专利名称：疟疾疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及针对疟疾的疫苗。本发明还涉及能够在受试者体内引发针对疟疾的免疫学和保护性应答的多肽，及其在预防中的用途。
疟疾是受感染蚊子在吸血过程中将子孢子接种到哺乳动物宿主体内从而得到传播的寄生虫病。几分钟内，子孢子就侵入肝细胞，并在细胞内通过无性裂殖发育成裂殖子。然后裂殖子侵入红细胞，产生与疾病有关的各种症状。当配子体在蚊子(传病媒介)吸血过程中被摄取时，即完成了生活周期。
通过用辐照减毒的子孢子免疫小鼠和人，可以获得针对疟疾的保护性免疫。该免疫力是中和抗体识别血流中游离子孢子及CD4+和CD8+T细胞阻止寄生虫肝形式发展的作用结果。在B细胞缺陷小鼠中进行的实验证明，尽管存在抗子孢子抗体，保护作用由经辐照的子孢子免疫诱导。这说明在肝细胞内阶段存在的蛋白质特异性T细胞在保护中发挥重要作用。因此，疟疾疫苗研究的目的之一是模拟由注射经辐照子孢子诱导的保护性免疫应答。
在得出本发明的研究中发现，使用固相肽合成法产生的、包含伯格氏鼠疟原虫(Plasmodium berghei)环子孢子蛋白C端区域69个氨基酸(PbCS 242-310)的多肽，在存在不完全弗氏佐剂(IFA)的条件下，尾基皮下注射2次后，在BALB/c小鼠(H-2d)中引发(i)高滴度的抗肽抗体，该抗体还识别天然的伯格氏鼠疟原虫CS蛋白，(ii)针对主要组织相容性复合物(MHC)抗原Kd限制性肽PbCS 245-253特异的溶细胞性T细胞，和(iii)针对子孢子诱导的疟疾的部分CD8+依赖性的保护作用。通过IFN-γ ELISPOT，在用短的最佳CTL肽245-253或多肽242-310免疫的动物的引流淋巴结中，发现了相同频率的肽PbCS 245-253特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，说明较长的多肽在MHCI型而言的体内加工及呈递正如短的CTL肽一样有效。有趣的是，当C端肽中存在的4个半胱氨酸残基被完全氧化后，观察到甚至更高水平的CTL活性和保护作用。这些发现指出了C端片段的化学本性对于激活免疫系统及伴随的保护作用的潜在重要性。更一般而言，由于免疫系统的多个方面受到长的合成多肽的刺激，这些可能为用重组蛋白质片段或短肽进行疫苗接种提供有价值的选项。
根据这个发现，本发明提供了针对疟疾的疫苗(特别是用于人类)，该疫苗包括具有疟原虫属的种环子孢子蛋白C端部分的氨基酸序列的多肽，该多肽至少包含4个末端半胱氨酸，其中至少一对被氧化，该疫苗任选的还包括合适载体和/或佐剂和/或生物可降解微囊。生物可降解微囊是大约1-10μm的球体，和用于本发明疫苗的非常合适的载体和/或佐剂。
具体而言，本发明的疫苗是基于恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)环子孢子蛋白，更具体而言，是恶性疟原虫NF54株。
优选疫苗中的多肽由衍生自环子孢子蛋白C端部分的至少42个连续氨基酸组成。更特别的，本发明所涉及疫苗中的多肽至少包含恶性疟原虫的第342-383位氨基酸，甚至更特别的，至少包含恶性疟原虫NF54株的第342-383位氨基酸。
优选由恶性疟原虫环子孢子蛋白C端部分衍生的多肽中存在的所有4个半胱氨酸都被氧化。
发现当佐剂是MontanideTM时本发明的疫苗特别有用。MontanidTMISA佐剂(Seppic，巴黎，法国；ISA＝不完全Seppic佐剂)是一组基于油/表面活性剂的佐剂，其中不同的表面活性剂与不可代谢矿物油和可代谢矿物油之一或二者混和物组合。将它们与水性抗原溶液制备成乳剂以供使用。各种Montanide ISA佐剂组以油包水乳剂、水包油乳剂、或水包油包水乳剂使用。由于表面活性剂与油组合的多样性，不同的佐剂采用不同的水相/油相比率。这些佐剂的性能据说与用于抗体生成的不完全弗氏佐剂(IFA)相似；然而炎症应答通常较小。
本发明还涉及具有疟原虫属的种环子孢子蛋白C端部分的氨基酸序列的多肽，该多肽包含至少42个连续C端氨基酸，其中一对或多对半胱氨酸被氧化。
