专利名称：用泥鳅制成的护肝功能食品和防治肝炎药物及其制备方法
技术领域：
本发明采用现代生化技术利用泥鳅制备护肝功能食品以及从泥鳅中分离出防治肝炎的有效天然成分，用以制备防治肝炎的药物。
泥鳅(Misgurus angillicaudatus Cantor)系鳅科动物，肉或全体入药，其主要功效为补脾益气、护肝除黄、清热解毒、消痞散结。记载于《本草纲目》和《中药大辞典》等文献中。民间验方用泥鳅治疗痈肿、痢疾、阳痿等症，也有用泥鳅散或泥鳅汤治疗传染性肝炎。据《中药大辞典》所介绍的方法是将泥鳅烘干后，研制成末，每次10克，每日三次，用以治疗传染性肝炎。该法的缺点是需要现制现食，食用不方便。至今尚未见到有关明确指出泥鳅中治疗肝炎的活性成分的报道。而且也还没有利用泥鳅为原料制成的护肝养肝功能食品或中成药的产品面市。
我国是世界上肝炎发病率最高的国家，感染各种肝炎病毒的患者数以亿计。本发明为了充分开发泥鳅资源的保健功能和药用价值，利用泥鳅制成化学组成明确、护肝作用确切、剂量和剂型稳定、防治效果显著的新的防治肝炎的天然生化药物和护肝功能食品。
本发明的方法是一、用清水喂养1～3天的鲜活泥鳅洗净，将这些泥鳅干燥后用粉碎机制成50～500目细粉，或进一步加工成纳米级的超细粉。也可以将泥鳅用绞肉机绞成肉浆，加0～10％蛋白酶(如胃蛋白酶，胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，链丝菌蛋白酶E、蛋白酶V8或蛋白酶K等)，控制PH=1～8．5，于10～50℃下温育5～48小时，分离，去残渣，干燥后用粉碎机制成50～500目细粉，或将此粉进一步加工成纳米级的超细粉。上述细粉作为护肝功能食品的主要原料。用这种含量可为1～98％具有护肝功能的泥鳅干粉(或其水解液)，混入下述配料含淀粉的辅料1～90％，如面粉、淀粉、麦片、豆粉、魔芋粉、芝麻粉、花生粉；赋形剂和增稠剂0～10％，如淀粉、糊精、羧甲基纤维素钠、琼脂、明胶、海藻胶、果胶；调味剂0～5％，如食盐、糖、蜂蜜、奶粉、巧克力、蛋白糖、甜蜜素、安赛蜜、糖精、味精、鸡精、酵母精、食醋、醋(酸)精、五香粉、胡椒粉、花椒粉、咖喱粉、辣椒粉、葱、姜粉、蒜粉、薄荷；维生素类0～2％，如维生素A、维生素B、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、维生素P；食用色素0～3％，如豆酱、酱油、胡萝卜素、焦糖色素、巧克力色素、咖啡色素、栀子黄素、橘子色素、日落黄；食用香精0～2％，如荔枝香精、苹果香精、菠萝香精、草莓香精、水蜜桃香精、椰子香精、牛奶香精、牛肉香精、鸡肉香精、咖啡香精；防腐剂0～1％，如苯甲酸盐、泥泊金酯、抗菌肽、山梨酸盐。可制成异形片、糖丸、饼干、糕点、方便面、口服液、冲剂、粥糊或供调糊用的干粉等各种形式的功能食品。
二、将鲜活泥鳅用蒸馏水浸养4～96小时，然后超声处理；也可以将泥鳅用绞肉机绞碎，加水匀浆或加0．1～10％蛋白酶(如，胃蛋白酶，胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，链丝菌蛋白酶E、蛋白酶V8或蛋白酶K等)，控制PH=1～8．5，于10～50℃下温育5～48小时，过滤。将滤液按下述步骤处理①真空浓缩至原体积的1／5～1／20后，加1～8倍体积的沉淀剂(如，无水乙醇、丙酮等)，在温度为-4～5℃，转速为4000～1000转／分钟的条件下，离心5～30分钟，倾出上清液。②将沉淀用无水乙醇(或丙酮)洗涤2～8次，每次再分出上清液。③合并①②步骤的乙醇(或丙酮)上清液备用。