包含30g藻酸钠;50g菊粉、753g海藻糖和167g酪蛋白 水解物)与LAB细胞浓缩物混合。
[0275] 因此，获得了浆料，所述浆料包含约10g的量的保护剂-其中保护剂的量相对于浆 料中lg乳酸菌细胞确定，并且保护剂和乳酸菌细胞的量两者均以浆料中的干物质测量。
[0276] 步骤(c):
[0277] 将浆料冷冻以形成固体冷冻颗粒/小丸。
[0278] 这通过利用液氮完成。
[0279] 步骤(d):
[0280] 用10kg/m2的冷冻颗粒/小丸装载托盘以在所述托盘上得到本文相关的材料。
[0281] 步骤(e):
[0282] 在不同的真空压力下进行对托盘上的材料的初次干燥，-一些在0.7-2毫巴(mbar) 的真空压力范围内（例如，使用1.3mbar压力)进行，并且一些在此范围之外进行(例如，使用 2 · 5mbar压力）。
[0283] 此步骤在其中材料的温度不达到高于37°C的温度下进行。
[0284] 在此最大温度下，显著少于50%的LAB细胞失活。
[0285] 此步骤进行一段时间直至步骤(b)的浆料的至少97%的水已经被移除-这需要大 约12小时。
[0286] 步骤(f):
[0287 ]在0.2mbar的真空压力下进行步骤(e)的材料的二次干燥。
[0288]关于步骤(e)_此步骤也在其中材料的温度不达到高于37°C的温度下进行。此步骤 进行约12小时的时间段。
[0289]结果：
[0290]藍
[0291] 在两种不同的压力下的水活度和加工存活率(process survival)
[0292]
[0293] ~从表1看出在2.5mbar下干火喿的产品内，水活^高于优选值(〈0 . ?δ)，而在1.3mba^ 下干燥的样品具有优选的水活度。此外在1.3mbar下干燥的样品的加工存活率高于在 2.5mbar下干燥的样品。
[0294] 塾
[0295] 在不同的温度下的水活度和加工存活率
[0296]

[0297] 从表2看出当干燥温度太高时（70°C)，水活度以及加工存活率均在不能接受的范 围内，而干燥温度为50或60°C时水活度和加工存活率均没有差异。在两种情况下，值均在可 接受的范围内。
[0298] 对于此实施例-可以说本文变化的主要参数在初次干燥步骤(e)中-其中使用了不 同的真空压力-一些在0 · 7-2毫巴(mbar)的真空压力范围内（例如，使用1 · 3mbar压力)进行， 并且一些在此范围之外进行(例如，使用2.5mbar压力）。
[0299]实验结果实质上证明当使用在0.7_2mbar的范围之外的真空压力时没有获得对 LAB组合物的本文令人满意的干燥。因前面所解释的原因，压力选择为稍稍高于制剂的转变 温度。在实施例1中使用的制剂的转变温度为约-33°C。在2.5mbar下，温度为约-10.5 °C，其 大大高于该转变温度。因此表1中的结果证明1.3mbar较为合适。
[0300] 当真空压力在0.7-2毫巴(mbar)的范围内（例如1.3mbar压力）时，则能够进行适当 的和有效的干燥以得到水活度U)为小于0.15的干燥配方组合物。
[0301] 结论：
[0302] 此实施例1的结果实质上证明仅通过在步骤(e)中在0.7_2mbar的真空压力范围内 工作就得到了本文令人满意的用于干燥本文相关的包含相对高的量的保护剂的LAB组合物 的方法。
[0303] 实施例2:
[0304] 步骤(c)的冷冻颗粒/小丸的粒度
[0305] 基本上如实施例1中所述进行实验-但其中步骤（c)中的真空压力保持恒定于约 1 · 3mbar压力。
[0306] 在此实验中，主要变量为步骤(c)的冷冻颗粒/小丸的粒度。
[0307] 进行实验，其中步骤(c)中的至少97%的冷冻颗粒/小丸是能够穿过具有不同尺寸 的开口 /孔最大尺寸的筛网的颗粒/小丸。
[0308] 结果：
[0309] 实验结果实质上证明当颗粒/小丸的尺寸大于10mm时，则不能获得最佳的干燥结 果。
[0310]但当颗粒/小丸的尺寸小于5mm时，则获得了非常良好和有效的干燥。
[0311] 结论：
[0312] 此实施例2的结果实质上证明本文中优选的是步骤(c)中的至少95% (更优选至少 97 % )的冷冻颗粒/小丸是能够穿过具有10mm的开口 /孔最大尺寸(优选具有5mm的开口 /孔 最大尺寸)的筛网的颗粒/小丸。
