新的抗肿瘤药物,其筛选方法及其应用的制作方法

文档序号:1170719阅读:530来源:国知局
专利名称:新的抗肿瘤药物,其筛选方法及其应用的制作方法
技术领域
本发明涉及免疫学。更具体地说,涉及以ErbB酶,尤其是ErbB2/ErbB3异源二聚体作为作用靶抑制肿瘤细胞生长的方法,筛选抗肿瘤药物的方法,以及由此得到的抗肿瘤药物。
肿瘤症是一种致人类死亡的主要疾病。它起因于生理失控的细胞增殖影响了人体的正常生理条件,从而产生严重的病理反应,经常导致死亡。虽然在肿瘤症研究与处理方面花费了极大的努力,目前肿瘤症仍然是人类死亡的主要原因。有多种处理肿瘤症的方法,包括手术、放疗、与化疗。手术与放疗不能完全地驱除病人体中的肿瘤细胞,化疗单独或与其他方法结合被普遍用于控制肿瘤细胞的生长。病人体中的抗肿瘤化合物通常的目标是防止肿瘤细胞增殖或杀死分裂细胞。当化合物对肿瘤细胞产生毒性时,它们通常也严重地影响那些对人生命必需的正常分裂细胞。因此,在对肿瘤症研究中的一个主要方向就是寻找一个能专一阻断或杀死肿瘤细胞而不影响正常细胞增殖的方法。当前非常需要这样一种处理肿瘤症病人的方法。
ErbBS是一类受体蛋白酪氨酸激酶,ErbB介导的细胞信号在胚胎发育或成体的心脏功能中起着重要作用。在细胞水平上,ErbB受体介导细胞的增殖、分化、迁移及细胞结构重排的信号(Gassmann和Lemke,1997;Tzahar和Yarden,1988),有四种结构类似的ErbB成员ErbB-1、ErbB2、ErbB3和ErbB-4。EGF是能识别并结合ErbB1的配体之一。ErbB3和ErbB4也能被几个陪体识别,其中包括Neuregulin-1(NRG-1)。至今,还没有发现ErbB2的配体。然而,ErbB2能与ErbB3或ErbB-4形成异源二聚体,这种异源二聚体的形成对NRG-1的细胞信号作用是决定性的。
用基因定位实验作的体内研究等的发现证明,ErbB2、ErbB3和ErbB-4都在NRG-1激活的信号链中(Meyer和Birchmeier,1996;Gassmann等,1996;Lee等,1996;Erickson等,1997)。
除了在发育中的角色外,人的ErbB2经常在不同类型的人腺瘤中被扩增并超表达。ErbB2一直被认为作为异源二聚体的一部分起作用。并且这个过程起始于NRG-1与ErbB3或ErbB4的结合。这个配体被认为有两个完全独立的受体结合点一个对ErbB3或ErbB-4有高亲和力,另一个对所有ErbB成员都有较小但非选择性的亲和力。这样,当NRG-1存在时,细胞表面的ErbB3或ErbB4就与ErbB2形成异源二聚体。ErbB3比较特殊因为1)ErbB3较易与ErbB2形成异源二聚体;2)当ErbB2和ErbB3同时转化细胞时,能获得较高的转化率;3)ErbB3在肿瘤细胞中,常伴随着ErbB2的表达而表达;4)在ErbB2转基因鼠中,ErbB3也超表达。
本发明的发明人系统研究了ErbB成员及它们之间的作用,揭示了异源二聚体的形成机制,以及它们在肿瘤细胞繁殖中的作用,及其潜在的用途。
本发明的目的在于提供一种更强、更专一地抑制肿瘤细胞的生长的方法。
本发明的目的还在于提供一种筛选抗肿瘤药物的方法。
本发明的目的还在于提供一种抗肿瘤药物,它能够更强、更专一地抑制肿瘤细胞的生长。
本申请发明人发现ErbB2在细胞中的表达不能促进细胞的繁殖,反而会抑制肿瘤基因ras介导的细胞向癌细胞转化。发明人还发现,ErbB2/ErbB3能形成不依赖于配体NRG-1的异源二聚体,这种二聚体能刺激肿瘤细胞的生长。特别是,发明人首次发现了ErbB3在肿瘤形成中的作用。基于以上发现,发明人设想了以下技术方案以实现本发明的目的。
