一种抗血栓的重组巴曲酶冻干制剂的制作方法

文档序号:628934
专利名称:一种抗血栓的重组巴曲酶冻干制剂的制作方法
技术领域
本发明涉及抗血栓药物,特别提供一种抗血栓的重组巴曲酶冻干制剂。
背景技术
随着血栓栓塞性疾病患者的增加,抗血栓药物的研制已成为热点之一,人们一方面采用分子生物学技术对现有药物进行分子结构改造,以期获得更为优良的溶栓药物。另一方面,积极的寻找一些安全性好、疗效好、副作用小的天然来源的溶栓药物。蛇毒是含有多种生物活性蛋白和多肽的混合物,含有多种抗栓成分。自20世纪60 年代,人们陆续开发了一些具有抗栓作用的蛇毒制剂1976年hnouf从马来西亚红口蝮蛇毒中纯化出凝血酶样酶或称类凝血酶(Thrombin-likeEnzymes TLEs),制成了第一个治疗血栓病的蛇毒制剂Ancord。迄今为止,已从蛇毒中分离出多种溶栓物质,部分已用于临床。 如东菱克栓酶、降纤酶及蕲蛇酶等,获得了较好的临床疗效。目前从蛇毒中分离的抗栓物质根据其作用机制、分子结构等的不同,分为类凝血酶、纤溶酶及纤溶酶原激活剂等几大类。自1936年奥地利学者Von Klobusitzky首次从巴西矛头蝮蛇(Bothropsatrox)毒液中分离得到一种丝氨酸蛋白水解酶(类凝血酶),也就是所说的巴曲酶。至今已发现30 多种蛇毒中含有类凝血酶组份,并有20多种先后得到分离和纯化。我国目前临床上应用的蛇毒制剂大部分为类凝血酶,如东菱克栓酶、蕲蛇酶及降纤酶等。在临床上有两方面的用途。一为降纤作用,即巴曲克栓酶,如东菱迪芙(来自于Bothrops moojeni),其作用是分解纤维蛋白原,抑制血栓形成;诱发组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂(t-pa)的释放, 减弱纤维蛋白溶解酶原激活剂的抑制因子的活性,促使纤维蛋白溶解;增加血液流动性,防止血栓形成;降低血管阻力,加快血液流速,改善微循环。主要用于脑梗塞、血栓闭塞性脉管炎、股动脉栓塞、肺栓塞等血管栓塞性疾病。目前,巴曲克栓酶注射液在临床上已广泛用于多种疾病的治疗,包括缺血性脑血管病、急性心肌梗塞、突发性耳聋、急性脑梗塞、难治性肾病综合症、糖尿病性周围神经病、肺源性心脏病、不稳定心绞痛、高粘血症、心源性脑栓塞, 其疗效确切,不良反应轻微。二为止血作用,即巴曲止血酶,如立止血,也称蛇毒血凝酶(来自于Bothrops atrox),可用于多种原因引起的出血,特别是应用于传统止血药无效的出血病人,疗效确切,未发现明显的不良反应。类凝血酶对纤维蛋白原的作用较凝血酶更为专一,大部分蛇毒类凝血酶仅裂解纤维蛋白肽A,部分还同时裂解B肽。类凝血酶不会激活F X III,所产生的纤维蛋白聚合物分子间只在头尾连接。因此,不能使纤维蛋白发生交联,不交联的纤维蛋白对体内的纤溶酶较敏感,易受其分解,降解为无活性的小肽,在体内可迅速的被网状内皮系统及肾脏清除, 从而使纤维蛋白原浓度下降,出现抗凝效果。在体内,类凝血酶则可以消耗纤维蛋白原,降低血液粘度,从血流变学方面改善微循环,从而起到抗栓的作用。而多数的类凝血酶不激活血小板,也不激发血小板的释放反应,亦不引起血块收缩,仅少数在高浓度下引起血小板的聚集,有的TLEs还可阻止凝血酶诱导的血小板聚集效应,同时对由ADP-Na、胶原及肾上腺素等血小板聚集诱导剂所诱导的血小板聚集有同样的抑制效应。这些可能是类凝血酶防治血栓症的另一重要药理学基础。 蛇毒类凝血酶现已广泛应用于临床,并取得明显的临床效果,但仍有很多问题未解决一是蛇毒类凝血酶制剂作为一种生物制品,存在抗原性,偶有过敏反应出现,且多次应用后易产生相应的抗体,从而降低制剂的疗效;二是蛇毒的来源有限,不利于大规模生产,同时价格较高,不利于其广泛应用;三是类凝血酶是从蛇毒中纯化得到的,纯度难以控制,从而增加了毒副作用。解决这些问题的办法是借助基因重组技术,在实验室中进行表达,但这些必须在对蛇毒类凝血酶的结构及性质作更深入的研究后方可进行。成熟的巴曲酶分子是由231个氨基酸残基组成的单链蛋白,其氨基画?