[0313] 实施例3:
[0314] 其他LAB组合物的干燥
[0315] 基本上重复实施例1，但使用其他LAB细胞和其他保护剂。还评价了在0.9/0.2mbar 的压力以及32°C和37°C的加热温度下的干燥(对于含有和不含有藻酸盐的制剂)并且对于 两种温度，干燥产物的水活度在干燥24小时后〈0.15。
[0316]不含藻酸盐的制剂和含有蔗糖的制剂作为#7进行实验并且得到具有水活度〈0.15 和为约50 %的加工存活率的干燥产物。蔗糖制剂得到具有水活度〈0.3的干燥产物，但通过 增加干燥时间，水活度可以低的更多。
[0317]对于步骤(b)，在所有实验中获得了浆料，所述浆料包含约6g_15g的量的保护剂-其中保护剂的量相对于浆料中lg乳酸菌细胞确定，并且保护剂和乳酸菌细胞的量两者均以 浆料中的干物质测量。
[0318] 对于所有实验-至少50%的使用的保护剂是糖类。
[0319] 结论：
[0320]此实施例3的结果实质上证明了与实施例1中相同的结论-即，仅通过在步骤(e)中 在0.7-2mbar的真空压力范围内工作就得到了本文令人满意的用于干燥本文相关的包含相 对高的量的保护剂的LAB组合物的方法。通过确定组合物的转变温度并将其与如上所解释 的水蒸汽压力表相关联来选择适合于各组合物的确切真空压力范围。
[0321] 可以说，此实施例3确认了对不同LAB组合物的此结论，所述LAB组合物的特征可以 是包含相对高的量的作为保护剂的糖类。
[0322] 实施例4
[0323]制备不含藻酸盐的制剂
[0324] 向一份LGG?浓缩物添加两份软化水并将所述浓缩物离心回最初的体积（约 1.27X1011活细胞/g)。下面使用的细胞浓缩物具有约10%细胞干物质-即，所谓的10%浓缩 物。
[0325] 制剂1:向100g洗涤过的浓缩物添加30g蔗糖+17.5g麦芽糖糊精(Glucidex IT 12) +13g抗坏血酸钠。将该混合物搅拌直至添加剂溶解。之后将该混合物真空干燥。
[0326]制剂2:向100g洗涤过的浓缩物添加70g蔗糖+17.5g麦芽糖糊精(Glucidex IT 12) +13g抗坏血酸钠。将该混合物搅拌直至添加剂溶解。之后将该混合物真空干燥。
[0327] 制剂3:向100g洗涤过的浓缩物添加 37.4g蔗糖+60g海藻糖+2.6g抗坏血酸钠。将该 混合物搅拌直至添加剂溶解。之后将该混合物真空干燥。
[0328] 参考1(参考制剂）：向100g洗涤过的浓缩物添加6g蔗糖+ 3.5g麦芽糖糊精 (Glucidex IT 12)+2.6g抗坏血酸钠。将该混合物搅拌直至添加剂溶解。之后将该混合物真 空干燥。
[0329] 如果混合物在带式真空干燥机中干燥，则可能必需添加小量的胶凝剂例如果胶以 得到适宜的粘度。
[0330] 实施例5
[0331] 在30°C在开口袋子中和在婴儿奶粉中对不含藻酸盐的；LGG?制剂的测试
[0332] 在储存于30°C和30%RH的开口袋中以及在混合入具有0.3的水活度的婴儿奶粉中 时测试产品的稳定性。参见表3和表4中的稳定性数据。使用含有如上面实施例4中所概述的 制剂1中的添加剂的量的20%的LGG⑩作为参考。将粉末湿润以获得〇. 27-0.30的水活度。
[0333] ^3
[0334] 在储存于30 °C /30 % RH的开口袋子中的储存。
[0335]
[0337] 样品通过流式细胞仪测量(活细胞/g)。
[0338] 结论：
[0339] 从表3看出在参考1中发现最高的％活细胞损失。通过将保护剂的量以5倍增加，稳 定性显著增加(比较制剂1和参考1)。制剂2和3也证明了增加的稳定性。
[0340] ^4
[0341] 在30°C在具有aw:0.3的Enfagrow中的储存稳定性。
[0342]
[0343] 在储存前袋子用他吹扫并密封。
[0344] 结论：
[0345] 用制剂1-3制备的婴儿奶粉具有比参考1更好的稳定性。
[0346] 实施例6
[0347] 在35 °C对婴儿奶粉中的不含藻酸盐的类干酪乳杆菌类干酪亚种干酪乳杆菌 431?制剂的测试