本发明提供一种筛选抗肿瘤药物的方法。即用共表达ErbB2和ErbB3的细胞与候选化合物相互作用。所述的细胞可以是,例如用ErbB2和ErbB3表达载体永久性共转染的并已向癌细胞转化的NIH3T3细胞,人肿瘤细胞是BT-474或SK-BR-3人乳腺癌细胞。而未被转染的和ErbB2单独转染的NIH3T3细胞,或MCF-7细胞则被用来做阴性对照。筛选对象为各种可能的有机或无机分子。通常应为水溶或脂溶性分子。溶剂可为生理盐水、PBS、水等。脂溶性分子可先溶于100%酒精或DMSO,而后再溶于细胞培养液中。通常当酒精或DMSO加到细胞培养液中处理细胞时,其稀释度为1∶1000以上。并以ErbB2/3异源二聚体的存在情况和/或细胞生长和分化情况作为筛选抗癌药物的指标。当发现任何药物能抑制ErbB2、ErbB3共转染的细胞生长,而不能抑制非转染的或ErbB2单转染的NIH3T3细胞,这些药物将会被当作和ErbB2/3异源二聚体相互作用的侯选者。还可以进一步将这些药物与ErbB2/3异源二聚体的直接作用,并用本申请前述的免疫共沉淀或共价偶联的方法进行检测,从而加以验证。在一个典型的例子中,所筛选的对象为抗ErbB3的抗体。在另一种例子中,所筛选对象为各种可能的对ErbB3有亲和力的分子。
本发明还提供用本发明筛选方法得到的抗肿瘤药物。在一典型例中,所述的抗肿瘤药物是ErbB3拮抗剂,尤其是ErbB3抗体。另一典型例中,所述抗肿瘤药物还包含ErbB2抗体。出人意料的是,当两种抗体联用时,不仅没有发生拮抗效应,反而获得了理想的叠加或协同效应。较典型例的是,所述ErbB3抗体是市售的H3.105.5,所述ErbB2抗体是市售N12(购自NEO MARKER公司)。
本发明提供一种抑制肿瘤细胞生长的方法,它包括抑制ErbB2/ErbB3异源二聚体的形成。实现所述抑制的方式之一是用有效量的ErbB2/ErbB3异源二聚体拮抗剂处理细胞。所述拮抗剂选自与ErbB2或ErbB3有亲和力的分子,它们能够阻断、干扰或改变ErbB2/ErbB3异源二聚体的形成或结构,从而抑制细胞的生长。所述拮抗剂例如抗体,抗体片段。其中较典型的是,所述拮抗剂是抗ErbB3胞外蛋白区域的抗体或抗ErbB2胞外蛋白区域的抗体。本发明的特殊之处在于,本发明首次发现ErbB3抗体通过抑制ErbB2/ErbB3异源二聚体的形成而具有抑制肿瘤细胞生长的作用。所述有效量取决于靶细胞,所用拮抗剂等多种因素,本领域熟练技术人员通过常规试验即可确定该量。
本发明所述的肿瘤细胞可以是人的乳腺癌细胞。
过去一直认为ErbB2单独高表达就能致癌。但本发明证实,ErbB2单独没有刺激细胞生长的功能,而ErbB2与ErbB3以非配体依赖方式形成异源二聚体,这种异源二聚体与肿瘤细胞生长相关。由此,发明人得出一种新的抗肿瘤细胞生长的机制。特别是,本发明首次ErbB3是除ErbB2之外新的肿瘤抑制靶分子。由此,得出了一系列新的抑制肿瘤细胞生长的方法,和新的抗癌药物筛选方法。
