液体乳糖酶组合物的制作方法

文档序号:10692774阅读:1010来源:国知局
液体乳糖酶组合物的制作方法【专利摘要】本发明提供含水的液体乳糖酶制剂,所述乳糖酶制剂包含乳糖酶并且还包含L?乳酸钠、L?乳酸钙或L?乳酸钾或其组合和任选地糖,和/或任选地包含氯化钠或氯化钾或其组合,优选地其中每种组分的浓度使得水活性Aw为至多0.82。该制剂在使用不含转化酶的乳糖酶时是特别合适的,从而允许使用蔗糖作为稳定剂。本发明还提供生产本发明的液体乳糖酶制剂的方法、包含本发明的液体乳糖酶制剂的婴儿配方(例如,作为颗粒粉末)、生产所述婴儿配方的方法、以及所述制剂在生产婴儿配方中的用途。【专利说明】液体乳糖酶组合物发明领域[0001]本发明涉及液体乳糖酶制剂;其生产方法;生产婴儿(infant,亦称一段)配方、较大婴儿(follow-on,亦称二段)配方或幼儿(toddler,亦称三段)配方的方法;包含乳糖酶制剂的婴儿配方、较大婴儿配方或幼儿配方;和所述制剂在生产婴儿配方、较大婴儿配方或幼儿配方中的用途。[0002]发明背景[0003]乳糖酶或β-半乳糖苷酶(E.C:3.2.1.23)是催化乳糖(二糖)水解成其组分单糖葡萄糖和半乳糖的酶。乳糖酶存在于乳制品中,更具体地乳、脱脂乳、奶油、酸奶、冰激凌和其他乳制品中。[0004]在青少年和乳糖耐受人群中,乳糖在空肠的小肠刷状缘处被"乳糖酶-根皮苷水解酶"(LPH)水解为半乳糖和葡萄糖。在人类中,LPH由单个乳糖酶基因LCT编码,且已发现成人消化乳糖的能力归因于基因表达的顺式作用突变并且以显性方式遗传。与单糖(即,葡萄糖和半乳糖)相比,乳糖在小肠的吸收很差。未携带LCT基因突变的人不能消化和吸收乳糖,且吸收不良的乳糖将以渗透方式吸引流体进入肠腔,这将导致便溏。此外,乳糖是代谢其的结肠中的肠道细菌的底物,从而产生挥发性脂肪酸和气体例如二氧化碳、氢气和甲烷,进而导致肠胃气胀和痉挛。目前估计仅25-30%的世界人口携带LCT基因突变并且在成年期还能够在小肠中消化乳糖。剩余的世界人口具有不同的乳糖消化问题,这往往导致乳制品摄入减少。这类个体被称为"乳糖不耐受者"。由于乳制品中存在一些维生素、蛋白质和矿物质,所以其是健康饮食的重要组分,因此上述情况是不想要的。[0005]已经关于多种生物体(包括微生物)描述并从其中分离了乳糖酶。乳糖酶往往是微生物(如Kluyveromyces和Bacillus)的细胞内组分。Kluyveromyces和,特别地,1(.;1^&8;[1丨8、1(.1]1&^丨&11118和1(.1&(31:丨8以及其他酵母,例如0&11(1丨(1&、1'〇1'111&和1'〇1'111(^818属的那些,是酵母乳糖酶的常见来源,而B.coagulans或Bcirculans是众所周知的细菌乳糖酶来源。一些来源于这些生物体的商业乳糖酶制品是可得的,例如Maxilact(来自K.lactis,由DSM,Delft,荷兰生产)。所有这些乳糖酶均是所谓的中性乳糖酶,因为它们的最适pH介于pH=6和pH=8之间,一些生物体例如Aspergillusniger和Aspergillusoryzae能够生产细胞外乳糖酶,且美国专利号5736374描述了由Aspergillusoryzae生产的此类乳糖酶的实例。乳糖酶的酶学性质(如最适pH和最适温度)因物种而异。一般而言,然而,分泌的乳糖显示出pH=3.5至pH=5.0的较低最适pH(酸性乳糖酶);对于中性乳糖酶,细胞内乳糖酶通常显示出在pH=6.0至pH=7.5区域的较高最适pH,但这些一般规则存在例外。[0006]目前,乳糖酶以液体形式配制和商业销售。在生产液体制剂时,有两个因素至关重要,即微生物稳定性和酶稳定性。微生物稳定性表示液体制剂保持不含微生物,或者至少微生物的生长被阻止或减慢。[0007]市场上目前有一些液体乳糖酶产品。它们(仅中性乳糖酶)的实例有由Novozymes出售的LactozymPure6500L;由Chr.Hansen出售的Ha-Lactase5200;由DuPont-Danisco出售的GODOYNL-2;由DSMFoodSpecialties出售的LGX5000和LGi。所有以上产品,且事实上目前市场上的所有液体乳糖酶制剂均含50%甘油。已发现甘油能够提供同时良好的微生物稳定性和酶稳定性。甘油的量使得水活性(Aw)为至多0.82。这防止微生物生长。此外,甘油还提供酶稳定性。商业乳糖酶溶液的典型强度为约1000NLU/g、2000NLU/g或5000NLU/g。术语NLU/g指的是每克终产物中乳糖酶活性的量。[0008]乳糖酶的一种重要工业应用是生产用于乳糖不耐受个体的乳糖经水解的乳制品。