④沉淀用少量蒸馏水溶解，用萃取剂氯仿-正丁醇(1∶4)萃取除去游离蛋白质，将水相对流水透析1～4天。将透析后透析袋内的溶液经冷冻干燥得白色絮状粉末。用物理及化学方法分析，鉴定该物质为多糖，主要由岩藻糖和半乳糖组成，其分子量为1，000～150，000。⑤将步骤②合并的乙醇(或丙酮)上清液蒸发至干，用蒸馏水溶解后，经凝胶过滤和液相色谱分离，得到多糖、糖蛋白和多肽类物质。经动物实验证明所分离出来的天然活性物质具有护肝作用。将这些物质按0．01克～10克的每剂含量，制成各种剂型的药物，如加蒸馏水、生理盐水或葡萄糖水制成口服液或注射液，或加淀粉(赋形剂)10～50％；羧甲基纤维素钠(崩解剂)0～15％；苯甲酸钠(防腐剂)0～1％制成冲剂、片剂、膏剂、散剂、丸剂或胶囊。本发明的效果如下1 泥鳅匀浆及泥鳅黏液的护肝作用1．1 对四氯化碳(CCl4)引起小鼠肝损伤的抑制作用取雄性小鼠48只，按体重随机均分6组正常对照组、生理盐水组(NS)、泥鳅匀浆组(LS)、泥鳅黏液组(LM)、联苯双酯组(DDB)和龙胆泻肝丸组(LD)。除正常对照组外，其余6组于第6天末次给药2小时后，称体重，按10ml／kg的剂量腹腔注射0．2％四氯化碳石蜡油溶液使之中毒。净食16小时后，断头取血测定血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性，取肝脏称重，检测肝组织中脂质过氧化物(LPO)含量，计算单位体重的肝重和肝组织中丙二醛(MDA)含量。结果(表1)表明四氯化碳能使小鼠血清中的转氨酶活性和肝组织中的LPO含量显著升高，并使肝脏肿大。而泥鳅匀浆和泥鳅黏液都可明显抑制四氯化碳升高的小鼠血清中转氨酶活性、肝组织中的LPO含量和肝肿。
表1 药物对四氯化碳(CCl4)致小鼠肝损伤的抑制作用(n=8，x±SD)组 别剂 量血清ALT血清AST AST／ALT肝MDA肝重／体重／mgkg-1×d ／UL-1 ／UL-1 ／nmolg-1 ／gkg-1正常对照 - 188±47 286±38 1．5225．8±3．7 35．2±5．1NS+CCl4 150×6896±33##579±87## 0．6540．6±4．5## 47．2±1．8##LS+CCl4 150×6439±97**358±94**0．8235．2±4．1**43．2±3．3**LM+CCl4 150×6533±48*446±60*0．8436．5±5．0**45．1±3．9*DDB+CCl4 150×6276±23**288±26**1．0439．7±3．5 40．6±6．5**LD+CCl4 150×6457±79**401±67**0．8829．6±3．1**41．8±3．4**与正常组比较#P＜0．05，##P＜0．01与组比较*P＜0．05，**P＜0．011．2 对硫代乙酰胺(TAA)引起小鼠肝损伤的抑制作用小鼠分组、给药途径、给药剂量、给药次数及连续天数均与1．2相同。除正常对照组外，其余6组于第6天末次给药后2小时，先称体重，再按80ml／kg的剂量腹腔注射0．2％硫代乙酰胺溶液使之中毒。净食16小时后，断头取血测定血清ALT和AST，取肝脏称重，检测LPO含量，计算单位体重的肝重和肝组织中MDA含量。结果(表2)说明硫代乙酰胺能使小鼠血清中的转氨酶活性和肝组织中的LPO含量显著升高，并使肝脏肿大。而泥鳅匀浆和泥鳅黏液及其提取物都可明显抑制硫代乙酰胺升高的小鼠血清中转氨酶活性、肝组织中的LPO含量和肝肿。
