添加发酵剂的大黄鱼腌制方法
【专利摘要】本发明公开了一种添加发酵剂的大黄鱼腌制方法，包括如下步骤：将尼泊尔葡萄球菌培养液、木糖葡萄球菌培养液进行混合，得复合微生物菌液；新鲜大黄鱼去内脏，流水清洗后沥干水，得处理后鱼体；按照106/g接种量，先将复合微生物菌液均匀喷施接种于鱼体表面及腹腔内部；然后分3次加盐进行腌制。本发明不但能改善腌制大黄鱼产品的风味，还能提高其安全性。
【专利说明】
添加发酵剂的大黄鱼腌制方法
技术领域
[0001] 本发明属于食品加工领域，具体涉及一种大黄鱼添加发酵微生物的腌制工艺。
【背景技术】
[0002] 大黄鱼是我国重要的海洋经济鱼类，因其营养丰富、味道鲜美而深受广大消费者 喜爱。自大黄鱼人工饲养技术推广开来，养殖大黄鱼的数量与日倶增。大黄鱼大多以冰鲜鱼 的形式销售，部分经脱脂加工成冷冻脱脂大黄鱼，加工比例较低。然而，面对饮食多元化的 市场需求以及日益增加的大黄鱼产量，开发种类丰富的大黄鱼加工制品不仅能够满足市场 需求，同时会提高大黄鱼的附加值。腌制是一种传统的加工方式，腌制过程中微生物和原料 中内源酶的共同作用赋予了产品特殊的风味与品质，然而由于传统腌制过程多采用自然发 酵的方式，发酵微生物主要来自原料及加工环境，若条件控制不当，极易造成产品品质不稳 定或有害微生物滋生引起生物危害因子。
[0003]发酵剂(Starter culture)是指用于发酵产品生产的微生物培养物或富集了发酵 微生物的一些基质(Holzapfel，1997)。发酵剂的筛选和添加决定着发酵成品的特性。目前， 欧美国家人工筛选的发酵剂(Selected starter cultures，SSC)在发酵乳制品、发酵香肠、 葡萄酒、发酵蔬菜等多种发酵食品加工行业已广泛使用（Cogan et al.，2007)。酵母菌、乳 酸菌中的许多种属已经被开发为食品工业生产发酵剂，而其他一些种类的微生物也正在被 研制开发(Gaggiano et al.，2007)。与自然发酵相比，发酵剂的使用有利于食品加工行业 更好地控制产品生产过程中工艺参数、实现生产机械化、提高产品的安全性、保持不同批次 产品质量的一致性并且确保产品品质。
[0004] 腌制鱼、肉制品生产过程中，大多数有害微生物的生长在高盐的环境下受到抑制， 而适合高盐环境中生长的葡萄球菌则能够分泌大量脂肪酶和蛋白酶，进而将原料中脂肪和 蛋白质等大分子降解成脂肪酸、氨基酸等小分子风味物质。Stahnke在香肠生产中添加了木 糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)和肉葡萄球菌(S.carnosus)作为发酵剂，GC-MS对 产品风味成分分析显示，大部分风味物质均来自添加微生物所分泌酶系对蛋白质和脂肪大 分子的降解。
[0005] 人工筛选发酵剂的方法不仅能够保证腌制产品批次之间的一致性，同时添加的有 益微生物能够抑制原料自身携带有害微生物的滋生、提高产品的安全性，并且，筛选出的产 酶能力优异的微生物能够在腌制过程中充分水解蛋白质和脂肪等大分子，提高产品的风味 品质。目前，用于大黄鱼腌制发酵剂的制备方法还未见报道。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种添加发酵剂的大黄鱼腌制方法，本发明通过 添加发酵剂改善腌制大黄鱼产品的风味、提高其安全性。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种添加发酵剂的大黄鱼腌制方法，包括如 下步骤：