在本发明的特定实施方案中，多肽包含恶性疟原虫NF54株的第342-383位氨基酸。
优选多肽中存在的所有半胱氨酸残基都被氧化。
此外，本发明涉及在针对疟疾的疫苗中使用的这种多肽，以及这种多肽用于制备针对疟疾的疫苗的用途。
本发明将在下文实施例中进一步阐明，这些实施例绝非意欲限制本发明。
在实施例中，参考了所示附图
图1由用50μg肽PbCS 242-310(溶于IFA)免疫2次的小鼠的脾获得的CTL大量培养物的特异性。在标准铬释放测定法中，当靶细胞单独存在(空心符号)或用相应肽脉冲(实心符号)时，用所示肽体外刺激7天后测定特异性。
图2由用肽PbCS 242-310(溶于IFA)免疫2次的小鼠分离的脾细胞的CTL大量培养物的特异性。在标准铬释放测定法中，用Kd、Dd、或Ld转染和用特异肽脉冲L细胞，用所示肽体外刺激7天后评定特异性。
图3淋巴结(LN)细胞中肽PbCS 245-253特异性T细胞的测定(通过IFN-γ ELISPOT)。在第0天和3-4周后用各种抗原制剂(溶于IFA)尾基免疫小鼠。图A显示了肽PbCS 242-310或肽P30/PbCS 245-253；图B显示了还原态或氧化态PbCS 242-310。第二次注射后10-20天摘除每组2只小鼠的腹股沟和主动脉周围引流淋巴结，合并获得的细胞。在存在用或未用肽PbCS 245-253脉冲的经照射P815细胞的条件下，通过ELISPOT直接评定特异性T细胞的存在。只用IFA免疫的小鼠作为对照。结果代表了进行的3次实验；当将细胞与或不与PbCS肽245-252一起温育时，结果表述为获得的斑点的差异。
图4第一次免疫后1个月评价的PfCS 282-383特异性抗体。如图2所示，通过ELISA评价了在存在MontanideTMISA-720(上图)或Alum(下图)的条件下、以2种肽剂量(100或300μg，分别用实心和空心符号表示)免疫的志愿者体内PfCS 282-383特异性抗体的存在。
图5在存在MontanideTMISA-720的条件下、用100μg肽免疫的志愿者体内应答PfCS 282-383的淋巴细胞增殖的发展。在含各种浓度(30-0.04μg/ml)的PfCS 282-383的6天培养物中，测试了4名志愿者(编号1、4、6、和11)免疫前(第0月)和免疫后(第1-8月)的外周血淋巴细胞(PBL)。数据显示为5个复份培养物的最高平均刺激指数(S.I.)。对照培养物(TT和PHA)给出了满意的S.I.。箭头指示注射时间。*未测试。
实施例
9-mer肽PbCS 245-253对应于经鉴定的CTL表位(Romero等人，自然(Nature)341323-326，1989)。覆盖伯格氏鼠疟原虫ANKA株(Lanar，分子和生化寄生虫学(Mol.Bioch.Paras.)39151-153，1990)环子孢子蛋白C端区域的多肽PbCS 242-310如先前关于恶性疟原虫类似物的详细描述(Roggero等人，分子免疫学(Mol.Immunol.)321301-1309，1995)获得。简而言之，在对-烷氧基苯甲醇树脂(Wang树脂)上制备多肽，取代程度为0.4mmol/g。使用10倍过量的F-moc氨基酸衍生物和30分钟的偶联时间。通过大小排阻层析(交联葡聚糖Sephadex 025，Pharmacia，瑞典)与RP-HPLC(W-Porex 5 C4，250×10mm，Phenomenex，Rancho Palos Verdes，美国；使用溶于0.1％TFA/H2O的10-50％CH3CN梯度，40min，流速3ml/min)的组合，纯化粗制多肽。
通过大小排阻层析纯化重叠10个残基且包含序列PbCS 233-312的20-mer肽B11-B17(表1)。通过RP-HPLC(C18分析柱)分析所有肽的纯度。根据Knecht和Chang(分析化学(Anal.Chem.)582375-2379，1986)的方法测定经纯化肽的氨基酸组成，通过质谱法在LDI 1700 Mass Monitor(Linear Scientific Inc.，Reno，NV，美国)或Voyager-DE(PerSeptive Byosystem，Framingham，MA，美国)上确定分子量。