表2 药物对硫代乙酰胺致小鼠肝损伤的抑制作用(n=8，x±SD)组 别剂 量 血清ALT 血清ASTAST／ALT 肝MDA 肝重／体重／mgkg-1×d ／UL-1 ／UL-1／nmolg-1 ／gkg-1正常对照 - 188±47 286±38 1．52 25．8±3．7 35．2±5．1NS+TAA150×6937±22## 693±78##0．74 41．6±2．8## 50．8±2．5##LS+TAA150×6541±26**436±92**0．81 32．6±4．0**45．9±4．3*LM+TAA150×6638±14*528±18*0．83 34．3±3．5**45．6±3．2*DDB+TAA 150×6306±13**297±25**0．97 40．2±3．6 45．8±2．5*LD+TAA150×6460±49**421±68**0．92 30．8±3．2**43．7±4．5**与正常组比较#P＜0．05，##P＜0．01与组比较*P＜0．05，**P＜0．01四氯化碳和硫代乙酰胺致肝损伤是目前研究保肝药物作用及作用机理常用的病理模型。大剂量攻击可引起严重的肝细胞损害，导致能量代谢障碍，使肝细胞膜通透性增加，细胞内转氨酶因巨大的浓度梯度而释放入血液中。因此，血清转氨酶活性升高是肝细胞受损的敏感指标。本工作观察到泥鳅匀浆和泥鳅黏液都能显著抑制这两种模型物所引起的小鼠血清转氨酶升高。同时还观察到两种模型物都能引起小鼠肝组织中脂质过氧化物含量增加和肝肿胀，泥鳅匀浆和泥鳅黏液能显著抑制这些指标的升高。可见，泥鳅及其黏液对实验性肝损伤有多方面的抑制作用。2 泥鳅多糖的护肝作用2．1 对四氯化碳(CCl4)引起小鼠肝损伤的抑制作用小鼠40只，雌雄各半，随机均分为5组正常对照组、生理盐水(NS)组、泥鳅多糖高剂量(HPS)组、泥鳅多糖低剂量(LPS)组和联苯双酯(DDB)组，灌胃给药剂量和连续天数按表3进行。除正常对照组外，其余6组于第6天末次给药2小时后，称体重，按10ml／kg的剂量腹腔注射0．2％四氯化碳石蜡油溶液使之中毒。净食16小时后，断头取血测定血清ALT和AST，取肝脏称重，计算单位体重的肝重。结果(表3)表明四氯化碳能使小鼠血清中的转氨酶活性显著升高，并使肝脏肿大。而泥鳅多糖可明显抑制四氯化碳升高的小鼠血清中转氨酶活性和肝肿。
表3 药物对四氯化碳(CCl4)致小鼠肝损伤的抑制作用(n=8，x±SD)组别 剂 量 血清ALT 血清AST AST／ALT肝重／体重／mgkg-1×d／UL-1 ／UL-1 ／gkg-1正常对照 -120±31 266±392．22 35．2±5．1NS+CCl4 150×6727±19##510±29## 0．70 47．2±1．8##HPS+CCl4 300×6352±38**347±75**0．99 42．7±3．8**LPS+CCl4 150×6438±21**426±74**0．97 43．2±3．3**DDB+CCl4 150×6270±23**278±16**1．03 40．6±6．5**LD+CCl4 150×6457±79**401±67**0．88 41．8±3．4**与正常组比较#P＜0．05，##P＜0．01与组比较*P＜0．05，**P＜0．012．2 对硫代乙酰胺(TAA)引起小鼠肝损伤的抑制作用小鼠分组、给药途径、给药剂量、给药次数及连续天数均与2．1相同。除正常对照组外，其余6组于第6天末次给药2小时后，称体重，按80ml／kg的剂量腹腔注射0．2％硫代乙酰胺溶液使之中毒。净食16小时后，断头取血测定血清ALT和AST，取肝脏称重，计算单位体重的肝重。结果(表4)说明硫代乙酰胺能使小鼠血清中的转氨酶活性显著升高，并使肝脏肿大。而泥鳅多糖可明显抑制硫代乙酰胺升高的小鼠血清中转氨酶活性和肝肿。
