专利名称：一株降低烟草特有亚硝胺含量的放射根瘤菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株放射根瘤菌及其在降低烟草特有亚硝胺含量上的应用，属生物技术领域。
背景技术：
烟草特有亚硝胺(Tobacco-specific nitrosamines，简称TSNA)是一组仅发现于烟草及其制品的致癌物质，主要包括N-亚硝基去甲基烟碱(NNN)，4-(N-甲基-亚硝基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)，N-亚硝基新烟草碱(NAT)和N-亚硝基假木贼碱(NAB)等4种成分，其中NNN和NNK具有显著的致癌作用，而NAB和NAT则无明显的致癌作用。TSNA在不同烟草类型中的含量以白肋烟最高，香料烟和烤烟含量都较低。研究证明，TSNA的主要前体物质是生物碱和硝酸盐、亚硝酸盐，在收获前的绿色烟叶中没有TSNA存在，它们产生于收获后的调制和发酵过程中。过去20年以来，TSNA成为烟草科学研究中最受关注的领域之一。
随着人们对吸烟与健康问题的广泛关注及全世界戒烟和控烟等反吸烟运动的兴起，烟草业如何在既能满足消费者的需求，又能减少吸烟给消费者带来危害上面临严重挑战。TSNA是烟草及其制品中的主要有害物质之一，减少或消除TSNA含量是生产低危害、安全型卷烟的有力措施。TSNA的控制途径目前主要有良种选育、降低施氮水平、改革调制工艺、硝酸盐清除剂及抗生素的使用等。由于这些方法存在一定的局限性，目前尚未得到普遍推广应用。因此，研究开发具有实际应用价值的降低TSNA含量的新技术具有重要的现实意义和广阔的应用前景。
发明内容
本发明的主要目的是克服现有技术之不足，研究开发一株具有降低烟草特有亚硝胺含量的放射根瘤菌，达到降低TSNA含量，为卷烟生产提供优质原料。
本发明采用的细菌是放射根瘤菌Rhizobium radiobacter KenLXR34，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国.北京.中关村；保藏日期2003年7月28日；保藏登记入册的编号CGMCC NO0986。
KenLXR34菌株属于烟草内生细菌，系本发明人从大量烟草内生细菌中筛选出来的，具有降低TSNA含量的功能。委托中国农业科学院土壤肥料研究所中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)进行鉴定，确定是放射根瘤菌Rhizobium radiobacterKenLXR34菌株。
本发明Rhizobium radiobacter KenLXR34菌株主要特征为杆状，无芽孢，革兰氏染色阳性，葡萄糖发酵阴性，接触酶阳性，氧化酶阳性，甲基红试验阴性，VP试验阴性，硝酸盐还原阳性，亚硝酸盐还原阳性，抗100μg/ml的利福平和链霉素。
本发明是这样实现的KenLXR34菌株的试管种培养，液体发酵培养，将菌剂应用于烟草上，测定降低TSNA的功能。
本发明KenLXR34菌株的培养方法(以下为重量百分比)1、试管种培养试管斜面培养基配方为酪蛋白1-2％，大豆蛋白胨0.5-1％，氯化钠0.3-0.8％，琼脂1.5-2％，pH7-8。
将KenLXR34菌株接种到试管斜面培养基上，28～35℃恒温培养1-2天，获得试管种。
2、液体发酵培养液体发酵培养基配方为酪蛋白1-2％，大豆蛋白胨0.3-0.8％，氯化钠0.2-0.7％，磷酸氢二钾0.2-0.4％，葡萄糖0.2-0.6％，pH7-8。
将试管种接种到500ml三角瓶液体培养基中，每瓶装200ml，于28～35℃下摇床培养，培养时间2～3天，转速为150～200rpm，培养液下摇床后用稀释平板计数法测定菌悬液浓度，菌浓度为每ml活菌数≥108个。
本发明KenLXR34菌株降低TSNA的功能试验1、制备供试菌剂按前述KenLXR34菌株的培养方法制备供试菌剂；以未接种KenLXR34菌株的液体培养基处理作为对照。
2、菌剂对烟草处理方法(1)烟叶粉碎处理采集生长成熟的白肋烟新鲜烟叶，用粉碎机粉碎，充分混匀，按1∶100比例将供试菌剂和粉碎烟叶充分混匀，置于30-35℃恒温培养7天后，于烘箱50℃烘干粉碎。
(2)叶面喷雾处理采集生长成熟的白肋烟新鲜烟叶，将供试菌剂均匀喷雾接种于烟叶表面，然后在室温下自然调制3周，于烘箱50℃烘干粉碎。
(3)叶柄浸泡处理将采集的新鲜烟叶叶柄基部浸泡于供试菌剂中48小时，然后在室温下自然调制3周，于烘箱50℃烘干粉碎。
(4)灌根接种处理将供试菌剂灌根接种于正常生长的白肋烟烟株，按常规栽培调制方法调制后于烘箱50℃烘干粉碎。
3、TSNA测定方法按国际通用的热能分析仪(TEA)和气相色谱仪(GC)联用方法测定各处理样品的TSNA含量。所用仪器为GC Autosystem XL型气相色谱仪(美国PE公司)、Tubrochrom色谱工作站(美国PE公司)和TEA 543热能检测器(美国Chelmsford公司)。降低TSNA百分率的计算方法为降低百分率％＝(对照处理TSNA含量-菌株处理TSNA含量)/对照处理TSNA含量×1004、试验结果(1)烟叶粉碎处理结果表1 KenLXR34菌株处理粉碎烟叶后TSNA含量测定结果TSNA含量(单位μg/g)处理 降低百分率NNN NAT NAB NNK TSNAKenLXR34菌株6.08 20.68 0.4654.34 81.5661.28％对照13.2760.52 1.55135.38210.62 -结果表明，本发明菌株对降低白肋烟TSNA有一定作用，处理粉碎烟叶后TSNA含量减少61.28％。