2.PbCS 242-310的还原和氧化通过用100mol过量DTT于37℃温育36小时处理经HPLC纯化的多肽，获得PbCS 242-310的还原形式。通过大小排阻层析除去过量DTT后，将一部分材料溶解于0.1M CH3COONH4(pH8.0)，并置于空气中氧化10天。通过Ellman反应和通过向一份肽溶液中加入1000mol过量N-乙基马来酰亚胺(NEM)，确定肽的完全还原或氧化。在后一种情况中，于4℃温育1小时后，氧化形式的质谱没有检测到多肽MW的增加，而还原形式展示相当于加入4个NEM分子的MW增加。
3.免疫4-5周龄雌性BALB/c小鼠购自HarIan(Zeist，NL)。用50μg还原态或氧化态多肽(溶于PBS并在不完全弗氏佐剂IFA中乳化)对小鼠进行尾基皮下注射。对于短肽PbCS 245-253，与100μg通用辅助肽P30(Renggli等人，免疫学通讯(Immunol.Let.)46199-205，1995)一起注射了4μg。2-3周后，动物接受了加强免疫剂量的免疫原。肽加强免疫后7-10天，对小鼠采血，以评价特异性抗体的产生。随后，处死动物用于增殖、CTL、或ELISPOT测定，或者暴露于携带子孢子的蚊子。
4.寄生虫攻击通过循环式传播至实验室饲养的冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)或斯氏按蚊(A.stephensi)产生伯格氏鼠疟原虫(ANKA品系；克隆1，Dr.Walliker，爱丁堡，或克隆Dr.P.H.Lambert，WHO，日内瓦)子孢子。麻醉小鼠并暴露于受感染的蚊子。将小鼠单独暴露至预先确定的首次用于实验的、年龄符合的BALB/c小鼠获得完全感染所需被咬次数。寄生虫攻击后，由第5天至第14天通过吉姆萨(Giemsa)染色血涂片定期检查寄生虫血症。如果受到攻击后14天没有检测到寄生虫，则认为小鼠受到保护。
5.体内T细胞耗贫使用杂交瘤H35(CD8特异性大鼠IgG2b)(Golstein等人，免疫学综述(Immunol.Rev.)685-42，1982)和GK1.5(CD4特异性大鼠IgG2b)(Dialynae等人，免疫学杂志(J.Immunol.)1312445-2451，1983)作为抗体来源。在第0天进行攻击。第-3、-2、和-1天注射1mg CD4特异性抗体(相同方案用于对照大鼠Ig)。第-2和+2天注射0.5mg CD9特异性抗体。
在伯格氏鼠疟原虫肝阶段完全发展所需时间内，耗贫＞95％(Meis等人，美国热带医学和卫生学杂志(Am.J.Trop.Med.Hyg.)37506-510，1987)。使用CD4特异性FITC标记的(ref.1300 024，BoehingerMannheim，德国)和CD8特异性PE标记的(ref.1271 237，BoehringerMannheim，德国)外周血淋巴细胞(PBL)或脾细胞的FACS(BectonDickinson)分析来检验耗贫。
6.ELISPOT测定法将硝酸纤维素ELISPOT平板在湿润室中于4℃用含100μg/mlIFN-γ特异性抗体OIE703B2(Slade和Langhorne，免疫生物学(Immunobiology)179353，1989)的PBS溶液包被过夜。通过加入含10％FCS的DMEM于37℃温育2小时进行饱和步骤。然后将由经免疫小鼠引流淋巴结分离得到的免疫细胞在平板中与100,000个/孔进行或未进行短肽PbCS 245-253脉冲的经照射P815细胞于37℃共培养24小时。然后除去细胞，并加入以1μg/ml浓度溶于含1％BSA的PBS的生物素化IFN-γ特异性二抗(ANI)(Slade和Langhorne，免疫生物学(Immunobiology)179353，1989)，于37℃温育2小时。清洗后，加入在含5％FCS的PBS中稀释的链霉亲和素-碱性磷酸酶缀合物，于37℃温育1小时，通过加入BCIP/NBT底物揭示免疫复合物的存在。结果1.针对完全还原的PbCS 242-310 C端肽的免疫学应答用溶于IFA的肽PbCS 242-310免疫BALB/c小鼠2次。第二次注射后7-10天评价肽特异性抗体的存在。通过ELISA检测到高滴度的肽特异性抗体(1∶300,000)，并通过IFAT测定法对空气干燥的伯格氏鼠疟原虫子孢子证明了与天然CS蛋白的交叉反应性(1∶25,000)。既然识别受到加入的竞争剂PbCS 242-310肽的抑制，则其是特异性的。