这种经水解的乳制品包括巴士灭菌乳、UHT-乳、利用或者不利用中间处理步骤(例如蛋白质水解)由其原始成分的全部或者部分复原的乳,和婴儿配方。[0009]乳糖酶的一种特别有趣的应用是婴儿配方、较大婴儿配方或幼儿配方。婴儿配方是为喂养小于12个月的婴儿和婴孩(baby)而设计和销售的制造食品,其通常由粉末(与水混合)或液体(含有或不含附加水)被制备用于奶瓶喂养或杯子喂养。美国联邦食品、药物与化妆品法案(FrocA)将婴儿配方定义为"由于其模拟人乳或者其适合作为人乳的完全或部分替代物,声称是或者展示为单独作为婴儿食品的特殊饮食的食品"。最常用的婴儿配方含有纯化的牛乳清和酪蛋白作为蛋白质来源,植物油共混物作为脂肪来源,乳糖作为碳水化合物来源,维生素-矿物质混合物,和其他成分(取决于制造商)。[0010]目前可得的乳糖酶制剂的一个问题是:在许多国家,法律禁止向婴儿、较大婴儿或幼儿配方中添加甘油或其中遗留甘油。这使得目前的乳糖酶制剂(均包含甘油)不适合用来生产婴儿配方、较大婴儿配方或幼儿配方。因此,需要适合婴儿配方、较大婴儿配方或幼儿配方的且实质上不含甘油的稳定的液体乳糖酶制剂。[0011]发明概述[0012]本发明提供稳定的含水的液体乳糖酶制剂,其适合用于婴儿配方、较大婴儿配方或幼儿配方且不含甘油。所述稳定的乳糖酶制剂包含至少20重量%的1^_乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或其组合,优选地其中每种组分的浓度使得水活性Aw为至多0.82。所述制剂中任选的组分的一种实例是糖。所述制剂中任选的组分的另一实例是氯化钠或氯化钾或其组合。所述制剂中组合的任选的组分的一种实例是氯化钠或氯化钾或其组合以及糖。所述制剂在使用不含转化酶的乳糖酶时是特别合适的,从而允许使用蔗糖作为稳定剂。本发明还提供生产本发明的液体乳糖酶制剂的方法,包含本发明的液体乳糖酶制剂的婴儿配方、较大婴儿配方或幼儿配方(例如,作为颗粒粉末),生产所述婴儿配方、较大婴儿配方或幼儿配方的方法,以及所述制剂在生产婴儿配方、较大婴儿配方或幼儿配方中的用途。[0013]发明详述[0014]除非另外指出,描述本发明的内容时,不使用数量词时应解释为涵盖单数和复数。提及单数名词(例如,化合物、细胞等)旨在包括复数。[0015]在第一方面,本发明提供含水的液体乳糖酶制剂,所述乳糖酶制剂包含乳糖酶并且还包含至少20重量%的卜乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或其组合,优选地其中每种组分的浓度使得水活性Aw为至多0.82。优选地,本发明提供含水的液体乳糖酶制剂,所述乳糖酶制剂包含乳糖酶并且还包含至少20重量%的1^_乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或其组合,其中每种组分的浓度使得水活性Aw为至多0.82。[0016]在优选的实施方式中,本发明提供含水的液体乳糖酶制剂,所述乳糖酶制剂包含乳糖酶并且还包含至少20重量%的1^-乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或其组合,并且还包含糖,优选地其中每种组分的浓度使得水活性Aw为至多0.82。优选地,本发明提供含水的液体乳糖酶制剂,所述乳糖酶制剂包含乳糖酶并且还包含至少20重量%的1^_乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或其组合,并且还包含糖,其中每种组分的浓度使得水活性Aw为至多0.82。[0017]在优选的实施方式中,本发明提供含水的液体乳糖酶制剂,所述乳糖酶制剂包含乳糖酶并且还包含至少20重量%的1^-乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或其组合,并且还包含氯化钠或氯化钾或其组合,优选地其中每种组分的浓度使得水活性Aw为至多0.82。优选地,本发明提供含水的液体乳糖酶制剂,所述乳糖酶制剂包含乳糖酶并且还包含至少20重量%的L-乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或其组合,并且还包含氯化钠或氯化钾或其组合,其中每种组分的浓度使得水活性Aw为至多0.82。[0018]在优选的实施方式中,本发明提供含水的液体乳糖酶制剂,所述乳糖酶制剂包含乳糖酶并且还包含至少20重量%的1^-乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或其组合,并且还包含糖,并且还包含氯化钠或氯化钾或其组合,优选地其中每种组分的浓度使得水活性Aw为至多0.82。