[0348] 向一份类干酪乳杆菌类干酪亚种干酪乳杆菌431?浓缩物(LC 431)添加两份软化 水并将所述浓缩物离心回最初的体积(约1.27X1011活细胞/g)。下面使用的细胞浓缩物具有 约10 %细胞干物质-即，所谓的10 %浓缩物。
[0349]制剂1LC 431:向10(^洗涤过的浓缩物添加30g蔗糖+17.5g麦芽糖糊精(Glucidex IT 12 ) + 13g抗坏血酸钠。将该混合物搅拌直至添加剂溶解。之后将该混合物在液氮中制粒，然 后将其真空干燥。
[0350]将该混合物添加至婴儿奶粉并且在储存于30%RH和35°C的具有0.3的水活度的婴 儿奶粉中测试产品的稳定性。参见表3中的稳定性数据。使用在上面实施例4中所概述的参 考1中含有LC 431的婴儿奶粉作为参考。
[0351]莖
[0352]在35 °C在具有aw: 0.3的婴儿奶粉中的储存稳定性 [0353]
[0354]在储存前袋子用他吹扫并密封。
[0355] 结论：
[0356] 从表5和图1看出，同样对于干酪乳杆菌431?且在35°C的储存温度下，在参考1中 发现最高的％活细胞损失。同样对于干酪乳杆菌43丨?,通过将保护剂的量以5倍增加，稳定 性显著增加。
[0357] 实施例7
[0358]在35°C对婴儿奶粉中的不含藻酸盐的6种不同的类干酪乳杆菌类干酪亚种干酪乳 杆菌431?制剂的测试
[0359]向一份干酪乳杆菌431?浓缩物添加两份软化水并将所述浓缩物离心回最初的体 积(约1.27X1011活细胞/g)。下面使用的细胞浓缩物具有约10%细胞干物质-即，所谓的10% 浓缩物。将该混合物搅拌直至添加剂溶解。之后将该混合物在液氮中制粒，然后将其真空干 燥。
[0360]组合物1:向1000g洗涤过的浓缩物添加753g海藻糖+191g麦芽糖糊精+26g抗坏血 酸钠+30g Remy HC-P。
[0361] 组合物2:向1000g洗涤过的浓缩物添加753g海藻糖+50g菊粉+167g水解酪蛋白。
[0362] 组合物3 :向1000g洗涤过的浓缩物添加366g海藻糖+213g麦芽糖糊精+26g抗坏血 酸钠。
[0363] 组合物6:向1000g洗涤过的浓缩物添加615g海藻糖+358g麦芽糖糊精+26g抗坏血 酸钠。
[0364] 组合物7 :向1000g洗涤过的浓缩物添加459g海藻糖+267g麦芽糖糊精+26g抗坏血 酸钠。
[0365] 组合物8:向lOOOg洗涤过的浓缩物添加213g海藻糖+124g麦芽糖糊精+26g抗坏血 酸钠。
[0366] 将各种组合物添加至婴儿奶粉并且在用N2吹扫的密封袋子中在储存于30%RH和 35°C的具有0.3的水活度的婴儿奶粉中测试产品的稳定性。参见表4和图2中的稳定性数据。 使用在上面实施例4中所述的参考1中含有干酪乳杆菌431?的婴儿奶粉用作参考。
[0367] 塾
[0368]在具有aw:0.3的婴儿奶粉中在35°C下的储存稳定性(对数活细胞/g)
[0369]
[0370] ~' '
' ' ' ' '
[0371] 从表6和图2看出，对于干酪乳杆菌431?且在35°C的储存温度下，在参考1中发现 最高的％活细胞损失。所有测试的组合物且特别地组合物2证明了基本上提高的稳定性。
[0372] 实施例8
[0373] 对于类干酪乳杆菌类干酪亚种（LC 431)和对于LGG?，比较含有和不含有藻酸 盐的组合物
[0374] 如上所述制备LGG和类干酪乳杆菌类干酪亚种(LC 431)的10%浓缩物并将其加入 至组合物2或组合物2_(见下）。使用两种不同的LGG?浓缩物和两种不同的干酪乳杆菌 431?浓缩物以便测试可重复性。此外，制备两种不同的制剂，两种制剂之间的差异为组合 物2不包含藻酸盐，而组合物_包含30g藻酸钠/kg洗涤过的浓缩物。将混合物搅拌直至添 加剂溶解并在液氮中冷冻。之后将该混合物真空干燥。
[0375] 组合物2_:向lOOOg洗涤过的浓缩物添加753g海藻糖+50g菊粉+167g水解酪蛋白 +30g藻酸钠。
[0376] ^7a
[0377] 在密封的袋子中在具有&|: 0.3的婴儿奶粉中在35°C储存后的储存稳定性数据 (log(CFU/g)
[0378]

[0379] ^7b