[0008] 1)、葡萄球菌发酵菌的活化；
[0009] 将尼泊尔葡萄球菌、木糖葡萄球菌分别进行活化；
[0010] 2)、将活化后的尼泊尔葡萄球菌、木糖葡萄球菌分别于改良MSA液体培养基中进行 扩大培养，直至〇D60tom均为0.6~0.8，从而分别获得尼泊尔葡萄球菌培养液、木糖葡萄球菌 培养液；
[0011]所述改良MSA液体培养基为在100ml的MSA液体培养基中加入7.5~8.5g(较佳为 8g)NaCl配制而得；
[0012] 3)、将尼泊尔葡萄球菌培养液、木糖葡萄球菌培养液进行混合，所得的复合微生物 菌液中尼泊尔葡萄球菌的细胞个数=木糖葡萄球菌的细胞个数；
[0013] 4)、鲜鱼前处理：
[0014]新鲜大黄鱼去内脏(剖开腹部后去除内脏），流水清洗后沥干水，得处理后鱼体；
[0015] 5)、接种复合发酵剂：
[0016] 按照106/g接种量，将复合微生物菌液均匀喷施接种于鱼体表面及腹腔内部，室温 静置1.5~2.5h(较佳为2h)，得接种后鱼体；
[0017] 备注说明：
[0018]依据微生物计数，并计算鱼体重量;上述106个(细胞)/g(处理后鱼体）的接种量， 是指两种菌的总量之和，即，尼泊尔葡萄球菌为0.5 X 106个/g，木糖葡萄球菌也为0.5 X 106 个/g;
[0019] 6)、第一次加盐：
[0020] 称取占处理后鱼体重量4.5~5.5 % (较佳为5 % )的食盐，将食盐均匀涂抹于接种 后鱼体表面，然后用保鲜膜覆盖鱼体，于20~25°C下腌制22~26小时（较佳为22°C、24小 时）；得初步腌制后鱼体；
[0021] 7)、第二次加盐：
[0022]称取占处理后鱼体重量9~11 % (较佳为10%)的食盐，先将初步腌制后鱼体沥干 血水，然后将食盐均匀涂抹于鱼体的腹部和表面；
[0023]按照鱼腹朝上的方式竖直排列后置于无菌保鲜箱中，在鱼上方施以鱼体总重35~ 45%(较佳为40%)的压力，于20~25°C腌制4~6天(较佳为22°C、5天），得二次腌制后鱼体； [0024] 8)、第三次加盐：
[0025] 称取占处理后鱼体重量9~11 % (较佳为10%)的食盐，将食盐均匀涂抹在二次腌 制后鱼体的表面，在鱼上方施以鱼体总重13~18% (较佳为15%)的压力，于20~25°C下腌 制 13~15d(较佳为22°C、14d)。
[0026] 备注说明：上述步骤7)和步骤8)中，"鱼体总重"均是按照处理后鱼体重量来计算 的。
[0027] 步骤8)中鱼体的叠放排列方式同步骤7)。
[0028] 作为本发明的添加发酵剂的大黄鱼腌制方法的改进：
[0029] 尼泊尔葡萄球菌为尼泊尔葡萄球菌L1-1;
[0030] 木糖葡萄球菌为木糖葡萄球菌S10-10。
[0031] 上述菌株在Microbiological Changes and Biodiversity of Cultivable Indigenous Bacteria in Sanbao Larger Yellow Croaker(Pseudosciaena crocea),a Chinese Salted and Fermented Seafood.Journal of Food Science.2015,80(4):M776 ~M781中有明确告知。
[0032 ]作为本发明的添加发酵剂的大黄鱼腌制方法的进一步改进：
[0033]所述步骤7)中，将占食盐总重的38~42%(较佳为40%)的部分食盐均匀涂抹于鱼 体的腹部，将剩余的食盐均匀涂抹于鱼体的表面。