为了评价CTL应答，在体外用众所周知的CTL表位PbCS 245-253、肽PbCS 242-310、和覆盖完整C端序列的重叠肽B11-B17再刺激脾和LN免疫细胞。在用肽245-253和243-262再刺激的经免疫小鼠的脾和淋巴结中检测到高水平的细胞毒性，而肽233-252和242-310诱导的水平较低(图1，表1)。表1研究中所用的肽
正如通过形成IFN-γ斑点的细胞数目测定的，细胞毒活性相当于在用最佳9肽PbCS 245-253免疫的小鼠中获得的(图1A)。使用表达Kd、Dd、或Ld MHCI型分子的经转染L细胞，确定了CTL应答的Kd限制性(图2)。
2.用PbCS 242-310肽(溶于IFA)免疫赋予暴露于携带寄生虫的蚊子的BALB/c小鼠以依赖CD8+的保护作用肽加强免疫后7-10天，将用50μgPbCS 242-310肽(溶于IFA)尾基皮下免疫2次的BALB/c小鼠进行寄生虫攻击。在PbCS 242-310肽免疫小鼠中获得特异性保护的重要水平(表2，实验A)。表2
为了表征保护作用的机制，在体内进行T细胞耗贫。显然，CD4+T细胞耗贫不显著改变观察到的保护作用。相反，通过同种型匹配的CD8特异性抗体的CD8+T细胞耗贫阻止肽诱导的体内保护作用，因为观察到保护作用的基线水平(表2，实验A)。
3.氧化的PbCS 242-310 C端肽的免疫学特性通过将水溶液(pH8.0)于室温暴露于空气10天，将完全还原的C端肽进行完全氧化。然后将该制剂的免疫学特性与完全还原的材料就CTL应答和保护能力的方面进行比较。当在抗体滴度和T细胞增殖中没有性质上的差异时，用氧化的材料在3次不同实验中获得的IFN-γELISPOT数目一致高于完全还原的肽的观察结果(图3B)。相似的，用氧化的材料获得的保护程度一致高于还原的分子的观察结果(表2，实验B、C)。
在此实施例中，注射覆盖CS蛋白C端区域的长的合成多肽赋予针对伯格氏鼠疟原虫的依赖CD8+的保护作用。有趣的是，在两种情况中在经免疫小鼠中都引发了相似程度的针对肽PbCS 245-253的CTL应答。事实上，在用短的PbCS 245-253 CTL肽或长的PbCS 242-310肽免疫的小鼠中，通过ELISPOT测定的CTL频率是相似的。既然已知注射CTL表位后没有观察到保护作用，本实验指出寄生虫特异性T辅助细胞及肽PbCS 242-310和天然CS蛋白特异性抗体在抗寄生虫免疫中同样发挥作用。
已知T辅助细胞和抗体能够独立提供针对疟疾红细胞外阶段的保护作用。此实验显示肽特异性抗体同样具有识别伯格氏鼠疟原虫子孢子上的天然蛋白质的能力，由此假设它们能够在体内中和子孢子。这导致受感染肝细胞数目的减少和保护作用，由CD8+T细胞介导作为肝阶段间平衡改变的结果，CD8+T细胞支持后者。
除了产生抗体，注射肽PbCS 242-310同样诱导Th1细胞增殖(数据未显示)，但是保护作用似乎不依赖CD4+T细胞。此处，通过为特异性CTL或B细胞提供帮助，CD4+T细胞可能在肽特异性免疫应答中发挥决定性作用。
这些结果证明，当在IFA中注射时，长的多肽是有效的免疫原。此处，肽PbCS 242-310免疫不仅产生广泛的免疫应答，而且提供针对子孢子诱导的感染的依赖CD8+的保护作用。特别且出乎意料的是，氧化的材料诱导较大数目的CTL前体，并导致较好程度的针对子孢子攻击的保护作用。