优选地,本发明提供含水的液体乳糖酶制剂,所述乳糖酶制剂包含乳糖酶并且还包含至少20重量%的1^-乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或其组合,并且还包含糖,并且还包含氯化钠或氯化钾或其组合,其中每种组分的浓度使得水活性Aw为至多0.82。[0019]发明人惊奇地发现:不使用甘油时,酶稳定的液体酶制剂是可行的。优选地,所述液体酶制剂还是微生物稳定的。他们发现:当乳糖酶被配制为包含至少20重量%的1^_乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾(优选L-乳酸钠)或其组合和任选地糖和/或任选地包含氯化钠或氯化钾或其组合和任选地乳清蛋白,且水活性为至多0.82的液体时,酶稳定性良好。此外,微生物稳定性也良好。因为乳糖酶自身并不是很稳定,所以这更加令人惊讶。[0020]酶稳定性是对酶活性下降速率的测量。微生物稳定性是对微生物能够在组合物中繁殖和生长的速率的测量。[0021]本发明的乳糖酶制剂优选地适用于婴儿配方、较大婴儿配方或幼儿配方。换言之,乳糖酶制剂可用于生产婴儿配方、较大婴儿配方或幼儿配方的方法中。为此,本发明的乳糖酶制剂优选地实质上不含多元醇或二醇,更优选地不含甘油和/或山梨醇。甘油的量,优选地甘油和山梨醇的量优选地少于45重量%、少于40重量%、更优选地少于35重量%、少于30重量%、少于25重量%、更优选地少于20重量%、少于15重量%、甚至更优选地少于10重量%、少于5重量%。最优选地,乳糖酶不含甘油或任何其他多元醇或二醇。[0022]本发明的乳糖酶制剂优选地还不含例如山梨酸酯和/或苯甲酸酯和/或对羟基苯甲酸酯(对羟基苯甲酸盐的烷基酯)的化合物(防腐剂)。[0023]本发明的乳糖酶制剂的组分(即,稳定剂例如L-乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾、糖、氯化钠或氯化钾)以一定量添加以使得水活性Aw为至多0.82。各个组分的水活性是本领域技术人员已知的,且描述在手册中。本领域技术人员将意识到可以改变和更换制剂中各组分的量以使得水活性保持至多0.82。各组分总体对水活性的贡献是各个组分的贡献之和,即效果是累加的。在本文中使用时,水活性指的是在25°C下测量的值。相对低的水活性可有助于获得期望的微生物稳定性。在本专利申请的上下文中,术语"水活性"用来明确地表达不含或含少量甘油或任何其他多元醇或二醇的货架稳定的(shelf-stable)乳糖酶制剂。[0024]术语"含水的液体乳糖酶制剂"包括包含水,例如至少20重量%的水、例如至少30重量%或40重量%的水的任何组合物或溶液。[0025]本发明的乳糖酶制剂(或乳糖酶制品:这些术语在本文中可交换使用)包含至少20重量%的1^_乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或其组合。乳糖酶制剂可因此包含至少20重量%的L-乳酸钠或至少20重量%的!^-乳酸钙或至少20重量%的!^-乳酸钾或其组合,例如至少20重量%的1^_乳酸钠和L-乳酸钙或至少20重量%的!^-乳酸钠和L-乳酸钾或至少20重量%的L-乳酸钙和L-乳酸钾或至少20重量%的!^-乳酸钠、L-乳酸钙和L-乳酸钾。如果是乳酸盐的组合,则特征"至少20重量%"指的是各个L-乳酸盐的组合浓度。[0026]乳酸钠是乳酸的钠盐。乳酸钙和乳酸钾分别是乳酸的钙盐和钾盐。一般而言,乳酸盐(例如乳酸钠、乳酸钙和乳酸钾)是源于乳酸中和的盐且大部分商业用乳酸是由不含乳品的产品(例如,玉米淀粉、土豆或糖蜜)发酵的。可额外使用糖或木薯粉。然而,一些乳酸是由乳品产品(例如乳清和乳糖)发酵的。乳清由多于6.5%固体构成,所述固体中4.8%是固体乳糖。在某些乳品产品制造期间,当乳清本身作为废物产生时,废乳清通常用来生产乳酸。[0027]乳酸钠、乳酸钙或乳酸钾可以以D型、L型或DL型存在。优选地,仅使用L型。然而,提到L-乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾并不排除少量例如D-乳酸钠、D-乳酸钙或D-乳酸钾(或者DL-乳酸钠、DL-乳酸钙或DL-乳酸钾)的存在。少量D型乳酸钠、乳酸钙或乳酸钾的量等于或低于L型贮存物(stock)中存在的总D型乳酸盐的量的5%、优选地等于或低于L型贮存物中存在的总D型乳酸盐的量的3%。优选地,使用的L乳酸盐是L乳酸钠。