[0034] 作为本发明的添加发酵剂的大黄鱼腌制方法的进一步改进：
[0035] 所述步骤7)中，先按照鱼腹朝上的方式竖直排列然后层层叠放(上下叠放)后置于 无菌保鲜箱中；在鱼层上方施以叠放后鱼体总重35~45% (较佳为40% )的压力后进行腌 制；
[0036] 最多叠放3层(即，在本发明中，最少1层，最多为3层）。
[0037] 作为本发明的添加发酵剂的大黄鱼腌制方法的进一步改进：
[0038]所述步骤2)的扩大培养于摇床中进行，培养温度为29~31°C (较佳为30 °C )，摇床 转速为80~120rpm(较佳为lOOrprn)，培养直至0D6(x)r?为0.6~0.8。
[0039] 一般而言，将4mL步骤1)所得的活化好的菌液加入至80mL改良MSA液体培养基进行 扩大培养;按照上述条件，培养48h，能使0D6QQr?为0.6~0.8。
[0040] 作为本发明的添加发酵剂的大黄鱼腌制方法的进一步改进：
[0041] 所述步骤1)的活化为：
[0042]将保藏于-80 °C的尼泊尔葡萄球菌、木糖葡萄球菌的30%甘油菌液均分别进行如 下步骤：
[0043] 待恢复至室温后，取500yL甘油菌液添加至4mL改良MSA液体培养基中，29~31°C (较佳为30°C)培养至少48h。
[0044]备注说明：初次对保藏于-80°C、30%的甘油菌液进行活化时，菌株生长比较缓慢， 培养时间至少48或适时延长培养时间至72h。
[0045] 30 %甘油菌液，是指含有30 % (v/v)甘油的菌液。
[0046]在本发明中，室温一般是指15~25°C。
[0047] 本发明所使用的微生物均分离自大黄鱼腌制过程，属于大黄鱼腌制工艺中内源性 微生物菌株。本发明的工艺主要包括葡萄球菌发酵菌株活化、发酵菌株的扩大培养、确定复 合微生物发酵剂中两种菌株的细胞数量范围、鲜鱼前处理、接种复合发酵剂以及3次加盐腌 制。
[0048] 本发明研究了从腌制大黄鱼中共分离出的木糖葡萄球菌（S.xylosus)、腐生葡萄 球菌（3.83口1'<^1171：；[(3118)、尼泊尔葡萄球菌（3.116。316118丨8)、金黄色葡萄球菌(3.311代118)、 小牛葡萄球菌（S. vitulinus)、松鼠葡萄球菌(S. sciuri)、马胃葡萄球菌（S. equorum)和琥 珀葡萄球菌(S.suCCinus)8种葡萄球菌，其中金黄色葡萄球菌为致病菌;而其余7种中，小牛 葡萄球菌(S. vitulinus)、松鼠葡萄球菌(S. sciuri)、马胃葡萄球菌(S. equorum)和琥?白葡 萄球菌（S.succinus)分离数量非常少(各2~3株）。本发明经大量实验证明尼泊尔葡萄球 菌、木糖葡萄球菌复配所得的复合微生物菌液效果最佳。
[0049] 本发明提供的复合微生物发酵剂，将耐盐、具高蛋白酶活性的两种微生物进行复 配，提高了腌鱼生产中蛋白质的水解率，增加了腌制产品中氨基酸的含量，提高了产品的风 味。
【具体实施方式】
[0050] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此。
[0051] 实施例1、一种添加发酵剂的大黄鱼腌制方法，依次进行如下步骤：
[0052] 1)、葡萄球菌发酵菌的活化；
[0053]将尼泊尔葡萄球菌L1-1、木糖葡萄球菌S10-10分别进行活化；
[0054] 具体为：