该实验的数据是在进行中的I期人试验中使用恶性疟原虫氧化的CS末端片段的基础。获得的结果显示，在人体内同样获得了相似抗体、T细胞增殖、和CTL应答(参照实施例2)。实施例2人体内针对恶性疟原虫环子孢子蛋白C端氧化的片段的免疫应答1.序言评价对应于恶性疟原虫NF54株环子孢子蛋白C末端的合成肽PfCS 282-383作为潜在的疟疾疫苗；该研究随指示其能够在多种动物模型中引发抗体、淋巴细胞增殖、和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，以及保护免受疟疾感染的临床前研究而启动。当在存在佐剂的条件下注射时，将评估设计成开放式的、非随机的、以确定肽的安全性为目的之I期临床试验。
2.肽的表征合成、纯化、并将肽无菌分装于适于每次测试剂量的玻璃瓶中。制剂的品质达到了用于人的GLP产品的标准。
3.结果如图4和5所示，用溶于MontanideTMISA-720的100μg抗原免疫首次进行实验的志愿者后，获得了抗体应答和T细胞增殖。相似的，免疫后观察到依赖CD8的IFN-γ生成(表3)。
表3概括了实验结果，其中在免疫前、第二次免疫后2或3个月、和第三次免疫后3个月，评价了PfCS NF54(334-342)的HLA-A*0201表位的特异性CD8应答。具体而言，通过ELISPOT，使用斑点计数的不同方法，平行的、在视觉上、在2台不同的ELISPOT读数器(AID 1.2和BioSys)中，计算产生IFN-γ的细胞。取决于计数方法，获得了不同的结果。表3第二次和第三次免疫前后HLA-A*0201志愿者体内的CD8特异性应答
*特异性CD8细胞/106个CD8；8名HLA-A*0201志愿者的平均值和好的应答者体内的应答范围**当计数方法分别给出所有阳性或阴性应答时，8名志愿者确定为好的应答者或不应答者；当不一致时，确定为中等应答者***冷冻细胞的分析；在其它时间点，用新鲜细胞进行分析总之，该实施例提供了证据证明，长的合成多肽代表了产生能够刺激免疫系统多个方面的疫苗的有价值的替代物。
权利要求
1.针对疟疾的疫苗，其特别是用于人类，该疫苗包含具有疟原虫属的种环子孢子蛋白C端部分的氨基酸序列的多肽，该多肽至少包含4个末端半胱氨酸，其中至少一对被氧化，该疫苗任选的还包含合适载体和/或佐剂和/或生物可降解微囊。
2.权利要求1的疫苗，其中环子孢子蛋白是恶性疟原虫的。
3.权利要求2的疫苗，其中环子孢子蛋白是恶性疟原虫NF54株的。
4.权利要求1-3的疫苗，其中多肽由衍生自环子孢子蛋白C端部分的至少42个连续氨基酸组成。
5.权利要求1-4的疫苗，其中多肽包含恶性疟原虫NF54的C端第342-383位氨基酸。
6.权利要求1-5的疫苗，其中所有半胱氨酸都被氧化。
7.权利要求1-6的疫苗，其中佐剂是MontanideTM。
8.权利要求1-7的疫苗，用于预防疟疾。
9.权利要求1-7的疫苗用于预防疟疾的用途。
10.用于针对疟疾的疫苗中的多肽，该多肽具有疟原虫属的种环子孢子蛋白C端部分的氨基酸序列，该多肽包含四个末端半胱氨酸，其中至少一对被氧化。
11.权利要求10的多肽，其中环子孢子蛋白是恶性疟原虫的。
12.权利要求11的多肽，其中环子孢子蛋白是恶性疟原虫NF54株的。
13.权利要求10-12的多肽，其中多肽由衍生自环子孢子蛋白C端部分的至少42个连续氨基酸组成。
14.权利要求10-13的多肽，该多肽包含恶性疟原虫NF54的C端第342-383位氨基酸。
15.权利要求10-14的多肽，其中所有半胱氨酸都被氧化。
16.权利要求10-15的多肽，用于针对疟疾的疫苗。
17.权利要求10-15的一种或多种多肽用于制备针对疟疾的疫苗的用途。
全文摘要
本发明涉及针对疟疾的疫苗,该疫苗包含具有疟原虫属的物种环子孢子蛋白C端部分的氨基酸序列的多肽,其中多肽的一对或多对半胱氨酸残基被氧化,且任选地含有用于人类的合适载体和/或佐剂和/或生物可降解微囊。
文档编号A61K39/00GK1341150SQ00803951
公开日2002年3月20日 申请日期2000年2月17日 优先权日1999年2月18日
发明者G·科拉迪恩, M·罗杰罗 申请人:Rmf迪克塔吉恩有限公司