[0380] 在密封的袋子中在具有&|: 0.3的婴儿奶粉中在40°C储存后的储存稳定性数据 (log(CFU/g)
[0381]
[0382] 结论：
[0383] 从表7a和7b以及图3-6,证明关于稳定性在含有或不含有藻酸钠的组合物之间基 本上没有差异。
[0384] 实施例9
[0385] 对含有和不含有藻酸盐的3LGG?组合物的热处理
[0386] 如上面实施例8中所述制备LGG?的10%浓缩物并将其加入至组合物2或组合物 2_中。由于热处理与生产规模产品相关，将两种组合物进行热处理以比较含有或不含有 藻酸盐的组合物的稳定性。使用在上面实施例4中所述的参考1中含有LGG?的婴儿奶粉 作为参考。
[0387] ^8
[0388] 在密封的袋子中在具有&|: 0.25的婴儿奶粉中在35°C储存后的储存稳定性数据 (log(CFU/g)
[0389]
[0390] 结论：
[0391] 从表8和图7,看出对于含有藻酸钠的组合物，热处理对稳定性具有负面影响。
【主权项】
1. 一种干燥组合物，其包含109-1013cfu/g所述组合物的乳酸菌细胞，其中所述组合物 的特征在于其还包含下列量的保护剂（以下所有量的保护剂均相对于所述组合物中lg乳酸 菌细胞确定）： 6-9g海藻糖， Ο.Ι-lg菊粉和 0.5-3g水解酪蛋白，并且 所述组合物不包含藻酸盐。2. 根据权利要求1所述的干燥组合物，其包含75-80% (w/w)海藻糖、3-10% (w/w)菊粉 和15-20% (w/w)水解酪蛋白。3. 根据权利要求1或2所述的干燥组合物，其中所述乳酸菌是选自由下列组成的组的至 少一个乳酸菌的种：乳球菌属(Lactococcus)种、链球菌属（Streptococcus)种、肠球菌属 (Enterococcus)种、乳杆菌属(Lactobacillus)种、明串珠菌属(Leuconos toe)种、双歧杆菌 属(Bifidobacterium)种、丙酸菌(Prop ioni)和片球菌属(Pediococcus)种。4. 根据权利要求3所述的干燥组合物，其中所述乳酸菌是选自由下列组成的组的至少 一种乳酸菌：鼠李糖乳杆菌（Lac tobac i 11 us rhamnosus )、乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种（Lactococcus lactis subsp. cremoris)、乳明串珠菌（Leuconostoc lactis)、肠膜明串珠菌乳脂亚种 (Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris)、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus)、乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酰生物突变株（Lactococcus lactis subsp · lactis biovar .diacetylactis)、干酪乳杆菌干酪亚种（Lactobacillus casei 81^8卩.〇386；〇、嗜热链球菌（31：代卩1：0〇0〇〇118 1：1161'1110卩11；[1118)、肠球菌属，诸如屎肠球菌 (Enterococcus faecum)、动物双歧杆菌（Bifidobacterium animal is)、乳双歧杆菌 (Bifidobacterium lactis)、长双歧杆菌（Bifidobacterium longum)、乳酸乳杆菌 (Lactobacillus lactis)、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus)、发酵乳杆菌 (Lactobacillus fermentum)、唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius)、德氏乳杆菌保加 利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)和嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus)。