[0055]将保藏于_80°C的30%甘油菌液(尼泊尔葡萄球菌L1-1、木糖葡萄球菌S10-10)取 出后，分别均进行如下步骤：
[0056]待恢复至室温后，取500yL甘油菌液添加至4mL改良MSA液体培养基中，30°C培养 48h；
[0057] 改良MSA液体培养基为在100ml的MSA培养基中加入8g NaCl配制而得。
[0058] 2)、将活化后的尼泊尔葡萄球菌L1-1、木糖葡萄球菌S10-10分别进行如下的扩大 培养：
[0059]取4mL步骤1)所得的活化好的培养物加入至80mL改良MSA液体培养基中、于摇床中 进行扩大培养;培养温度为30°C，摇床转速为lOOrpm;培养直至OD6QQnmS〇. 6~0.8;从而分别 获得尼泊尔葡萄球菌L1-1培养液、木糖葡萄球菌S10-10培养液；
[0060] 3)、将尼泊尔葡萄球菌Ll-ι培养液、木糖葡萄球菌S10-10培养液进行混合，所得的 复合微生物菌液中尼泊尔葡萄球菌L1-1的细胞个数=木糖葡萄球菌S10-10的细胞个数； [0061 ] 4)、鲜鱼前处理：
[0062]挑选个体完整、大小均一的新鲜大黄鱼，剖开腹部后去除内脏，用干净的流水将鱼 体表面和腮部、腹腔清洗干净，沥干水，得处理后鱼体;称重；
[0063] 5)、接种复合发酵剂：
[0064]按照106/g接种量，将复合微生物菌液均匀喷施接种于鱼体表面及腹腔内部，室温 静置2h;得接种后鱼体；
[0065]所述106/g接种量是指:每g处理后鱼体配用含有106个菌的复合微生物菌液;即，尼 泊尔葡萄球菌L1-1、木糖葡萄球菌S10-10的接种量均分别为0.5 X 106个/g。
[0066] 6)、第一次加盐：
[0067]称取占处理后鱼体重量5%的食盐，将食盐均匀涂抹于接种后鱼体表面，然后用保 鲜膜覆盖鱼体，于22 °C腌制24小时;得初步腌制后鱼体；
[0068] 7)、第二次加盐：
[0069]称取占处理后鱼体重量10 %的食盐，先将初步腌制后鱼体沥干血水，然后将占该 食盐总重的40 %的部分食盐均匀涂抹于鱼体的腹部，将剩余的食盐均匀涂抹于鱼体的表 面;即，按照食盐比例为鱼腹:鱼表= 2:3,将食盐均匀涂抹于鱼腹腔及体表。
[0070] 先按照鱼腹朝上的方式竖直排列然后层层叠放(上下叠放)后置于无菌保鲜箱中， 叠放3层；在鱼层上方施以叠放后鱼体总重40%的压力，于22°C腌制5天，得二次腌制后鱼 体。
[0071] 8)、第三次加盐：
[0072]称取占处理后鱼体重量10%的食盐，将食盐均匀涂抹在二次腌制后鱼体的表面， 在鱼上方施以鱼体总重15 %的压力，于22°C腌制14d。
[0073]备注说明：上述步骤7)和步骤8)中，"鱼体总重"均是按照处理后鱼体重量来计算 的。步骤8)中鱼体的叠放排列方式同步骤7)。
[0074]对比例1、传统高盐腌制大黄鱼
[0075] 以冰鲜大黄鱼为原料，依次进行以下步骤：
[0076] 1)挑选个体完整、大小均一的新鲜大黄鱼，用干净的流水将鱼体表面和腮部清洗 干净，沥干水，称重；
[0077] 2)第一次加盐:称取10%鱼体湿重的食盐，均匀涂抹于鱼体表面，用保鲜膜覆盖鱼 体，30°C腌制24h。
[0078] 3)第二次加盐:沥干血水，按照食盐比例为鱼腹:鱼表=4:5，用木筷将食盐从鱼鳃 处通入大黄鱼鱼腹内，剩余食盐涂抹于鱼体表面后鱼腹朝上，将其有层次地排列在无菌保 鲜箱中（叠放层数同实施例1的3层），在鱼层上方施以鱼体重40%的压力，30°C腌制5d(加盐 量为鱼体湿重的20%)。