表4 药物对硫代乙酰胺致小鼠肝损伤的抑制作用(n=8，x±SD)组 别 剂 量 血清ALT血清AST AST／ALT 肝重／体重／mgkg-1×d ／UL-1 ／UL-1／gkg-1正常对照 - 120±31 266±39 2．22 35．2±5．1NS+TAA150×6 737±22## 471±29## 0．64 50．8±2．5##HPS+TAA 300×6 368±15**424±18**1．15 43．6±2．2**LPS+TAA 150×6 414±32**388±48**0．94 45．9±4．3*DDB+TAA 150×6 306±13**297±25**0．97 45．8±2．5*LD+TAA150×6 460±49**421±68**0．92 43．7±4．5**与正常组比较#P＜0．05，##P＜0．01与组比较*P＜0．05，**P＜0．012．3 对萘异硫氰酸酯(NAIT)引起小鼠肝损伤的抑制作用小鼠分组、给药途径、给药剂量、给药次数及连续天数均与2．1相同。除正常对照组外，其余6组于第6天末次给药后2小时，称体重，按80ml／kg的剂量灌胃15mg／ml萘异硫氰酸酯色拉油溶液使之中毒。净食16小时，断头取血测定血清ALT和AST，取肝胆称重，计算单位体重的肝胆重。结果(表5)说明NAIT能使小鼠血清中的转氨酶活性和黄疸指数显著升高，并使肝脏肿大。而泥鳅多糖可明显抑制NAIT引起的小鼠血清中转氨酶活性和黄疸指数升高，并能显著降低小鼠的肝肿胀度和黄疸郁积。
表5 药物对萘异硫氰酸酯(NAIT)致小鼠肝损伤的抑制作用(n=8，x±SD)组 别剂 量 血清ALT血清AST 肝重／体重胆重／体重黄疸指数／mgkg-1×d／UL-1 ／UL-1 ／gkg-1 ／gkg-1正常对照-120±31 266±39 35．2±5．1 0．41±0．129．3±1．16NS+NAIT 150×6 787±13## 529±9##49．4±4．4## 1．85±0．95## 29．5±1．60##HPS+NAIT 300×6 319±20**353±29**45．5±1．9**0．92±0．91**15．7±1．07**LPS+NAIT 150×6 350±32**377±26**45．3±2．1*1．41±0．9017．8±1．31**DDB+NAIT 150×6 243±11**286±77**49．7±6．9*0．88±0．39**18．5±1．06**LD+NAIT 150×6 460±49**421±68**43．7±4．5**1．63±0．9727．3±1．52与正常组比较#P＜0．05，##P＜0．01与组比较*P＜0．05，**P＜0．01综合上述结果用泥鳅制成保健食品或从中提取到分子量为1，000～150，000的天然多糖、糖蛋白和多肽类物质，经动物实验研究表明它具有抗炎、降转氨酶、除黄疸和保护肝脏的作用。成人服用剂量为0．1毫克～100克／日。
制备实例例1． 泥鳅护肝片取鲜活泥鳅5～6公斤，用清水喂养1天，洗净，将这些泥鳅干燥后用粉碎机制成100目细粉。按如下配方制剂泥鳅干粉880克，淀粉100克，羧甲基纤维素钠17．5克，薄荷2克，苯甲酸钠0．5克，加蒸馏水造粒后，压制成1克／粒的泥鳅护肝异形片。
例2． 泥鳅护肝胶囊取鲜活泥鳅5～6公斤，用清水喂养1天，洗净，将这些泥鳅干燥后用粉碎机制成150目细粉。按如下配方制剂泥鳅干粉900克，淀粉80克，羧甲基纤维素钠19．5克，苯甲酸钠0．5克，加蒸馏水造粒后，按0．5克／粒装入胶囊，封盖，制成泥鳅护肝胶囊。