用于研究的抗ErbB3抗体(H3.105.5)过去已查出对表达ErbB3的肿瘤细胞生长没有影响(NeoMarks Catalogue,1999)。不同于过去的研究,我们测试了5个人乳腺肿瘤细胞株MCF-7、T47D、SK-BR-3、MDA-MB-453和BT474。后两个细胞株的细胞与ErbB3抗体单独作用时,生长速度被抑制。有趣的是,SK-BR-3细胞与ErbB3抗体单独作用并不显著,而显示出对ErbB2和ErbB3抗体结合物比对ErbB2抗体大2.5倍的反应性。当二种抗体同时使用时,抗ErbB2抗体能够减少至少五倍,但仍能获得抗肿瘤细胞生长的作用,其作用值和单独使用抗ErbB2抗体的最大作用值相当,并且因ErbB2表达在心肌细胞中,抗ErbB2抗体应用在病人中造成28%病人发生心衰。而ErbB3在心肌中并无表达,因此抗ErbB3抗体的使用或和抗ErbB2抗体的结合使用,使得抗ErbB2抗体的使用量减少,都能减少肿瘤病人中产生心衰的副作用。


图1无配体NRG-1时,ErbB2、ERB3单独或共转染NIH 3T3后免疫沉淀的Western印迹。图中,转染2表示ErbB2表达质粒pRC/CMV-ErbB2编码全长人ErbB2 cDNA单独转染,3表示ErbB3表达质粒pCMVneo-HER3单独转染,2/3表示pRC/CMV-ErbB2与pCMVneo-HER3共转染,2+3表示上述单独转染后细胞裂解液的混合物;NRG-1“-”表示NRG-1不存在,“+”表示存在;免疫沉淀2表示用ErbB2抗体(NCL-CB11)沉淀,3表示用ErbB3抗体(NCL-PC11)沉淀;上行是用抗磷酸酪氨酸抗体(抗PTry)(重组RC20HRPO,购自Transduction Laboratories)进行的Western印迹;中行是用ErbB2抗体(NCL-CB11)进行的Western印迹;下行是用ErbB3抗体(NCL-PC11)进行的Western印迹。
图2用共价偶联法检测同源二聚体或异源二聚体的Western印迹。图中,共价偶联“+”表示进行了共价偶联,“-”表示没有进行共价偶联。
图3检测肿瘤细胞内ErbB2与ErbB3以非配体依赖性方式形成异源二聚体的Western印迹。
图4a)检测ErbB2/ErbB3共转染NIH3T3细胞中非配体依赖性的ErbB2/ErbB3异源二聚体与信号分子Shc结合的Western印迹;b)ErbB2/ErbB3共表达的NIH3T3肿瘤细胞中非配体依赖性的ErbB2/ErbB3异源二聚体与信号分子She结合的Western印迹。抗-SHC表示用抗-Shc(C20)进行的的Western印迹。
图5a)小鼠普通多抗IgG和ErbB3抗体H3.105.5抑制非贴壁培养BT-474人乳腺癌细胞生长的显微镜检比较。b)小鼠普通多抗IgG和ErbB3抗体H3.105.5抑制贴壁培养BT-474人乳腺癌细胞生长的量效曲线比较。其中,横坐标表示抗体浓度,纵坐标为抑制百分比。
图6没有配体NRG-1条件下,抗ErbB2抗体和抗ErbB3抗体单用和联用对人乳腺癌肿瘤细胞生长的抑制。横坐标为所用的抗体IgG表示小鼠普通多抗IgG(5μg/ml),ErbB2表示抗ErbB2抗体N12单用,ErbB3表示ErbB3抗体H3.105.5单用(5μg/ml),ErbB2/3表示N12与H3.105.5联用(两种抗体的浓度都是2.5μg/ml)。纵坐标为495nm处的吸光度。直方柱上方的是相对小鼠普通多抗IgG的抑制百分比,并显示误差线。
图7抗ErbB2抗体和抗ErbB3抗体联用对人乳腺癌肿瘤细胞生长的抑制。横坐标表示所用抗体,抗ErbB2抗体是N12(50ng/ml);抗ErbB3抗体是H3.105.5(2.5μg/ml)。纵坐标为细胞生长指标(495nm处的吸光度)。