[0079] 4)第三次加盐:将食盐涂抹在鱼体表面，上层施加鱼重的40 %的压力，且于温度30 °C下腌制14d(加盐量为鱼体湿重的20% )。
[0080] 对比例2、不添加微生物发酵剂的大黄鱼腌制：
[0081] 相对于实施例1而言，取消步骤1)~步骤3)以及步骤5)，即，将步骤4)所得的处理 后鱼体直接进行步骤6)所述的第一次加盐，其余等同于实施例1。
[0082] 对比例3-1、取消木糖葡萄球菌S10-10的使用，使步骤5)中尼泊尔葡萄球菌L1-1接 种量为l〇6/g(即，总菌量仍然同实施例1);其余等同于实施例1。
[0083]对比例3-2、取消尼泊尔葡萄球菌L1 -1的使用，使步骤5)中木糖葡萄球菌S10-10的 接种量为l〇6/g(即，总菌量仍然同实施例1);其余等同于实施例1。
[0084] 对比例3-3、将木糖葡萄球菌S10-10改成菌腐生葡萄球菌S5-8,其余等同于实施例 1〇
[0085] 对比例3-4、将尼泊尔葡萄球菌L1-1改成菌腐生葡萄球菌S5-8,其余等同于实施例 1〇
[0086]对比例3-5、将木糖葡萄球菌S10-10改成菌小牛葡萄球菌SX8,其余等同于实施例 1〇
[0087] 对比例3-6、将尼泊尔葡萄球菌L1-1改成小牛葡萄球菌SX8,其余等同于实施例1。
[0088] 对比例3-7、将复合微生物菌液中，尼泊尔葡萄球菌L1-1的细胞个数:木糖葡萄球 菌S10-10的细胞个数由1:1改成1.5:1;总的接种量保持不变，仍为10 6/g;其余等同于实施 例1〇
[0089] 对比例3-8、将复合微生物菌液中，尼泊尔葡萄球菌L1-1的细胞个数:木糖葡萄球 菌S10-10的细胞个数由1:1改成1:1.5;总的接种量保持不变，仍为10 6/g;其余等同于实施 例1〇
[0090] 对比例4、将实施例1的步骤7)中食盐比例由"鱼腹:鱼表=2:3"改成如同常规技术 的"鱼腹:鱼表= 4:5"，其余等同于实施例1。
[0091] 对上述不同腌制条件产品的氨基酸总量、含盐率及组胺含量的测定。测定结果见 表1。
[0092] 表 1
[0093]
[0095] 从表1可以得出，传统工艺腌制大黄鱼是在30°C的高盐(50%)条件下完成的，尽管 高温条件下微生物产酶及鱼体内源酶活力较高，促进了鱼肉蛋白的降解为滋味丰富的氨基 酸小分子，但传统高温、高盐腌制也使产品存在含盐量过高(35.61 % )的缺点。此外，传统工 艺中的高温条件腌制，尽管获得了风味较好的产品，但同时也带来了产品组胺含量升高的 缺陷。对比例1中，组胺含量高达91.67mg/kg，高于美国FDA要求的进□水产品中组胺不得超 过50mg/kg的限量，而接近欧盟规定的水产品中组胺含量不得高于100mg/kg的限量上限。鱼 和鱼制品中的组胺超标可能导致食物中毒，而高浓度的组胺可导致人体敏感体质的过敏症 状。采用控制腌制温度的方法可以有效地减少产品中组胺的积累，同时可以有效地降低腌 制过程中食盐的使用量。然而，低温腌制条件下，来自原料中微生物以及鱼体本身内源酶活 力较低，鱼肉蛋白水解程度远不及传统高温腌制工艺。如在低温腌制过程中加入产蛋白酶 活力较强的复合微生物发酵剂，原料中鱼肉蛋白会被发酵剂微生物所产蛋白酶逐级分解， 进而促使氨基酸大量积累(24.75g/100g，见实施例1)。
[0096] 根据上述对比例，我们得知:不同的发酵菌的选用，对所得产物的氨基酸总含量及 组胺含量具有较大的影响。同时，单独添加木糖葡萄球菌S10-10或单独添加尼泊尔葡萄球 菌L1-1进行腌鱼生产，其产品氨基酸含量均低于两者等比例添加(实施例1)的效果;而用腐 生葡萄球菌S-8或小牛葡萄球菌SX8分别替换本发明中的两株供试菌株时，产品的氨基酸总 量均低于实施例1，而组胺含量却远高于实施例1所获产品。
