本发明涉及烟用添加剂领域，具体涉及利用固定化酵母菌制备烟用苹果提取物的制备方法。
背景技术：
加香加料是卷烟工艺中的关键环节，是完善产品风格的决定因素和提高卷烟香气质量的有效手段之一。目前烟用香精香料主要还是通过对天然动植物的提取、化学合成制备。由于受到天然植物资源有限以及化学合成条件较苛刻限制。随着生物技术的发展，近年来，利用微生物发酵法制备烟用香原料，为烟用香原料的生产提供一条经济、高效的途径，开发一些传统方法无法生产的新型烟用香原料。
微生物固定化技术，是将特选的微生物固定在选证的载体上，使其高度密集并保持生物活性，在适应条件下能够快速、大量增殖的生物技术，能够弥补悬浮微生物发酵处理效率低、固液分离困难、抗毒性差等缺点。因此，近年来，微生物固定化技术的研究非常活跃，发展较快，已应用到许多工业部门如食品发酵工业，环境保护，新能源开发以及生物传感器等，并取得了深入发展，显示出了强大的优越性。主要涉及到以下几个方面：在食品发酵工业中用于生产乙醇、啤酒、酸奶等；在环境保护中用于环境监测和工业废水的处理；在新能源开发中用于生产氢气、甲烷、生化电池、微生物电池等；固定化微生物还可作为分子识别元件，用于制作各种生物传感器。而随着固定微生物技术的不断成熟、完善，逐渐向高效低能耗、低成本、简单化、安全自动化、无污染等方向发展，在能源危机、资源短缺、环境污染日趋严重的情况下，由此将推动其在废水处理方面更加深入和广泛的应用，具有更加深远的意义。尤其在废水处理方面，具有很大的应用前景。但在利用微生物固定化技术制备烟用苹果提取物却未见报道。
苹果(学名：maluspumila)是蔷薇科苹果属乔木，原产于欧洲中部、东南部，中亚西亚以及中国新疆地区。由于苹果中含有大量的香气物质，以苹果为原料的苹果浸膏和苹果提取物在卷烟中应用也较广泛，在卷烟中具有丰富烟香、增加果甜香韵，柔和细腻烟气等作用。
酵母菌是一些单细胞真菌，是子囊菌、担子菌等几科单细胞真菌的通称，一般泛指能发酵糖类的真菌，可用于酿造生产，该菌在发酵过程中能产生乙酸乙酯、苯乙醇等香气物质，这些香气物质能够赋予卷烟特征的甜香香气，是一种生产烟用香料的优质产香菌。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种固定化酵母菌制备烟用苹果提取物的方法，利用固定化微生物技术，开发了一种新型的苹果提取物。
一种固定化酵母菌制备烟用苹果提取物的方法，包括以下步骤：
(1)取新鲜苹果，榨汁，121℃下灭菌20min，冷却，过滤得到苹果汁；
(2)酵母菌菌悬液配制：将酵母菌接种到肉汤培养基中，在温度37℃、搅拌转速为50rpm的条件下培养48h，取培养液于8000rpm下离心，离心后的湿菌体备用；
(3)酵母菌的海藻酸钠-cacl2固定化：配制质量分数为3％～6％的海藻酸钠溶液，然后加入其体积的3％～5％的所述步骤(2)中制备的酵母菌湿菌体，配制成混合液，用蠕动泵经过1～5mm孔径的针头将配制好的混合液逐滴加入到质量分数为3％～6％的cacl2溶液中，成球，并将cacl2溶液和小球保存于-4℃条件下12～24h，取出小球，用无菌水冲洗，烘干备用；
(4)将苹果汁与步骤(3)中制备的固定化酵母菌小球按照质量比2:1～5:1混合，在温度为20～28℃，搅拌转速为1～5rpm的条件下发酵48～96h；然后置于10℃冷柜中保存4～7d，然后于常温下放置12～24h；
(5)将步骤(4)发酵后的发酵液经0.8微米膜过滤，得澄清发酵液，减压浓缩至相对密度为1.25～1.35，加入其质量的20％的丙二醇，得苹果提取物。
本发明中采用的酵母菌为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)hhl-1，于2009年11月17日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m209272。
进一步的，所述步骤(2)中肉汤培养基的具体配方为(每升)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，最终ph7.3±0.1。
进一步的，所述步骤(5)中减压浓缩的条件：浓缩压力0.1mpa，浓缩温度55℃。
本发明采用的微生物固定化技术具有发酵处理效率高、固液分离容易、抗毒性强等优点，能够弥补传统生物工艺的不足。
本发明以苹果为原料，利用固定化酵母菌发酵苹果提取物，获得了一种品质优良的烟用苹果提取物，该提取物在卷烟中具有丰富烟香，增加果甜香韵，透发烟香，柔和细腻烟气，降低烟气干燥感，减轻喉部刺激性等作用。与现有苹果浸膏和苹果提取物相比，该苹果提取物在卷烟中香气更加丰富，果香韵和甜香韵更加明显，透发烟香，烟气干燥感降低，减轻喉部刺激性；与悬浮酵母菌发酵相比，该方法制备的苹果提取物中酯类香气物质含量增加了10.52％～15.68％，苯乙醇含量增加了10.74％～16.91％，卷烟效果评价中，香气更加丰富，果甜香韵更加明显。该方法替代了苹果提取物传统的提取技术，更新了生物发酵制备工艺，使得其能够在卷烟中适用性增加，对烟用苹果提取物的制备提供了一条新途径。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细的描述。