实施例材料NIH 3T3细胞及乳房肿瘤细胞株SK-BR-3,MDA-MB-453和BT-474购自AmericanType Culture Collection。LipofectAMINETM转染试剂购自Life Technologies,Inc.。ErbB2表达质粒pRC/CMV-ErbB2编码全长人ErbB2 cDNA,ErbB3表达质粒pCMVneo-HER3编码全长人ErbB3 cDNA,来自Drs Rodney Fiddes与Roger Daly(The Garvan Institute ofMedical Research,Darlinghurst,NSW 2010,Australia)。NRG1和用于抗肿瘤细胞生长的ErbB2抗体N12和ErbB3抗体H3.105.5购自NEO MARKER公司。联结试剂BS3从PIERCE Chemical Company获得。用于免疫沉淀和Western印迹试验的抗ErbB2的抗体(NCL-CB11)购自Novocastra Laboratories Ltd.。抗-ErbB3(NCL-PC11)购自Santa CruzBiotechnology。抗-Shc抗体(C-20)购自Santa Cruz Biotechnology,抗-磷酸化酪氨酸(重组RC20HRPO)购自Transduction Laboratories。用于细胞裂解和免疫沉淀的完全的蛋白酶抑制剂购自Boehringer Mannheim。辣根过氧化酶-鏊合的第二抗体与加强的化学发光剂(ECL)剂购自NEN Life Science Products。ErbB2与ErbB3以非配体依赖性方式形成异源二聚体为了研究在没有配体NRG-1的条件下,ErbB2与ErbB3的相互作用,发明人用ErbB2低表达且不表达ErbB3的NIH3细胞(购自American Type Culture Collection)进行ErbB2和/或ErbB3的短暂表达。
NIH 3T3细胞37℃,5%CO2条件下维持在Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)(添加10%小牛血清(FBS)及选择抗生素(100μg/ml青霉素和链霉素))中。参照说明用LipofectAMINETM试剂(购自Life Technologies,Inc.)将ErbB2表达质粒pRC/CMV-ErbB2与ErbB3表达质粒pCMVneo-HER3分别或共转染NIH 3T3。为了避免血清中可能存在的NRG-1活性,细胞在转染后被培养在在无血清DMEM培养基中24小时,而后取一份共转染细胞样品在添加0.1%FBS的DMEM中保持饥饿18小时,然后用10-9M NRG-1(购自NEO MARKER公司)处理10分钟。
收获全部转染的细胞(1-2×106)用冷PBS洗涤并溶解在1ml冰裂解缓冲液里(50mMTris[pH7.4],5mM EGTA,150mM NaCl,1%Triton X-100,2mM原钒酸钠,50mM氟化钠,2mM苯基甲基磺酰氟,混合蛋白酶抑制片)。细胞溶解物用抗ErbB2抗体(NCL-CB11)或ErbB3抗体(NCL-PC11)在4℃孵化60分钟。免疫复合物用蛋白A或蛋白GSepharose收集并用裂解缓冲液洗涤四次。
然后进行免疫沉淀的Western印迹试验。免疫沉淀的蛋白用煮沸的加样缓冲液溶解并做SDS-PAGE(6%)电泳。蛋白用电转移至PVDF膜。用含5%脱脂牛奶的PBS加0.02%Tween 20在4℃过夜阻断后,膜在室温下用特异性第一抗体(NCL-CB11、NCL-PC11或重组RC20HRPO)探测60分钟。蛋白通过用一种加强的化学发光试剂(NEN LifeScience Products)与辣根过氧化酶连接的第二抗体显现。