序列如下1VIGGDECDINEHPFLAFMYYSPRYFCGMTLINQEffVLTAA41HCNRRFMRIHLGKHAGSVANYDEVVRYPKEKFICPNKKKN81VITDKDIMLIRLDIPVKNSEHIAPLSLPSNPPSVGSVCRI121MGffGAITTSEDTYPDVPHCANINLFNNTVCREAYNGLPAK161TLCAGVLQGGIDTCG⑶SGG PLICNGQFQGILSffGSDPCA201EPRKPAFYTKVFDYLPffIQSIIAGNKTATCP其DNA序列如下1STCATTGGAG GTGATGAATG TGACATAAAT GAACATCCTT TCCTTGCATT CATGTACTAC61rCTCCCCGGT ATTTCTGTGG TATGACTTTG ATCAACCAGG AATGGGTGCT GACCGCTGCA121CACTGTAACAGGAGATTTATGCGCATACACCTTGGTAAACATGCCGGAAGTGTAGCAAAT181TATGATGAGGTGGTAAGATACCCAAAGGAGAAGTTCATTTGTCCCAATAAGAAAAAAAAT241GTCATAACGGACAAGGACATTATGTTGATCAGGCTGGACAGACCTGTCAAAAACAGTGAA301CACATCGCGCCTCTCAGCTTGCCTTCCAACCCTCCCAGTGTGGGCTCAGTTTGCCGTATT361ATGGGATGGGGCGCAATCACAACTTCTGAAGACACTTATCCCGATGTCCCTCATTGTGCT421AACATTAACCTGTTCAATAATACGGTGTGTCGTGAAGCTTACAATGGGTTGCCGGCGAAA481ACATTGTGTGCAGGTGTCCTGCAAGGAGGCATAGATACATGTGGGGGTGACTCTGGGGGA541CCCCTCATCTGTAATGGACAATTCCAGGGCATTTTATCTTGGGGAAGTGATCCCTGTGCC601GAACCGCGTAAGCCTGCCTTCTACACCAAGGTCTTTGATTATCTTCCCTGGATCCAGAGC661ATTATTGCAGGAAATAAAACTGCGACTTGCCCG理论计算出其分子量为25. 5KD,等电点为7. 39,国夕卜从Bothrops atrox毒液中
提取的巴曲酶,其实际分子量为42KD,这种分子量的偏差是由于糖基化修饰的缘故。从巴曲酶蛋白质一级结构中可以发现,其分子内有两个N-糖基化位点=Asni46-Asn147-Thrx和 Asn225-Lys226-Thi^8。此外,Bothropsatrox的其他亚种以及其他种类毒蛇的毒液中也能提取到具有巴曲酶活性的蛋白,不过其分子量从四.IKD到42KD不等,这可能是由于不同亚种之间氨基酸组成上差别或糖基化的程度不同所引起的。巴曲酶分子中有12个半胱氨酸,根据已知的丝氨酸蛋白酶类分子的研究结果,推测这12个半胱氨酸可能有Cys7-Cys139、 cys26-cys42、cys74-cys23°、cys118-cys184、cys15°-cys163、cysm-cys199 六个分子内二硫键的形成 (Itoh n.et al· The J. of BiologicalChemistry,262,3132,1987)。