[0028]除了乳糖酶和至少20重量%的卜乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或其组合之外,本发明的乳糖酶制剂可还包含糖。优选地,所述糖是蔗糖、果糖、葡萄糖或乳糖或其组合,更优选地所述糖是蔗糖。所用L-乳酸盐和糖的浓度应选择为使得水活性Aw为至多0.82。本领域技术人员能够确定合适浓度而无需任何过度负担。果糖仅用于在较大婴儿配方或幼儿配方中使用的乳糖酶制品。[0029]除了乳糖酶和至少20重量%的卜乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或其组合之外,本发明的乳糖酶制剂可还包含氯化钠或氯化钾或其组合。再次,选择各自的浓度以使得水活性Aw为至多0.82。本领域技术人员能够确定合适浓度而无需任何过度负担。[0030]本发明的乳糖酶制剂可还包含蛋白质,优选地乳清蛋白。液体制剂中乳清蛋白的量优选地介于l_15g/l之间(以β-乳球蛋白测量),更优选地介于3-12g/l之间,更优选地介于4-6g/l之间。[0031]制剂中的乳糖酶优选地是中性乳糖酶。本发明的制剂中乳糖酶(优选地中性乳糖酶)的浓度可以是500_15000NLU/g之间的任何值,且典型地是1000NLU/g、2000NLU/g或5000NLU/g。中性乳糖酶优选地在pH介于6-9之间,优选地pH介于7-8之间或更优选地pH介于6.5-7.5之间时是活性的,或者具有其最佳活性。[0032]根据FCC(第六版,2008,第1124-1126页:乳糖酶(中性)β-半乳糖苷酶活性)中所述程序,使用〇-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(0NPG)作为底物,以中性乳糖酶单位(NLU)测定乳糖酶活性。[0033]本发明的制剂中的乳糖酶优选地是细胞内产生的中性乳糖酶,在这种情况下,通过本领域技术人员已知的方法从其宿主细胞中提取中性乳糖酶。[0034]中性乳糖酶已经被描述并且从多种生物体(包括微生物)中分离。乳糖酶常常是微生物(如Kluyveromyces和Baci1lus)的细胞内组分。Kluyveromyces以及特别地Κ·fragi1is和K.lacti,和其他酵母,例如Candida、Torula和Torulopsis属的那些,是酵母乳糖酶的常见来源,而B.coagulans、B.circulans或乳酸菌是众所周知的细菌乳糖酶来源。一些来源于这些生物体的商业乳糖酶制品是可得的,例如Maxiiact?(来自K.lactis,由DSM,Delft,荷兰生产)。优选地,本发明的乳糖酶制剂包含中性Kluyveromyceslactis乳糖酶,更优选地中性K.lactis乳糖酶。[0035]本发明的制剂中的乳糖酶可作为任选浓缩的例如来自K.lactis的提取物。优选地,这样的提取物已经通过例如离心或过滤经受了固液分离步骤以除去固体。这样的提取物可包含来自酵母的天然组分以及发酵培养基的剩余物。所述组分的实例有核酸、蛋白质、残留糖、寡糖、固有酶、盐、矿物质、细胞内组分、离子和核苷酸或其他组分。在某种程度上,这些组分可在本发明的制剂中出现(endup)。例如,在5000NLU/g的乳糖酶制剂中,基于组合物的总重量,不同于乳糖酶的蛋白质的量通常介于0.1-10重量%之间,更可能介于1-5重量%或者1-4重量%之间,介于2-3重量%之间。所述制剂中盐、灰分、糖类、核酸等的量通常介于0.5-4重量%之间。[0036]或者,乳糖酶可以是酸性乳糖酶,即最适pH在3.5-5.0之间的乳糖酶。[0037]为了避免任何混淆,本文提到的例如L-乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或者糖或者氯化钠或氯化钾(或者任何其他添加的组分)的量指的是添加的组分的量,且不包括来自上述乳糖酶提取物中存在的组分的可能遗留物。[0038]此外,水活性Aw还考虑了乳糖酶溶液(例如,乳糖酶提取物或纯化的乳糖酶制品)的水活性,其可因所用批次而略微不同。[0039]本发明的制剂中的乳糖酶可以是浓缩的(未纯化的)乳糖酶或者可以是纯化的。可以通过下述步骤获得浓缩的(未纯化的)乳糖酶:释放来自宿主细胞的酶,例如通过过滤或离心除去固体,通过例如超滤浓缩液相(乳糖酶)。或者,乳糖酶是纯化的,例如通过使用色谱法。[0040]本发明的液体乳糖酶制剂中的糖可包括单糖,例如果糖或葡萄糖;二糖,例如乳糖或蔗糖;或寡糖。优选的糖可溶于水。[0041]本发明的乳糖酶制剂优选地实质上不含转化酶。转化酶[EC3.2.1.26]是催化蔗糖水解以形成一个葡萄糖单体和一个果糖单体的酶。