[0097]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 添加发酵剂的大黄鱼腌制方法，其特征是包括如下步骤： 1) 、葡萄球菌发酵菌的活化； 将尼泊尔葡萄球菌、木糖葡萄球菌分别进行活化； 2) 、将活化后的尼泊尔葡萄球菌、木糖葡萄球菌分别于改良MSA液体培养基中进行扩大 培养，直至〇D6Qtom均为0.6~0.8,从而分别获得尼泊尔葡萄球菌培养液、木糖葡萄球菌培养 液； 所述改良MSA液体培养基为在100ml的MSA液体培养基中加入7.5~8.5gNaCl配制而得； 3) 、将尼泊尔葡萄球菌培养液、木糖葡萄球菌培养液进行混合，所得的复合微生物菌液 中尼泊尔葡萄球菌的细胞个数=木糖葡萄球菌的细胞个数； 4) 、鲜鱼前处理： 新鲜大黄鱼去内脏，流水清洗后沥干水，得处理后鱼体； 5) 、接种复合发酵剂： 按照l〇6/g接种量，将复合微生物菌液均匀喷施接种于鱼体表面及腹腔内部，室温静置 1.5~2.5h，得接种后鱼体； 6) 、第一次加盐： 称取占处理后鱼体重量4.5~5.5%的食盐，将食盐均匀涂抹于接种后鱼体表面，然后 用保鲜膜覆盖鱼体，于20~25°C下腌制22~26小时;得初步腌制后鱼体； 7) 、第二次加盐： 称取占处理后鱼体重量9~11 %的食盐，先将初步腌制后鱼体沥干血水，然后将食盐均 匀涂抹于鱼体的腹部和表面； 按照鱼腹朝上的方式竖直排列后置于无菌保鲜箱中，在鱼上方施以鱼体总重35~45% 的压力，于20~25°C腌制4~6天，得二次腌制后鱼体； 8) 、第三次加盐： 称取占处理后鱼体重量9~11%的食盐，将食盐均匀涂抹在二次腌制后鱼体的表面，在 鱼上方施以鱼体总重13~18%的压力，于20~25°C下腌制13~15d。2. 根据权利要求1所述的添加发酵剂的大黄鱼腌制方法，其特征是： 尼泊尔葡萄球菌为尼泊尔葡萄球菌L1-1; 木糖葡萄球菌为木糖葡萄球菌S10-10。3. 根据权利要求2所述的添加发酵剂的大黄鱼腌制方法，其特征是： 所述步骤7)中，将占食盐总重的38~42%的部分食盐均匀涂抹于鱼体的腹部，将剩余 的食盐均匀涂抹于鱼体的表面。4. 根据权利要求1~3任一所述的添加发酵剂的大黄鱼腌制方法，其特征是： 所述步骤7)中，先按照鱼腹朝上的方式竖直排列然后层层叠放后置于无菌保鲜箱中； 在鱼层上方施以叠放后鱼体总重35~45%的压力后进行腌制； 最多叠放3层。5. 根据权利要求1~3任一所述的添加发酵剂的大黄鱼腌制方法，其特征是： 所述步骤2)的扩大培养于摇床中进行，培养温度为29~31°C，摇床转速为80~120rpm， 培养直至〇D6QQr?为0.6~0.8。6. 根据权利要求1~3任一所述的添加发酵剂的大黄鱼腌制方法，其特征是： 所述步骤1)的活化为： 将保藏于-80°c的尼泊尔葡萄球菌、木糖葡萄球菌的30%甘油菌液均分别进行如下步 骤： 待恢复至室温后，取500yL甘油菌液添加至4mL改良MSA液体培养基中，29~31°C (较佳 为30°C)培养至少48h。
【文档编号】A23L17/00GK106036574SQ201610429492
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】吴佳佳, 戴志远, 蔡瑞康
【申请人】浙江工商大学