实施例1
(1)取新鲜苹果，榨汁，121℃下灭菌20min，冷却，过滤得到苹果汁；
(2)酵母菌菌悬液配制：将酵母菌接种到肉汤培养基中，肉汤培养基的具体配方为(每升)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，最终ph7.3±0.1，在温度37℃、搅拌转速为50rpm的条件下培养48h，取培养液于8000rpm下离心，离心后的湿菌体备用；
(3)酵母菌的海藻酸钠-cacl2固定化：配制质量分数为4％的海藻酸钠溶液，然后加入其体积的3％的所述步骤(2)中制备的酵母菌湿菌体，配制成混合液，用蠕动泵经过1mm孔径的针头将配制好的混合液逐滴加入到质量分数为3％的cacl2溶液中，成球，并将cacl2溶液和小球保存于-4℃条件下16h，取出小球，用无菌水冲洗，烘干备用；
(4)将苹果汁与步骤(3)中制备的固定化酵母菌小球按照质量比2:1混合，在温度为20℃，搅拌转速为5rpm的条件下发酵50h；然后置于10℃冷柜中保存4d，然后于常温下放置12h；
(5)将步骤(4)发酵后发酵液经0.8微米膜过滤，得澄清发酵液，在压力0.1mpa，温度55℃下将其减压浓缩至相对密度为1.28，加入其质量的20％的丙二醇，得苹果提取物。
实施例2
(1)取新鲜苹果，榨汁，121℃下灭菌20min，冷却，过滤得到苹果汁；
(2)酵母菌菌悬液配制：将酵母菌接种到肉汤培养基中，肉汤培养基的具体配方为(每升)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，最终ph7.3±0.1，在温度37℃、搅拌转速为50rpm的条件下培养48h，取培养液于8000rpm下离心，离心后的湿菌体备用；
(3)酵母菌的海藻酸钠-cacl2固定化：配制质量分数为5％的海藻酸钠溶液，然后加入其体积的4％的所述步骤(2)中制备的酵母菌湿菌体，配制成混合液，用蠕动泵经过3mm孔径的针头将配制好的混合液逐滴加入到质量分数为4％的cacl2溶液中，成球，并将cacl2溶液和小球保存于-4℃条件下20h，取出小球，用无菌水冲洗，烘干备用；
(4)将苹果汁与步骤(3)中制备的固定化酵母菌小球按照质量比3:1混合，在温度为24℃，搅拌转速为4rpm的条件下发酵60h；然后置于10℃冷柜中保存5d，然后于常温下放置18h；
(5)将步骤(4)发酵后发酵液经0.8微米膜过滤，得澄清发酵液，在压力0.1mpa，温度55℃下将其减压浓缩至相对密度为1.30，加入其质量的20％的丙二醇，得苹果提取物。
实施例3
(1)取新鲜苹果，榨汁，121℃下灭菌20min，冷却，过滤得到苹果汁；
(2)酵母菌菌悬液配制：将酵母菌接种到肉汤培养基中，肉汤培养基的具体配方为(每升)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，最终ph7.3±0.1，在温度37℃、搅拌转速为50rpm的条件下培养48h，取培养液于8000rpm下离心，离心后的湿菌体备用；
(3)酵母菌的海藻酸钠-cacl2固定化：配制质量分数为5％的海藻酸钠溶液，然后加入其体积的5％的所述步骤(2)中制备的酵母菌湿菌体，配制成混合液，用蠕动泵经过4mm孔径的针头将配制好的混合液逐滴加入到质量分数为6％的cacl2溶液中，成球，并将cacl2溶液和小球保存于-4℃条件下24h，取出小球，用无菌水冲洗，烘干备用；
(4)将苹果汁与步骤(3)中制备的固定化酵母菌小球按照质量比5:1混合，在温度为28℃，搅拌转速为1rpm的条件下发酵96h；然后置于10℃冷柜中保存6d，然后于常温下放置24h；
(5)将步骤(4)发酵后发酵液经0.8微米膜过滤，得澄清发酵液，在压力0.1mpa，温度55℃下将其减压浓缩至相对密度为1.32，加入其质量的20％的丙二醇，得苹果提取物。
上述实施例中制备的苹果提取物具有丰富烟香，提升卷烟香气质量，增加卷烟香气透发性，增加烟气生津感，增加烟气甜润感，柔和细腻烟气，降低刺激性，改善喉部舒适性，掩盖杂气，改善余味等作用。
对比实验，申请人将本发明制备的苹果提取物与现有传统提取方法制备的苹果提取物、采用悬浮酵母菌发酵制备的苹果提取物按照正常加香方式添加到烟丝中，制成卷烟，并进行评吸，其评吸效果如表1所示：
表1不同工艺制备的苹果提取物在卷烟中的感官评价效果比较
从上述对比实验可以看出来，本发明中制备的苹果提取物添加到卷烟中效果更好，而且根据具体实验分析发现，与悬浮酵母菌发酵相比，该方法制备的苹果提取物中酯类香气物质含量增加了10.52％～15.68％，苯乙醇含量增加了10.74％～16.91％，卷烟效果评价中，香气更加丰富、透发，果甜香韵更加明显。
以上所述仅为本发明的具体实施方案的详细描述，并不以此限制本发明，凡在本发明的设计思路上所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。