产生的果糖和葡萄糖的混合物被称为经转化的糖浆。商业乳糖酶往往含有痕量的转化酶。发明人发现:关于乳糖酶的酶稳定性,蔗糖往往不能产生令人满意的结果。他们推测转化酶的存在可能与该问题有关。发明人还发现:作为稳定剂,葡萄糖不如其他糖有效,这可以是蔗糖的稳定化效果不足的可能解释。实际上,他们发现:当在本发明的制剂中使用不含转化酶的乳糖酶时,蔗糖是酶稳定性的有效稳定剂。因此,在优选的实施方式中,本发明的制剂包含蔗糖且实质上不含转化酶。[0042]如上所述,本发明提供含水的液体乳糖酶制剂,所述乳糖酶制剂包含乳糖酶且还包含至少20重量%的1^_乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或其组合。所述制剂可任选地包含[0043]-糖;或[0044]-氯化钠或氯化钾或其组合;或[0045]-氯化钠或氯化钾或其组合以及糖[0046]优选地其中每种组分的浓度使得水活性Aw为至多0.82。[0047]一种合适的乳糖酶制剂包含至少20重量%、21重量%、22重量%、23重量%、24重量%、25重量%、26重量%、27重量%、28重量%、29重量%、30重量%、31重量%、32重量%、33重量%、34重量%或35重量%的1^_乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾(优选L-乳酸钠)或其组合。优选地,所述乳糖酶制剂包含500-15000NLU/g乳糖酶。[0048]本发明的乳糖酶制剂可本质上由乳糖酶和L-乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾(优选地L-乳酸钠)或其组合组成。或者,乳糖酶制剂可包含(i)乳糖酶、(ii)至少20重量%的1^_乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或其组合和(iii)糖。优选地,所述糖是蔗糖、果糖、葡萄糖或乳糖、或其组合,更优选地所述糖是蔗糖。[0049]或者,乳糖酶制剂可包含(i)乳糖酶、(ii)至少20重量%的卜乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或其组合和(iii)氯化钠或氯化钾或其组合。[0050]或者,乳糖酶制剂可包含(i)乳糖酶、(ii)至少20重量%的卜乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或其组合、(iii)糖和(iv)氯化钠或氯化钾或其组合。[0051]在所有情况下,选择各个组分的浓度以使得最终水活性Aw为至多0.82。[0052]本发明的乳糖酶制剂的pH在pH6-9,优选地pH7-8.5,优选地pH7-8的范围内。[0053]一种合适的乳糖酶制剂包含1000NLU/g、2000NLU/g或5000NLU/g乳糖酶和25重量%、26重量%、27重量%、28重量%、29重量%、30重量%、31重量%、32重量%、33重量%、34重量%或35重量%L-乳酸钠,优选地5000NLU/g乳糖酶和30重量%L-乳酸钠。[0054]另一种优选的乳糖酶制剂包含5000NLU/g乳糖酶、30重量%L-乳酸钠和乳清蛋白(5-10g/l、优选地5g/l,以β-乳球蛋白测量)。[0055]另一种合适的乳糖酶制剂包含1000NLU/g、2000NLU/g或5000NLU/g乳糖酶和5重量%、6重量%、7重量%、8重量%、9重量%、10%重量%、11重量%、12重量%、13重量%、14重量%或15重量%NaCl以及35重量%、36重量%、37重量%、38重量%、39重量%、40重量%、41重量%、42重量%、43重量%、44重量%或45重量%蔗糖,优选地5000NLU/g乳糖酶、10重量%NaCl和40重量%蔗糖。[0056]另一种优选的乳糖酶制剂包含5000NLU/g乳糖酶、10重量%NaCl、40重量%蔗糖和乳清蛋白(5-10g/l、优选地5g/l,以β-乳球蛋白测量)。[0057]另一种合适的乳糖酶制剂包含1000NLU/g、2000NLU/g或5000NLU/g乳糖酶和5重量%、6重量%、7重量%、8重量%、9重量%、10%重量%、11重量%、12重量%、13重量%、14重量%或15重量%似(31以及13重量%、14重量%、15重量%、16重量%、17重量%、18重量%、19重量%、20重量%、21重量%、22重量%或23重量%1^-乳酸钠,优选地5000见1]/8乳糖酶、10重量%NaCl和18重量%L-乳酸钠。