例3． 泥鳅多糖口服液将鲜活泥鳅3公斤，用蒸馏水浸养24小时，然后超声处理，过滤。将滤液真空浓缩至1／8体积后加4倍体积的无水酒精，在温度为0℃，转速为7000转／分钟的条件下，离心10分钟，倾出上清液。沉淀用无水酒精洗涤3次，分出上清液，合并全部上清液备用。沉淀用少量蒸馏水溶解，用萃取剂氯仿-正丁醇(1∶4)萃取除去游离蛋白质，水相对水透析1～4天。将透析后透析袋内的溶液经冷冻干燥得到内含多糖、糖蛋白和多肽类的白色絮状粉末物质。按如下配方制剂泥鳅多糖10克，荔枝香精1．5克，羧甲基纤维素钠3．5克，薄荷1克，砂糖5克，醋酸2克，蒸馏水1000毫升，混匀，巴氏灭菌后，封盖，分装成10毫升／支的泥鳅多糖口服液。
权利要求
1．一种制备护肝功能食品的方法，其特征是用清水喂养1～3天的鲜活泥鳅洗净，将这些泥鳅干燥后制成50目到纳米级的细粉，用这种含量可为1～98％具有护肝功能的泥鳅细干粉，混入配料制成护肝成功能的食品。
2．一种制备护肝功能食品的方法，其特征是将泥鳅用绞肉机绞成肉浆，加0～10％蛋白酶，控制PH=1～8．5，于10～50℃下温育5～48小时，将分出的水解液干燥后制成50目到纳米级的细粉，用这种含量可为1～98％具有护肝功能的泥鳅细干粉，混入配料制成护肝成功能的食品。
3．根据权利要求2所指的一种制备护肝功能食品的方法，其特征是所述的蛋白酶可以是胃蛋白酶，胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，链丝菌蛋白酶E、蛋白酶V8或蛋白酶K。
4．采用泥鳅制备的护肝功能食品，其特征是护肝功能的食品是用含量为1～98％泥鳅细干粉作为主要原料，并混入下述配料含淀粉的辅料1～90％，赋形剂和增稠剂0～10％，调味剂0～5％，维生素类0～2％，食用色素0～3％，食用香精0～2％，防腐剂0～1％，制成护肝功能的食品。
5．根据权利要求4所指的采用泥鳅制备的护肝功能食品，其特征在于所说的护肝功能食品可以是异形片、糖丸、饼干、糕点、方便面、口服液、冲剂、粥糊或供调糊用的干粉。
6．根据权利要求4所指的泥鳅制备的护肝功能食品，其特征是所指的含淀粉的辅料是面粉、淀粉、麦片、豆粉、魔芋粉、芝麻粉、花生粉；赋形剂和增稠剂是淀粉、糊精、羧甲基纤维素钠、琼脂、明胶、海藻胶、果胶；调味剂是食盐、糖、蜂蜜、奶粉、巧克力、蛋白糖、甜蜜素、安赛蜜、糖精、味精、鸡精、酵母精、醋酸、五香粉、胡椒粉、花椒粉、咖喱粉、辣椒粉、葱、姜粉、蒜粉、薄荷；维生素类是维生素A、维生素B、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、维生素P；食用色素是豆酱、酱油、胡萝卜素、焦糖色素、巧克力色素、咖啡色素、栀子黄素、橘子色素、日落黄；食用香精是荔枝香精、苹果香精、菠萝香精、草莓香精、水蜜桃香精、椰子香精、牛奶香精、牛肉香精、鸡肉香精、咖啡香精；防腐剂是苯甲酸盐、泥泊金酯、抗菌肽、山梨酸盐。
7．一种制备防治肝炎的药物的方法，其特征在于将鲜活泥鳅用蒸馏水浸养4～96小时，然后超声处理，过滤；将滤液按下述步骤处理①真空浓缩至原体积的1／5～1／20后，加1～8倍体积的沉淀剂无水乙醇，在温度为-4～5℃，转速为4000～1000转／分钟的条件下，离心5～30分钟，倾出上清液；②将沉淀用无水乙醇洗涤2～8次，每次再分出上清液；③合并①②步骤的乙醇上清液备用；④沉淀用少量蒸馏水溶解，用萃取剂1∶4氯仿-正丁醇萃取除去游离蛋白质，将水相对流水透析1～4天；将透析后透析袋内的溶液经冷冻干燥得到白色絮状粉末；⑤将步骤②合并的乙醇上清液蒸发至干，用蒸馏水溶解后，经凝胶过滤和液相色谱分离，得到多糖、糖蛋白和多肽类物质；将这些物质按0．01克～10克的每剂含量，加以辅料制成防治肝炎防治肝炎的药物。