5. 根据权利要求4所述的干燥组合物，其中所述乳酸菌是选自由下列组成的组的至少 一种乳酸菌：保藏为DSM 15954、ATCC 27536和DSM 10140的动物双歧杆菌乳亚种 (Bifidobacterium animalis subsp lactis)，保藏为DSM 13241 的嗜酸乳杆菌，保藏为 ATCC 53103的鼠李糖乳杆菌，保藏为ATCC 55826的鼠李糖乳杆菌，保藏为ATCC 55845的罗 伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)，保藏为ATCC 55544的类干酪乳杆菌类干酪亚种 (lactobacillus paracasei subsp.pracasei)，保藏为LMG-17806的类干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei)，保藏为DSM 15957的嗜热链球菌，保藏为NM02/31074的发酵 乳杆菌，保藏为CCTCC M204012的类干酪乳杆菌类干酪亚种。6. 根据权利要求1-5中任一项所述的干燥组合物，其中所述干燥组合物的重量为50g-1000kg,诸如例如 100g-1000kg 或 lkg-1000kg。7. -种婴儿奶粉，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的组合物。8. -种食品，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的组合物。9. 一种膳食补充剂，其包含根据权利要求1-8中任一项所述的组合物。10. -种制备根据权利要求1-6中任一项所述的干燥组合物的方法，其中制备所述干燥 组合物的方法包括以下步骤： (a) :发酵LAB细胞和收获所述细胞以得到包含所述LAB细胞和水的LAB细胞浓缩物-其 中所述浓缩物包含l〇8_l〇 14cfu/g浓缩物干物质的乳酸菌(LAB)细胞； (b) :将适当量的一种或多种保护剂与所述LAB细胞浓缩物混合以形成浆料-其中所述 浆料包含6-9g海藻糖、Ο.Ι-lg菊粉和0.5-3g水解酪蛋白的量的保护剂并且不包含藻酸盐-其中保护剂的量相对于所述浆料中lg乳酸菌细胞确定，并且保护剂和乳酸菌细胞的量两者 均以浆料中的干物质测量； (c) :冷冻所述浆料以形成固体冷冻颗粒/小丸； (d) :用2kg/m2-50kg/m2的冷冻颗粒/小丸装载托盘以在所述托盘上得到本文相关的材 料； (e) :在其中材料的温度不达到那么高以致超过75%的所述LAB细胞失活的温度下，在 0.7-2毫巴(mbar)的真空压力下初次干燥所述托盘上的材料，持续一时间段直至步骤(b)的 浆料的至少90%的水被移除；以及 (f) :在其中材料的温度不达到那么高以致超过75%的所述LAB细胞失活的温度下，在 0.01-0.6毫巴(mbar)的真空压力下二次干燥步骤(e)的材料，持续足以将水分活性(a w)减 少至小于0.30的时间段，从而获得所述干燥组合物，所述干燥组合物包含： 109-1013cfu/g所述组合物的乳酸菌细胞，其中所述组合物的特征在于其还包含下列量 的保护剂（以下所有量的保护剂均相对于所述组合物中lg乳酸菌细胞确定）： 6_9g海藻糖， Ο.Ι-lg菊粉和 0.5-3g水解酪蛋白，并且 所述组合物不包含藻酸盐。11. 权利要求1 〇所述的方法，其中： 在权利要求10的步骤(e)中，所述材料的温度不达到那么高以致多于10%的所述LAB细 胞失活；以及 在权利要求10的步骤(f)中，所述材料的温度不达到那么高以致多于10%的所述LAB细 胞失活。12. 权利要求10或11所述的方法，其中所述组合物包含75-80 % (w/w)海藻糖、 3-10% (w/w)菊粉和15-20% (w/w)水解酪蛋白。
【文档编号】A23G1/42GK105996051SQ201610312935
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2012年6月30日
【发明人】比吉特·伊德, 雅各布·布伦克·斯文森
【申请人】科.汉森有限公司