[0058]另一种优选的乳糖酶制剂包含5000NLU/g乳糖酶、10重量%NaCl、18重量%L-乳酸钠和乳清蛋白(5-10g/l、优选地5g/l,以β-乳球蛋白测量)。[0059]另一种合适的乳糖酶制剂包含1000NLU/g、2000NLU/g或5000NLU/g乳糖酶和15重量%、16重量%、17重量%、18重量%、19重量%、20%重量%、21重量%、22重量%、23重量%、24重量%或25重量%果糖以及17重量%、18重量%、19重量%、20重量%、21重量%、22重量%、23重量%、24重量%、25重量%、26重量%或27重量%L-乳酸钠,优选地5000NLU/g乳糖酶、20重量%果糖和22重量%L-乳酸钠。[0060]另一种优选的乳糖酶制剂包含5000NLU/g乳糖酶、20重量%果糖、22重量%L-乳酸钠和乳清蛋白(5-10g/l、优选地5g/l,以β-乳球蛋白测量)。[0061]另一种合适的乳糖酶制剂包含100NLU/g、2000NLU/g或5000NLU/g乳糖酶和20重量%、21重量%、22重量%、23重量%、24重量%、25重量%、26重量%、27重量%、28重量%、29重量%或30重量%蔗糖以及15重量%、16重量%、17重量%、18重量%、19重量%、20%重量%、21重量%、22重量%、23重量%、24重量%或25重量%1^-乳酸钠,优选地5000见1]/8乳糖酶、25重量%蔗糖和20重量%L-乳酸钠。[0062]另一种优选的乳糖酶制剂包含5000NLU/g乳糖酶、25重量%蔗糖、20重量%L-乳酸钠和乳清蛋白(5-10g/l、优选地5g/l,以β-乳球蛋白测量)。[0063]另一种合适的乳糖酶制剂包含100NLU/g、2000NLU/g或5000NLU/g乳糖酶和15重量%、16重量%、17重量%、18重量%、19重量%、20%重量%、21重量%、22重量%、23重量%、24重量%或25重量%果糖以及15重量%、16重量%、17重量%、18重量%、19重量%、20重量%、21重量%、22重量%、23重量%、24重量%或25重量%蔗糖。[0064]另一种优选的乳糖酶制剂包含5000NLU/g乳糖酶、20重量%蔗糖、20重量%果糖和乳清蛋白(5-10g/l、优选地5g/l,作为β-乳球蛋白测量)。[0065]描述了优选组合物的一些其他实施方式:[0066]一种优选的乳糖酶制剂包含500-8000NLU/g乳糖酶和至少28重量%、29重量%或30重量%L-乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或其组合,优选地至少31重量%或32重量%或32.5重量%L-乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或其组合。[0067]另一种优选的乳糖酶制剂包含500-8000NLU/g乳糖酶和至少28重量%、29重量%或30重量%L-乳酸钠,优选地至少31重量%或32重量%或32.5重量%L-乳酸钠。[0068]另一种优选的乳糖酶制剂包含500-8000NLU/g乳糖酶和至少25重量%L-乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或其组合,以及0.01-5重量%、优选地0.01-3重量%、更优选地0.01-3重量%、最优选地〇.〇1-2重量%范围内的氯化钠或氯化钾。[0069]另一种优选的乳糖酶制剂包含500-8000NLU/g乳糖酶和至少25重量%L-乳酸钠,以及0.01-5重量%、优选地0.01-3重量%、更优选地0.01-3重量%、最优选地0.01-2重量%范围内的氯化钾。[0070]另一种优选的乳糖酶制剂包含500-8000NLU/g乳糖酶和至少25重量%L-乳酸钠,以及0.01-3重量%、优选地0.01-2重量%范围内的氯化钾。[0071]本发明的制剂是酶稳定的,优选地微生物稳定的和酶稳定的。换言之,在2-8°C(例如,4°C)下贮存2个月后,制剂中残留的酶活性为至少80%、优选地至少90%、更优选地至少95%、甚至更优选地至少99%。同样地,微生物稳定性使得在2-8°C(例如,4°C)下贮存2个月后,总平板计数为优选地少于1000个菌落形成单位(CFU)/ml,更优选地少于500CFU/ml,更优选地少于300CFU/ml,甚至更优选地少于200CFU/ml,最优选地少于100CFU/ml。[0072]可采用定义明确的标准程序通过标准平板计数、酵母数目和霉菌数目来表示本发明的组合物的微生物性质。例如,标准平板计数可以是lml中S100CFU(菌落形成单位),酵母计数可以是lml中<10CFU且霉菌计数可以是lml中<10CFU。