考虑到进口蛇毒原料成本较高,同时,巴西矛头蝮蛇是稀有的保护蛇种,蛇毒产量有限。因此,我们采用基因工程的方法大量生产重组巴曲酶,我们首先构建了表达天然巴曲酶的基因工程菌种,但发现在发酵表达时,目的蛋白有严重的降解现象,这就极大地影响了巴曲酶的产量。因此,我们对巴曲酶进行定点突变,将巴曲酶基因上KEX2蛋白酶的酶切位点进行突变,避免其对发酵液中所表达的巴曲酶的降解,同时还不影响巴曲酶的凝血活性, 这将极大地提高巴曲酶的产量,更好地满足研究和临床应用的需要。巴曲酶蛋白虽然只有一条肽链,但是由于分子内二硫键多,还有糖基化修饰等,所以采用基因工程手段生产这种蛋白有很大的技术难度。这也是一直没有重组产品问世的主要原因之一。虽然研究者对天然巴曲酶的性质有比较多的了解,但是,对其分子生物学方面的研究一直进展缓慢,直到1987、1988年才由日本的研究者完成对巴曲酶基因的cDNA和基因组 DNA 测序工作(Nobuyuki Itoh etalj. Biol. Chem. 262(7) :3132-3135,1987 ;J. Biol. Chem.,263 :7628-7631,1988) Maeda M等采用基因重组方法,在Ε. coli中,采用融合表达系统,以包涵体(Inclusion Body)的形式表达出该成份,据报道得到了所谓有生物学活性巴曲酶(Maeda M. etal, J Biochem(Tokyo), 109(4) :632_637,1991),而且还为此申请了专利(Pat, No. JP2124092,1990)。在E.coli中表达某些蛋白已经是较为常规的生产药用蛋白的基本手段,但是在对蛇毒类凝血酶实际研究中发现,在E. coli中表达蛇毒类凝血酶的量很少。潘华等采用 RT-PCR法扩增出蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒类凝血酶基因I^allas,以表达载体pET-24a(+)构建T-7启动子控制下的表达质粒pET-Pallas,转化E. coli BL21 (DE3), 并用0. 4mmol/L IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹分析表明有生物活性的 Pallas表达(潘华等,蝮蛇类凝血酶基因的分析及表达研究,生物化学与生物物理学报, 1999,31,79)。Fan等采用PCR法扩增出蝮蛇(Agkistrodon acutus)的蛇毒类凝血酶基因 Acutin,克隆到表达载体pET-Ma,在E. coli BL21DE(3)中表达,经SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹分析表明有生物活性的Acutin表达(Fan C. Y.等,Biochemistry and Molecular Biology International, 1999,47,217)。但它们的表达效率普遍较低,没有实际生产价值。杨青等报道了用甲醇酵母表达Gussurobin,获得每升发酵液产IOmg有活性的 Gussurobin (杨青等,Biotechnology Letters, 2002, 24,135) ;Weon-KyooYou 等报道了用甲醇酵母表达Batroxobin,获得了每升发酵液产13. 16mg有活性的Batroxobin (Weon-Kyoo You 等,FEBS Letters,2004,571,67)。上海万兴生物制药有限公司申请了基因工程表达Batroxobin的专利(公开号CN1534093A,2004),在大肠杆菌和甲醇酵母中均获得表达,但在大肠杆菌中表达的 Batroxobin均为无活性蛋白。在甲醇酵母中获得一定量Batroxobin的表达,产量达每毫升发酵液20克氏单位(20KU/ml),这一产量已初步具备生产意义。上述研究结果表明利用基因工程方法生产蛇毒类凝血酶是可行的,但要用真核表达系统。到目前为止,Batroxobin 的基因工程产品还没有上市。采用基因工程的手段生产富含多对二硫键的蛋白一直是一个技术难题,尤其是生产有六对二硫键的丝氨酸蛋白水解酶。这是因为二硫键配对错误率很高,在原核中得到的几乎全是包涵体,虽然对包涵体的变性复性能得到少量的有活性的目的蛋白,但是其成本决定了不具备实际生产意义。真核表达系统(酵母、CHO和昆虫细胞等)能保证较高的二硫键配对正确率。另外,蛇毒类凝血酶分子中有不同含量的糖基化,原核细胞不能对所表达的外原蛋白进行糖基化,而糖基对蛋白的空间结构和酶活性都起稳定作用。因此空间结构复杂、有糖链的蛋白本身就不适合用原核细胞进行表达。而真核表达系统除能保证较高的二硫键配对正确率外,还能对表达产物进行一定程度的糖基化,虽然糖基化的含量和种类与蛇毒中类凝血酶分子所含的糖基不同,但也很好地保证了表达产物的活性。