结果如图1所示。图1中行第3列,抗ErbB3抗体制备的沉淀中有ErbB2抗原活性。这并非抗体交叉反应,因为中行第5列显示抗ErbB3抗体不能沉淀ErbB2,或者,如底行列1所示,不能结合ErbB2。同理,抗ErbB2抗体也不能结合ErbB3(中行列2和列5)。
为了证明ErbB2和ErbB3的复合物是异源二聚体,对单独或共转染的细胞进行共价偶联反应。转染后的细胞在无血清DMEM培养基中培养12小时。对照细胞先用含50nMNRG-1(Neo Markers)的无血清DMEM培养基处理10分钟。用PBS洗涤细胞三次,然后在室温下用交连剂BS3在2mM/PBS,(PIERCE)中处理30分钟,然后加10mM,pH7.5的Tris,0.9%NaCl及0.1赖氨酸溶液室温下终止反应15分钟。然后如上所述进行收获、裂解、免疫沉淀。免疫沉淀经4%SDS-PAGE电泳后进行Western印迹试验。
图2上行列1显示,rbB-2超表达形成了同源二聚体。如预期,180KDa带代表单体,360KDa带代表二聚体。同源二聚体的形成并不依赖配体。图2列5显示,共转染细胞中也测到了360Kda的二聚体带。因为该蛋白是用抗ErbB3抗体沉淀得到,却在Western印迹中与ErbB2结合,所以是异源二聚体。列1和2显示,抗ErbB3抗体不能结合ErbB2同源二聚体。列3和4显示,不论有否NRG-1存在,ErbB3都仅形成有限的同源二聚体。这些也证明了不依赖于配体的ErbB2/ErbB3异源二聚体的存在。如列7和列8所示,不经过共价交连剂处理,在此试验中,因SDS的作用,异源二聚体是测不到的。在非配体依赖性的ErbB2/ErbB3异源二聚体中,ErbB3的酪氨酸残基被磷酸化图1中,比较列3与列4可见,配体NRG-1的存在增强ErbB2/ErbB3异源二聚体的形成。上行,列3和列4所示,在ErbB2/ErbB3共表达的细胞中,两种蛋白的酪氨酸的残基都已被磷酸化。由于ErbB3的酪氨酸激酶活性缺失,因此,ErbB3应该被ErbB2磷酸化。肿瘤细胞内ErbB2与ErbB3以非配体依赖性方式形成异源二聚体为了测试在ErbB2高表达的肿瘤细胞中是否也存在上述不依赖配体的二聚体形成,用人乳腺肿瘤细胞株SK-BR-3、MDA-MB-453和BT474取代NIH3T3细胞,先在无血清DMEM培养基中培养24小时,然后分别如前所述进行免疫沉淀和Western印迹试验。结果如图3所示,与图1中的列3与列4相似,肿瘤细胞中有非配体依赖的ErbB2/ErbB3异源二聚体形成,配体NRG-1的存在则显著增强异源二聚体的形成。非配体依赖性的ErbB2/ErbB3异源二聚体与信号分子Shc结合已知配体依赖性的ErbB2/ErbB3异源二聚体已知与细胞信号分子Shc结合,发明人检测了非配体依赖的ErbB2/ErbB3异源二聚体是否也与Shc结合。如前所述转染NIH3T3细胞,在无血清DMEM培养基中培养12小时后,如前所述收获、裂解和免疫沉淀,并用抗ErbB3抗体和抗Shc抗体进行Western印迹试验。