由于组合物在使用前往往被贮存,所以期望平板计数、酵母数目和霉菌数目保持低于确定的边界值持续至少2个月。[0073]在本文中使用时,根据NEN-IS021527-2来测定酵母计数和霉菌计数。[0074]在另一方面,本发明提供生产本发明的液体乳糖酶制剂的方法,所述方法包括:添加乳糖酶,L-乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或其组合和任选地糖,和/或任选地氯化钠或氯化钾或其组合,和/或水;以及任选地混合。所述方法中的乳糖酶可以是,或者可以获自例如来自K.lactis的任选浓缩的发酵液(裂解细胞后)。或者,乳糖酶可以是纯化的乳糖酶,例如通过色谱法纯化的乳糖酶。添加乳糖酶和其他组分的顺序并不关键。所述方法可包括混合以获得清澈溶液。[0075]在另一方面,本发明提供婴儿配方、较大婴儿配方或幼儿配方,其包含通过如上所述的本发明的方法生产的本发明的液体乳糖酶制剂或者乳糖酶组合物。所述婴儿配方、较大婴儿配方或幼儿配方优选地为干燥制剂,例如呈颗粒粉末的形式。本发明的婴儿配方、较大婴儿配方或幼儿配方中乳糖的量为优选地少于1重量%的乳糖,优选地少于〇.5重量%的乳糖,更优选地少于0.2重量%的乳糖,甚至更优选地少于0.1重量%的乳糖,所有重量%均基于婴儿配方、较大婴儿配方或幼儿配方的总重量。婴儿配方是为喂养小于12个月的婴孩和婴儿而设计和销售的制造食品。较大婴儿配方或幼儿婴配方针对6个月至2岁的年龄出售。[0076]在另一方面,本发明提供生产婴儿配方(例如,本发明的婴儿配方)的方法,所述方法包括:向浓缩乳中添加液体乳糖酶制剂和任选地其他组分,例如矿物质、维生素和脂肪;混合和/或均化;蒸发;和喷雾干燥。添加各组分的顺序并不关键。例如,可如此进行所述方法:将乳糖酶制剂添加到(液体)浓缩乳中,所述(液体)浓缩乳中已添加了例如矿物质、维生素和脂肪的组分。或者,在添加乳糖酶制剂之后添加这些其他组分。在另一种实施方式中,将乳糖酶制剂添加到其他组分中,然后将混合物添加到浓缩乳中。混合、均化、喷雾干燥和粒化均根据本领域已知的标准方法进行。[0077]在另一方面,本发明提供本发明的液体乳糖酶制剂在生产婴儿配方中的用途。[0078]现在参考下述非限制性实施例来阐释本发明。实施例[0079]实施例1包含32.5重量%乳酸钠的乳糖酶制剂[0080]可以使用现有技术中所述的方法(例如,RodriguesPinho和LopesPassos(2011)JournalofFoodBiochemistry35,323-336)或者以前描述的从Kluyveromyces中提取和浓缩乳糖酶的任何其他方法获得从Kluyveromyceslactis酵母提取的浓缩乳糖酶。向280g这样浓缩的(未纯化的)具有~14000NLU/g的活性的乳糖酶中加入520gL-乳酸钠(50重量%储液)。这产生活性为4950NLU/g、pH为7.0且水活性为0.815的32.5重量%1^-乳酸钠制剂。使用超高质(UHQ)水中的1%样品溶液进行pH测量。通过在25°C下测量样品上方的相对湿度来测量水活性直至Aw值稳定。如果没有变化>0.001,则Aw值被视为稳定。检测Aw持续4分钟。利用标准仪器测定Aw值。[0081]将约lg制剂样品贮存在5°C分别持续2周、4周和8周。将样品移出试验后,对它们进行视觉观察并测定活性。[0082]8周后,制剂的残余酶活性为94%。[0083][0084]实施例2包含20重量%乳酸钠+25重量%蔗糖的乳糖酶制剂[0085]向280g具有~14000NLU/g的活性的浓缩的乳糖酶(浓缩的(未纯化的)乳糖酶)中加入320gL-乳酸钠(50重量%溶液)和200g蔗糖。这产生活性为5040NLU/g、pH为7.0且水活性为0.815的20重量%L-乳酸钠+25重量%蔗糖制剂。使用超高质(UHQ)水中的1%样品溶液进行pH测量。通过在25°C下测量样品上方的相对湿度来测量水活性直至Aw值稳定。如果没有变化>0.001,则Aw值被视为稳定。检测Aw持续4分钟。利用标准仪器测定Aw值。[0086]将约lg制剂样品贮存在5°C分别持续2周、4周和8周。将样品移出试验后,对它们进行视觉观察并测定活性。[0087]8周后,制剂的残余酶活性为82%。「00881[0089]实施例3包含(i)32重量%L-乳酸钠制剂或(ii)20重量%L-乳酸钠+25重量%蔗糖或(iii)50重量%甘油制剂的乳糖酶制剂的微生物挑战试验[0090]向350g具有~13600NLU/g的活性的浓缩的乳糖酶(浓缩的(未纯化的)乳糖酶)中加入650gL-乳酸钠(50重量%溶液)。