发明内容
本发明的目的在于提供一种抗血栓的重组巴曲酶冻干制剂,该冻干制剂活性稳定,安全有效,节约成本,便于运输和保存。本发明具体提供了一种抗血栓的重组巴曲酶冻干制剂,其特征在于该制剂含有重组定点突变巴曲酶、赋形剂以及冻干保护剂,其比例为,巴曲酶赋形剂保护剂 =IOBU 10 IOOmg 0. 1 5mg,优选为巴曲酶赋形剂保护剂=IOBU 30 70mg 1 4mg。其中重组定点突变巴曲酶的氨基酸序列相对于天然的巴曲酶氨基酸序列的第45 位的Arg突变为Lys,具体为1 VIGGDECDIN EHPFLAFMYY SPRYFCGMTL INQEffVLTAA41 HCNRKFMRIH LGKHAGSVAN YDEVVRYPKE KFICPNKKKN81 VITDKDIMLI RLDIPVKNSE HIAPLSLPSN PPSVGSVCRI121 MGffGAITTSE DTYPDVPHCA NINLFNNTVC REAYNGLPAK161 TLCAGVLQGG IDTCG⑶SGG PLICNGQFQG ILSffGSDPCA201 EPRKPAFYTK VFDYLPffIQS IIAGNKTATC P该重组定点突变巴曲酶能够通过以分泌表达的方式大量生产获得,同时具有较高的生物活性。它可以通过将人工合成的定点突变的巴曲酶结构基因在酵母菌细胞中,以分泌表达的方式大量产生获得,优选通过甲醇酵母菌以分泌表达的方式大量产生获得。本发明提供的重组定点突变巴曲酶,在甲醇酵母菌中实现分泌表达时,可以依据巴曲酶的天然氨基酸序列,选择甲醇酵母菌比较偏好的密码子,人工合成定点突变的巴曲酶结构基因序列,再将人工合成的定点突变的巴曲酶结构基因重组到甲醇酵母菌表达载体
pPICZa中。
本发明人工合成定点突变的巴曲酶结构基因序列最好为
1GTTATTGGTGGTGATGAATGTGATATTAACGAACATCCATTTITGGCTIT
51TATGTACTACTCTCCAAGATACTTTTGTGGTATGACTITGATTAACCAAG
101AATGGGTTTTGACTGCTGCTCATTGTAACAGAAAGTTTATGAGAATTCAT
151TTGGGTAAGCATGCTGGTTCTGTTGCTAACTACGATGAAGTTGTTAGATA
201CCCAAAGGAAAAGTTTATTTGTCCAAACAAGAAGAAGAACGTTATTACTG
251ATAAGGATATTATGTTGATTAGATTGGATAGACCAGTTAAGAACTCTGAA
301CATATTGCTCCATTGTCTITGCCATCTAACCCACCATCTGTTGGTTCTGT
351TTGTAGAATTATGGGTTGGGGTGCTATTACTACTTCTGAAGATACTTACC
401CAGATGTTCCACATTGTGCTAACATTAACTTGTTTAACAACACTGTITGT
451 AGAGAAGCTT ACAACGGTTT GCCAGCTAAG ACTTTGTGTG CTGGTGTITT501 GCAAGGTGGT ATTGATACTT GTGGTGGTGA TTCTGGTGGT CCATTGATTT551 GTAACGGTCA ATTTCAAGGT ATTTTGTCTT GGGGTTCTGA TCCATGTGCT601 GAACCAAGAA AGCCAGCTTT TTACACTAAG GTITITGATT ACTTGCCATG651 GATTCAATCT ATTATTGCTG GTAACAAGAC TGCTACTTGT CCA在甲醇酵母菌中实现分泌表达时,可以利用酵母菌的α-信号肽将巴曲酶移出细胞,其中在信号肽序列与巴曲酶蛋白序列之间插入ΚΕΧ2蛋白酶识别序列AAAAGA。本发明对巴曲酶进行定点改造。