(2)叶面喷雾处理结果表2 KenLXR34菌株叶面喷雾处理后TSNA含量测定结果TSNA含量(单位μg/g)处理 降低百分率NNN NATNAB NNK TSNAKenLXR34菌株 2.52 4.49 0.06 1.21 8.28 54.46％对照 5.21 10.62 0.17 2.18 18.18 -结果表明，本发明菌株对降低白肋烟TSNA有一定作用，叶面喷雾处理烟叶后TSNA含量减少54.46％。
(3)叶柄浸泡处理结果表3 KenLXR34菌株叶柄浸泡处理后TSNA含量测定结果TSNA含量(单位μg/g)处理 降低百分率NNN NATNAB NNK TSNAKenLXR34菌株0.42 0.63 0.02 0.04 1.10 98.28％对照26.5924.65 0.44 12.1563.83 -
结果表明，本发明菌株处理烟叶叶柄后，白肋烟TSNA含量有显著下降，其下降率为98.28％，表明本菌株具有降低白肋烟TSNA含量的功能，在烟草工业上具有潜在的应用价值。
(4)灌根接种处理结果表4 KenLXR34菌株灌根接种处理后TSNA含量测定结果TSNA含量(单位μg/g)处理 降低百分率NNN NAT NAB NNK TSNAKenLXR34菌株2.72 1.28 0.03 0.47 4.50 73.23％对照7.57 6.93 0.22 2.10 16.81 -结果表明，本发明菌株灌根接种处理后，白肋烟TSNA含量减少73.23％，表明本发明菌株具有低白肋烟TSNA含量功能，但效果明显低于叶柄浸泡处理。
总体结果表明，本发明菌株通过不同方式接种处理后均可有效降低白肋烟TSNA含量，其中叶柄浸泡处理效果最好，降低TSNA含量达到98.28％，而4种处理方式降低TSNA含量的能力表现为叶柄浸泡处理＞灌根接种处理＞烟叶粉碎处理＞叶面喷雾处理。因此，KenLXR34菌株可大部分减少或基本消除TSNA在白肋烟中的含量，为生产低危害、安全型卷烟提供优质原料，具有极大的实际应用潜力。
具体实施例方式下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一将放射根瘤菌(Rhizobium radiobacter)KenLXR34菌株接种到试管斜面上，培养基配方为酪蛋白1.2％，大豆蛋白胨0.8％，氯化钠0.5％，琼脂1.7％，pH7.5。30℃恒温培养1天，获得试管种。
将试管种接种到500ml三角瓶(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为酪蛋白1.5％，大豆蛋白胨0.5％，氯化钠0.5％，磷酸氢二钾0.025％，葡萄糖0.3％，pH7.5。将接好种的三角瓶于30℃下摇床(转速为180rpm)培养，培养时间2天，待菌浓度达到每ml活菌数≥108时，即可应用于烟草上，能够降低白肋烟TSNA含量。
实施例二基本同实施例一，不同之处在于液体培养基配方，其配方为牛肉膏0.5％，蛋白胨1.2％，氯化钠0.5％，pH7.0。
实施例三基本同实施例一，不同之处在于液体培养基配方，其配方为营养琼脂粉4.5％，pH自然。
权利要求
1.一株具有降低烟草特有亚硝胺功能的放射根瘤菌，采用常规微生物液体发酵方法培养，其特征在于该放射根瘤菌为Rhizobium radiobacter KenLXR34菌株，该菌株已于2003年7月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO0986。
2.、按照权利要求1所述的一株降低烟草特有亚硝胺含量的放射根瘤菌，其特征在于能够降低烟草特有亚硝胺含量，用叶柄浸泡处理效果优于叶片处理和灌根处理，叶柄处理后，烟草特有亚硝胺含量降低率达到98.28％。
全文摘要
本发明涉及一株具有降低烟草特有亚硝胺含量的放射根瘤菌及其应用，属生物技术领域。本发明采用的放射根瘤菌Rhizobium radiobacter KenLXR34已于2003年7月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO0986。本发明的主要特征是，从大量烟草内生细菌中筛选出一株能够显著降低烟草特有亚硝胺含量的放射根瘤菌KenLXR34菌株，通过液体发酵扩大培养后，应用于烟草上，可明显降低白肋烟TSNA含量。以菌株悬液浸泡叶柄处理降低率最高，达98.28％，具有较好的潜在应用价值。
文档编号A24B15/00GK1580237SQ03135608
公开日2005年2月16日 申请日期2003年8月13日 优先权日2003年8月13日
发明者祝明亮, 李天飞, 汪安云, 王东丹 申请人:云南烟草科学研究院