8．根据权利要求7所指的制备防治肝炎的药物的方法，其特征在于所指的沉淀剂还可以是丙酮。
9．一种制备防治肝炎的药物的方法，其特征在于将鲜活泥鳅用蒸馏水浸养4～96小时，将泥鳅用绞肉机绞碎，加水匀浆，过滤；将滤液按下述步骤处理①真空浓缩至原体积的1／5～1／20后，加1～8倍体积的沉淀剂无水乙醇，在温度为-4～5℃，转速为4000～1000转／分钟的条件下，离心5～30分钟，倾出上清液；②将沉淀用无水乙醇洗涤2～8次，每次再分出上清液；③合并①②步骤的乙醇上清液备用；④沉淀用少量蒸馏水溶解，用萃取剂1∶4氯仿-正丁醇萃取除去游离蛋白质，将水相对流水透析1～4天，将透析后透析袋内的溶液经冷冻干燥得白色絮状粉末；⑤将步骤②合并的乙醇上清液蒸发至干，用蒸馏水溶解后，经凝胶过滤和液相色谱分离，得到多糖、糖蛋白和多肽类物质，加以辅料制成防治肝炎防治肝炎的药物。
10．根据权利要求9所指的制备防治肝炎的药物的方法，其特征在于所指的沉淀剂还可以是丙酮。
11．一种制备防治肝炎的药物的方法，其特征在于将鲜活泥鳅用蒸馏水浸养4～96小时，将泥鳅用绞肉机绞碎，加0．1～10％蛋白酶，控制PH=1～8．5，于10～50℃下温育5～48小时，过滤，将滤液按下述步骤处理①真空浓缩至原体积的1／5～1／20后，加1～8倍体积的沉淀剂无水乙醇，在温度为-4～5℃，转速为4000～1000转／分钟的条件下，离心5～30分钟，倾出上清液；②将沉淀用无水乙醇洗涤2～8次，每次再分出上清液；③合并①②步骤的乙醇上清液备用。④沉淀用少量蒸馏水溶解，用萃取剂1∶4氯仿-正丁醇萃取除去游离蛋白质，将水相对流水透析1～4天，将透析后透析袋内的溶液经冷冻干燥得白色絮状粉末；⑤将步骤②合并的乙醇上清液蒸发至干，用蒸馏水溶解后，经凝胶过滤和液相色谱分离，得到多糖、糖蛋白和多肽类物质，加以辅料制成防治肝炎防治肝炎的药物。
12．根据权利要求11所指的制备防治肝炎的药物的方法，其特征在于所指的沉淀剂还可以是丙酮。
13．根据权利要求11所指的一种制备防治肝炎的药物的方法，其特征是所述的蛋白酶是胃蛋白酶，胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，链丝菌蛋白酶E、蛋白酶V8或蛋白酶K。
14．一种防治肝炎的药物，其特征在于将从泥鳅滤液处理分离得到的内含多糖、糖蛋白和多肽类的白色絮状粉末物质按0．01克～10克的每剂含量，加蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水制成口服液、注射液。
15．一种防治肝炎的药物，其特征在于将从泥鳅滤液处理分离得到的多糖、糖蛋白和多肽类物质按0．01克～10克的每剂含量，加赋形剂淀粉10～50％；崩解剂羧甲基纤维素钠0～15％；防腐剂苯甲酸钠0～1％制成冲剂、片剂、膏剂、散剂、丸剂或胶囊。
全文摘要
本发明利用泥鳅制备多种形式的护肝功能食品及利用泥鳅分离出防治肝炎的有效天然成分多糖、糖蛋白和多肽类物质,用以制备防治肝炎的新药物。泥鳅具有补脾益气、护肝除黄、清热解毒、消痞散结的药用功效。本发明为了充分开发泥鳅资源的保健功能和药用价值,利用泥鳅制成化学组成明确、护肝作用确切、剂量和剂型稳定、防治效果显著的新的防治肝炎的天然生化药物和护肝功能食品。
文档编号A61P1/16GK1293041SQ0011461
公开日2001年5月2日 申请日期2000年6月5日 优先权日2000年6月5日
发明者钦传光, 黄开勋, 徐辉碧, 陈泽宪, 董先智, 韩定宪, 赵文, 周军 申请人:华中科技大学