核酸序列按酵母菌喜好的遗传密码子,将编码第 45位氨基酸的AGA (精氨酸)突变为AAG (赖氨酸),人工合成定点改造的巴曲酶结构基因序列,除定点突变外均为同义突变,即并没改变氨基酸种类。本发明定点突变的意义就在于,通过定点突变,使巴曲酶分子中的ΚΕΧ2酶切位点 Arg-Arg突变为Arg-Lys,使酵母菌产生的KEX2酶不能对酵母所表达的目的产物巴曲酶进行酶解,从而大大地提高了巴曲酶的产量,并且这种突变并不影响巴曲酶的生物活性。目前,在国内外还未见对巴曲酶进行定点改造的研究报道。将人工合成定点改造的巴曲酶的结构基因重组到酵母菌表达载体pPICZ α中,在酵母菌中实现分泌表达。通过优化发酵条件,确定了酵母菌最优发酵表达条件,并对表达产物进行了分离纯化,得到了高活性的重组定点突变巴曲酶。结果表明,定点突变基因工程巴曲酶较从蛇毒中提取的天然巴曲酶的比活性提高了一倍多。产率达90KU/ml发酵液。比没有重组突变的巴曲酶的产量提高了近2. 5倍左右。通过对纯化工艺的研究,可以采用不同的纯化工艺路线,纯化得到高纯度重组定点突变巴曲酶,经HPLC、电泳检测纯度,达到98. 0%以上。本发明抗血栓的重组巴曲酶冻干制剂,通过制剂处方筛选,制成注射用冻干粉针制剂,并进行了冻干工艺的研究,得到了外观、活性、含水量等均符合质量标准的注射用粉针制剂,作为抗血栓药物,可用于治疗血管栓塞引起的多种疾病。本冻干制剂具有极好的稳定性。通过60°C高温影响因素试验,在同样温度下,注射液的酶活性已经下降到原活性的0 对%。而冻干制剂活性只下降到原活性的84 100%,通过结果对比看出,冻干产品具有极高的稳定性。并且经过18个月的长期试验,其活性基本没有改变。且该冻干制剂便于运输和保存,可大幅降低储运的成本,减少广大患者的经济负担的同时,安全性也得到加强。而目前市场上抗血栓的巴曲酶只有注射液,其储运必须在低温条件下才稳定,要求避光、5°C以下保存(但应避免冻结),其严格的温度限制,说明液体制剂对温度极不稳定,不仅极大地增加了储运成本,还需要严密监视产品的变化,目前的保存期限也只暂定18 个月。此外,在液体制剂中还含有三氯叔丁醇抑菌剂,更加增加了潜在的安全风险。因此,注射用巴曲酶冻干制剂的生产极大地改善了巴曲酶注射液储运方式,不仅降低了储运成本, 也降低了由于储运不当导致的活性损失,更保证了药品的安全性。另外,本发明冻干制剂还避免了三氯叔丁醇抑菌剂的加入,进一步降低了由此导致的安全隐患。
具体实施例方式实施例1
根据美国Genebank中公开的Bothrops atrox属,moojeni venom种的巴曲酶 (X12747)的核酸序列(Itoh N, Tanaka N,Mihashi S, Yamashina L,Molecular Cloning and Sequence Analysis of cDNA for Batroxobin, aThrombin—like Snake Venom Enzyme, J Biol Chem. 1987 Mar5 ;262 (7) :3132-5),选择酵母菌喜好的遗传密码子,人工合成巴曲酶的定点改造的结构基因序列,将编码第45位的Arg的密码AGA突变为编码Lys的AAG,将酵母菌内源KEX2蛋白酶识别序列Arg-Arg突变为Arg-Lys,因此KEX2蛋白酶就不会在此位点降解分泌到发酵液中的巴曲酶,从而使目的蛋白能够大量积累。为使合成的目的基因重组到酵母菌分泌型表达载体pPICZa中,在基因的5'端添加Bio I酶切位点、基因的3'端添加终止密码子TAATGA及hell酶切位点。另外,在Β ο I酶切位点与巴曲酶蛋白N-端第一个氨基酸Val密码子之间加入KEX2蛋白酶识别序列Lys-Arg对应的密码子AAAAGA,这就确保了目的蛋白在分泌到发酵液中时能够顺利地切除α-信号肽。将合成的目的基因及pPICZ α载体经Xho I和SacII双酶切,电泳、回收,将目的基因重组到pPICZa中,转化到大肠杆菌ToplOF’中,进行筛选。