结果见图4,图4a列1下行显示,52kDa的Shc亚种不结合Erb3同源二聚体,此图中,46kDa的Shc亚种因被一种非特异蛋白遮盖而不能测得;图4a列2和列3显示,不论NRG1是否存在,Shc都与ErbB2/ErbB3异源二聚体结合。图4b显示,在ErbB2/ErbB3共表达的肿瘤细胞中,Shc也与ErbB3相互作用,而且这种作用不依赖于配体。通过抑制ErbB2/ErbB3异源二聚体来抑制肿瘤细胞的生长以ErbB3为靶分子抑制肿瘤细胞的生长用抗ErbB3抗体处理ErbB2/ErbB3高表达的BT474人乳腺癌细胞。所用抗体为H3.105.5(购自NEO MARKER公司),该抗体从未被报道有抑制肿瘤细胞生长的作用。对照使用的是小鼠普通多抗IgG)(购自Sigma)。分别在软琼脂中进行了非贴壁生长抑制试验,在96孔细胞培养板上进行贴壁生长抑制试验。
在非贴壁生长抑制试验中,具体过程按5×104/ml的密度将BT474人乳腺癌细胞接种到含4%软琼脂DMEM培养基中。37℃,5%CO2条件下培养24hr。在试验和对照样品中分别加入5μg/ml的H3.105.5和小鼠普通多抗。再培养30天。然后进行显微镜检。用细胞增殖试剂盒(Cell Titre Aqueous Promega)。结果如图5a所示抗体处理后30天,以小鼠普通多抗IgG处理的细胞已长成非常明显的细胞团;而以H3.105.5处理的细胞,其生长被显著抑制。
在贴壁生长抑制试验中,以3000-5000细胞/孔的密度将BT474人乳腺癌细胞接种到含10%PBS的DMEM培养基的96孔细胞培养板上。37℃,5%CO2条件下培养16hr,使之贴壁。在试验和对照样品中分别加入1-5μg/ml的H3.105.5和小鼠普通多抗IgG,继续培养5-14天。然后按说明书,用Promega公司的Cell Titre Aqueous计点对应各浓度的细胞数,并绘制曲线。结果如图5b所示H3.105.5对贴壁生长的BT474人乳腺癌细胞也有明显的抑制作用,而且呈现正相关的剂量依赖性。
由此可见,以ErbB 3为靶分子能够通过抑制ErbB2/ErbB3异源二聚体的形成而抑制肿瘤细胞的生长。联合使用ErbB2和ErbB3抗体对抑制肿瘤细胞生长的效果发明人还试验了联合使用ErbB2和ErbB3抗体对抑制肿瘤细胞生长的效果。所用的肿瘤细胞为BT474、SK-BR-3和MDA-MB-453。如前所述以2000细胞/孔的密度将细胞接种在含10%PBS的DMEM培养基的96孔细胞培养板上,37℃,5%CO2条件下培养约16小时至贴壁,加入抗体小鼠普通多抗IgG5μg/ml,ErbB3抗体H3.105.55μg/ml,ErbB2抗体N12(购自NEO MARKER公司)5μg/ml,两抗体各2.5μg/ml,相同条件下培养培养14天。期间,每48小时换以含抗体的新鲜培养基。用非特异性的细胞增殖试剂盒(Promega)测定细胞数量。结果如图6所示,两种抗体的联用对所试的3种细胞都有明显的抑制作用。其中,抗体联用对BT474和MDA-MB-453具有抑制生长的叠加效应;对SK-BR-3则具有抑制生长的协同作用。
基于以上结果,发明人设想如果ErbB2抗体与ErbB3抗体联用具有协同效应。则当ErbB2抗体的浓度低至细胞对次浓度不敏感时,双抗体的叠加或协同效应仍可能显现出明显的总体抑制作用。为此,发明人用SK-BR-3人肿瘤细胞进行了如前所述的贴壁培养、抗体处理和检测。所不同的是,联用的是50ng/ml ErbB2抗体(N12)与2.5μg/ml的ErbB3抗体H3.105.5。结果如图7所示细胞在单用试验浓度的两种抗体时,抑制都不明显,但在双抗体联用时则受到显著抑制。这表明,因为ErbB2/ErbB3异源二聚体的促肿瘤细胞生长作用,除了已知的ErbB2之外,ErbB3也可以用作已知肿瘤细胞生长的靶分子。在联用针对两者的抗体时可获得促肿瘤细胞生长的叠加或协同效应。基于ErbB2/ErbB3异源二聚体的抗癌药筛选方法基于以上试验结果,发明人还提供了一种筛选抗癌药物的新的方法,并确实获得了一系列新的抗癌药物。