利用NaOH将pH调节为7.8。这产生活性为~476011]/g,以及水活性为0.80的32.5重量%L-乳酸钠制剂。[0091]向400g具有~13600NLU/g的活性的浓缩的乳糖酶(浓缩的(未纯化的)乳糖酶)中加入45781^-乳酸钠(50重量%溶液)和2858蔗糖。利用似0!1将?!1调节为7.8。这产生活性为~4760NLU/g、水活性为0.794的20重量%L-乳酸钠+25重量%蔗糖制剂。[0092]作为参照,向400g具有~13600NLU/g的活性的浓缩的乳糖酶中加入150g水和550g甘油。利用NaOH将pH调节为7.8。这产生活性为~4945见1^、水活性为0.769的50重量%甘油制剂。[0093]该试验的目的是比较50重量%甘油的乳糖酶组合物与本发明的乳糖酶组合物的微生物稳定性。这是通过根据NEN-IS021527-2利用酵母或霉菌的标准混合物或健壮混合物挑战不同制剂来进行的。这种标准混合物包含可能存在于(食物)产品、成分或工业过程或设施中的一般、普遍存在的微生物的选择。健壮混合物是能够在挑战条件下生长的菌株的选择。[0094]将标准霉菌、健壮霉菌、标准酵母或健壮酵母的混合物添加到制剂中,然后在8°C和25°C下孵育并在0周、1周、2周、3周、1个月、2个月后取样以测定微生物生长。[0095]2个月后,对于标准酵母、健壮酵母和健壮霉菌,包含乳酸盐的制剂的微生物稳定性比甘油制剂的微生物稳定性好。对于标准霉菌,包含乳酸盐的制剂与甘油制剂的微生物稳定性相同。【主权项】1.含水的液体乳糖酶制剂,所述乳糖酶制剂包含乳糖酶并且还包含至少20重量%的1^_乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或其组合,优选地其中每种组分的浓度使得水活性Aw为至多0.82〇2.根据权利要求1的乳糖酶制剂,其还包含糖。3.根据权利要求1或2的乳糖酶制剂,其还包含氯化钠或氯化钾或其组合。4.根据权利要求1或2或3的乳糖酶制剂,其中所述糖是蔗糖、果糖、葡萄糖、乳糖或其组合,更优选地所述糖是蔗糖。5.根据权利要求1-4中任一项的乳糖酶制剂,其中所述乳糖酶是中性乳糖酶。6.根据权利要求1-5中任一项的乳糖酶制剂,其中所述乳糖酶实质上不含转化酶。7.根据权利要求6的乳糖酶制剂,所述乳糖酶制剂包含乳糖酶、至少20重量%的1^_乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或其组合和蔗糖。8.根据权利要求1-7中任一项的乳糖酶制剂,其实质上不含多元醇或二醇,更优选地不含甘油和/或山梨醇。9.生产权利要求1-8中任一项的液体乳糖酶制剂的方法,所述方法包括:添加乳糖酶,L-乳酸钠、L-乳酸钙或L-乳酸钾或其组合和任选地糖,和/或任选地氯化钠或氯化钾或其组合,和/或水;以及任选地混合。10.婴儿配方、较大婴儿配方或幼儿配方,其包含权利要求1-8中任一项的液体乳糖酶制剂或者通过权利要求9所述的方法生产的乳糖酶组合物。11.生产婴儿配方、较大婴儿配方或幼儿配方的方法,所述方法包括:向浓缩乳中添加权利要求1-8中任一项的液体乳糖酶制剂或者通过权利要求9的方法生产的乳糖酶组合物和任选地其他组分,例如矿物质、维生素和脂肪;混合和/或均化;蒸发;和喷雾干燥。12.权利要求1-8中任一项的液体乳糖酶制剂或者通过权利要求9的方法生产的乳糖酶组合物在生产婴儿配方、较大婴儿配方或幼儿配方中的用途。【文档编号】C12N9/38GK106061293SQ201580011694【公开日】2016年10月26日【申请日】2015年3月5日公开号201580011694.1,CN106061293A,CN106061293A,CN201580011694,CN-A-106061293,CN106061293A,CN106061293A,CN201580011694,CN201580011694.1,PCT/2015/54652,PCT/EP/15/054652,PCT/EP/15/54652,PCT/EP/2015/054652,PCT/EP/2015/54652,PCT/EP15/054652,PCT/EP15/54652,PCT/EP15054652,PCT/EP1554652,PCT/EP2015/054652,PCT/EP2015/54652,PCT/EP2015054652,PCT/EP201554652【发明人】芬娜·约翰娜·凯瑟琳娜·乔林克,艾伯特·沙普【申请人】帝斯曼知识产权资产管理有限公司
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