转化有pPICZ α的大肠杆菌 ToplOF’在LB+25ug/mg kocin的平板上的进行培养,挑取单菌落,在液体培养基中培养,提取质粒,Xho I和SacII双酶切检测或进行α -factor priming禾口 3,A0X1 priming PCR检测,说明pPICZa中含有目的基因,可以用来转化Pichia pastoris X-33,KM71H或GS115 宿主菌。实施例2用DNA限制性内切酶McI将pPICZ α -Bg线性化,按照hvitrogen公司 Multi-Copy Pichia Expression Kit Version B中的方法制备酵母宿主感受态并进行转化,将转化后的细胞涂在YPD+500ug/ml Zeocin培养基上生长,30°C下放置3_4天可出现单菌落。挑选菌落大而饱满的克隆进行表达筛选。实施例3用在试管中筛选出的高表达的工程菌,接种到摇瓶中增殖作为种子液,再转接至 30L发酵罐,按甲醇酵母发酵的常规方法进行中试规模的发酵。诱导200小时以上。当发酵液中蛋白活性不再增加时,将发酵液离心收集上清,蛋白活性达到84KU/ml。经微滤除菌,采用疏水柱层析、离子交换柱层析、凝胶柱层析等生化分离技术,得到纯度达97%以上的活性蛋白。采用同类产品活性的测定方法进行体外凝血试验,具体实验方法为取人-枸橼酸抗凝血浆0. anl,加入直径Icm的试管中,置37°C水浴中保温3分钟,加入37°C预热的样品溶液0. anl,立即混勻计时,于40秒开始,检查血浆凝固情况,记录初凝时间,同时测定3 管,3管初凝时间误差应小于20秒。若初凝时间小于40秒,则适当稀释供试品溶液,记录 60士20秒内凝固的供试品溶液浓度,在上述条件下,能使0. 2ml人-枸橼酸抗凝血浆在60 秒凝固的酶量,定义为一个KU。实施例4种子液在2L酵母氮源基础培养基中发酵M小时后,转到30L发酵液中进行发酵培养。培养基=H3PO4, 27ml/L ;CaSO4 · 2H20,0. 9g/L ;K2SO4 18g/L ;MgSO4 · 7H20,15g/ L ;Κ0Η,4· 13g/L ;甘油 40g/L ;4. 4ml/L 微量矿物质溶液。在发酵过程中,用NH4OH调pH值,使其维持在6. O。30°C通氧剧烈搅拌(IOOOrpm)发酵,添加消泡剂。发酵M小时后,加入含12ml/L微量矿物质的50%甘油,溶氧浓度为 30%,继续培养10小时。当碳原饥饿30分钟后,加入甲醇诱导。刚开始的5小时加入甲醇的速率低,不提供氧量,以使酵母适应甲醇,100%甲醇含12ml/L微量矿物质溶液,其溶氧量在30%以上。继续发酵活性不再增加,凝血活性达到20BU/ml发酵液。实施例5对天然重组巴曲酶进行发酵表达,两菌种除突变点外,其它遗传背景完全相同,按照实施例4的发酵条件进行发酵,凝血活性达到^KU/ml发酵液。实施例6发酵液离心,收集上清液,加入(NH4)2SO4使其浓度达至IJ 1.6mol/L,然后加到 phenyl-Sepharose层析柱上,用(NH4)2SO4从1. 6-0mol/L进行梯度洗脱,收集活性峰,然后上亲和柱benzamidine-S印haroseCL-6B,50mMTris/HCl,pH 8. 2,洗脱液含0· 5M NaCl,收集活性峰。接着上kphadexG-75,流动相50mMTris/HCl,pH8. 2,含0. 5M NaCl,收集活性峰。 最后,S印hadex G-25脱盐,收集活性峰。冻干,存于_20°C。SDS-PAGE电泳和HPLC检测纯度达98%以上。送样品测定氨基酸序列,结果同理论设计的完全一致。见定点突变后的 batroxobin氨基酸序列。实施例7发酵液离心,收集上清液,用65 %固体(NH4) 2S04使活性蛋白盐析低温过夜,离心,收集沉淀,溶于50mmol/L Tris-HCl, pH8. 2,并透析,离心,取上清上亲和柱 benzamidine-kpharoseCL-4B,用含0. 5mol/L NaCl的上述缓冲液进行洗脱,收集活性峰。 用50mmol/L iTris-HCLpHS. 