对ErbB3抗体的筛选在此筛选系统中的所用材料为用ErbB2和ErbB3表达载体永久性共转染的并已向癌细胞转化的NIH3T3细胞。而未被转染的和ErbB2单独转染的NIH3T3细胞则被用来做阴性对照。所筛选的对象为抗ErbB3的抗体,各种不同的抗体可溶于PBS中,而后溶于培养基中用来处理培养中的细胞。细胞应培养在96孔细胞培养板中,细胞密度为每孔4000个细胞。细胞被置于96孔板中先培养24小时,使之贴壁,而后加上所受筛选的药物,或溶剂本身。如果某种ErbB3抗体能抑制ErbB2/3共转染的细胞生长而不能抑制ErbB2转染的细胞或未转染的细胞,则这种抗体就有可能成为ERBB2/3异源二聚体的拮抗剂的候选者。
还可以进一步将这些药物与ErbB2/3异源二聚体的直接作用,可用本申请前述的免疫共沉淀或共价偶联的方法来检测。自然ErbB3抗体对ErbB3的亲和性和专一性都可用常规的生化方法来鉴定。
结果发现,ErbB3抗体H3.105.5可以作为抗癌药物的活性成分。
对与ErbB3有亲和力的分子的筛选要确定这些分子对ErbB3的亲和性,我们可用生化的方法。比如用ErbB3蛋白做成的亲和柱,任何ErbB3有亲和力的分子都会结合到这种柱上而被检测到。另一种方法是如果这种分子能被同位素标记。这样就能把这种标记的分子直接和ErbB2转染或ErbB2/3共转染的细胞结合。结合的强度用单位细胞的同位素放射量来测定。如果这种分子能结合ErbB2/3共转染的细胞而不能结合ErbB2单转染的细胞就说明这种分子具对ErbB3特异性的亲和力。这些分子就能被用来做前述的抑制细胞生长试验。通常用上述系统筛选出的药物还要用来做抑制人肿瘤细胞生长。典型的和ErbB3有关的人肿瘤细胞是BT-474和SK-BR-3人乳腺癌细胞。作为阴性对照,MCF-7细胞也应用来做抑制细胞生长试验。所做试验的方法和前述NIH3T3细胞试验完全一样。
权利要求
1.一种筛选抗肿瘤药物的方法,它包括用表达ErbB2和ErbB3的细胞与候选化合物相互作用;检测细胞的生长抑制;生长抑制阳性表明候选化合物是抗肿瘤药物。
2.一种抗肿瘤药物,它是用权利要求1所述方法筛选得到的。
3.根据权利要求2所述的药物,它包含有效量的抗ErbB2抗体和/或抗ErbB3抗体。
4.根据权利要求3所述的药物,其中的抗ErbB2抗体包括N12,所述抗ErbB3抗体包括H3.105.5。
5.一种抑制细胞生长的方法,它是通过权利要求2所述药物与ErbB2和/或ErbB3反应来抑制ErbB2/ErbB3异源二聚体的形成。
6.根据权利要求1或5所述的方法,其中所述的细胞包括肿瘤细胞。
7.根据权利要求8所述的方法,其中所述的细胞包括人类乳腺肿瘤细胞。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种筛选抗肿瘤药物的方法。本发明的目的还在于提供一种抗肿瘤药物,它能够更强、更专一地抑制肿瘤细胞的生长。本发明的目的还在于提供一种更强、更专一地抑制肿瘤细胞的生长的方法。
文档编号A61P35/00GK1352391SQ0013777
公开日2002年6月5日 申请日期2000年12月27日 优先权日2000年12月27日
发明者周明东 申请人:周明东
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