2缓冲液稀释,上阴离子交换柱Mono Q,用含0. 5mol/L NaCl上述缓冲液进行洗脱,收集活性峰,最后,上用相同缓冲液平衡好的kphacryl S-200柱,收集活性峰。SDS-PAGE电泳和HPLC检测纯度达98%以上。冻干,存于_20°C。实施例8冻干制剂处方筛选。按照下述配方(如表1所示),配制5BU巴曲酶冻干制剂。在相同条件下真空冷冻干燥样品,比较冻干前后活力的变化,并进行60°C高温影响因素试验 (结果见表2~)。在60°C温度下放置10天,于第5天和第10天取样检测。BU单位定义取人-枸橼酸抗凝血浆OJml,加入直径Icm的试管中,置37°C水浴中保温3分钟,加入37°C预热的样品溶液0. 1ml,立即混勻计时,于19. 2士0. 2秒血浆凝固为 2BU。表1冻干制剂处方
权利要求
1.一种抗血栓的重组巴曲酶冻干制剂,其特征在于该制剂含有重组定点突变巴曲酶、赋形剂以及冻干保护剂,其比例为,巴曲酶赋形剂保护剂=IOBU 10 IOOmg 0. 1 5mg ;其中重组定点突变巴曲酶的氨基酸序列相对于天然的巴曲酶氨基酸序列的第45位的 Arg突变为Lys,具体为1 VIGGDECDIN EHPFLAFMYY SPRYFCGMTL INQEffVLTAA41 HCNRKFMRIH LGKHAGSVAN YDEVVRYPKE KFICPNKKKN81 VITDKDIMLI RLDIPVKNSE HIAPLSLPSN PPSVGSVCRI121 MGffGAITTSE DTYPDVPHCA NINLFNNTVC REAYNGLPAK161 TLCAGVLQGG IDTCG⑶SGG PLICNGQFQG ILSffGSDPCA201 EPRKPAFYTK VFDYLPffIQS IIAGNKTATC P
2.按照权利要求1所述抗血栓的重组巴曲酶冻干制剂,其特征在于巴曲酶赋形剂保护剂=IOBU 30 70mg 1 4mg。
3.按照权利要求1所述抗血栓的重组巴曲酶冻干制剂,其特征在于,所述重组定点突变巴曲酶,通过将人工合成的定点突变的巴曲酶结构基因在酵母菌中,以分泌表达的方式大量产生获得。
4.按照权利要求3所述重组定点突变巴曲酶,其特征在于,所述酵母菌为甲醇酵母菌。
5.按照权利要求4所述重组定点突变巴曲酶,其特征在于在甲醇酵母菌中实现分泌表达时,依据巴曲酶的天然氨基酸序列,选择甲醇酵母菌比较偏好的密码子,人工合成定点突变的巴曲酶结构基因序列。
6.按照权利要求5所述重组定点突变巴曲酶,其特征在于在甲醇酵母菌中实现分泌表达时,将人工合成的定点突变的巴曲酶结构基因插入到甲醇酵母菌表达载体PPICZ α 中。
7.按照权利要求4所述重组定点突变巴曲酶,其特征在于在甲醇酵母菌中实现分泌表达时,利用酵母菌的α-信号肽,将巴曲酶移出细胞,其中在信号肽序列与巴曲酶蛋白序列之间插入ΚΕΧ2蛋白酶识别序列。
8.按照权利要求1所述抗血栓的重组巴曲酶冻干制剂,其特征在于重组定点突变巴曲酶经高密度发酵甲醇诱导表达,亲和、离子交换、疏水、凝胶等层析纯化,制成冻干制剂。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种抗血栓的重组巴曲酶冻干制剂,其特征在于该制剂含有重组定点突变巴曲酶、赋形剂以及冻干保护剂,其比例为,巴曲酶∶赋形剂∶保护剂=10BU∶10~100mg∶0.1~5mg,优选为巴曲酶∶赋形剂∶保护剂=10BU∶30~70mg∶1~4mg。该冻干制剂活性稳定,安全有效,节约成本,便于运输和保存。
文档编号C12N15/81GK102258483SQ20101015778
公开日2011年11月30日 申请日期2010年4月28日 优先权日2010年4月28日
发明者姜大威, 孟威, 徐梅, 杨宇, 段威, 王宏英, 王建华, 薛百忠, 薛雁 申请人:沈阳守正生物技术有限公司
再多了解一些
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1