专利名称：获自茅术的消炎药的制作方法
技术领域：
本发明属于控制与炎症相关的疾病的营养活性剂和药物活性剂领域。更具体地说，本发明涉及植物的有机提取物在抑制发炎组织内促炎因子的活性以及预防非发炎组织内促炎因子的刺激作用中的应用。
将非甾类消炎药(NSAIDs)用于缓解与炎症过程相关的疼痛和肿胀。这些化合物通过抑制前列腺素的合成起作用。然而，因为前列腺素还涉及维持正常的胃肠功能，所以这些化合物可能具有严重的胃肠副作用。皮质类固醇提供了另一种替代NSAIDs的选择；不过，皮质类固醇甚至可以导致比NSAIDs更大的副作用，尤其是当需要较长的疗程时更是如此。
NSAIDs是环加氧酶的抑制剂。它们干扰环加氧酶类的活性且由此抑制前列腺素的合成。目前已知有两种环加氧酶与前列腺素的合成有关。将导致胃肠组织内前列腺素合成的环加氧酶称作环加氧酶-1(COX-1)，而将导致发炎组织内前列腺素合成的环加氧酶称作环加氧酶-2(COX-2)。
据报导NSAIDs可以选择性地抑制COX-1或COX-2的活性。参见O’Neill等《分子药理学》(Molec.Pharmacol.)45，245-254(1994)。这提示应能够抑制COX-2的活性而不会显著抑制COX-1的活性。因此，应能够控制患有与炎症相关的疾病的患者的病情而不会导致明显的胃肠副作用。
已经在酶检测试验中证实茅术的有机提取物可抑制环加氧酶-1活性。参见Resch等《天然产物杂志》(J.Nat.Prod.)61，347-350(1998)。来自茅术根茎的甲醇、二氯甲烷和正己烷提取物均表现出对COX-1活性的抑制作用。据报导所述的正己烷提取物含具有显著抑制COX-1作用的茅术色烯(atractylochromene)。该参考文献没有公开或提示茅术的有机提取物作为选择性COX-2抑制剂的用途或可以将任何纯化和分离的化合物对诸如人这样的哺乳动物给药。
非常需要提供一种选择性抑制COX-2和其它促炎因子活性而不会明显影响COX-1活性的活性剂。
发明概述本发明提供了一种用于抑制哺乳动物体内环加氧酶-2和其它促炎因子活性的方法。该方法包括对所述的哺乳动物给予治疗有效量或预防有效量的茅术(Atractylodes lancea)有机提取物的步骤。本发明有机提取物对环加氧酶-2和其它促炎因子活性的抑制作用明显大于该有机提取物对环加氧酶-1活性的抑制作用。
本发明还提供了一种用于控制哺乳动物疾病的方法，其中通过抑制环加氧酶-2或其它促炎因子而有利于所述疾病。该方法包括对所述的哺乳动物给予治疗有效量或预防有效量的茅术有机提取物的步骤。
发明详述本文所用的术语“纯化的”包括部分纯化和完全纯化的含义。因此，“纯化的化合物”既可以是部分纯化的化合物也可以是完全纯化的化合物。术语“促炎因子”指的是涉及炎症过程的物质(例如细胞因子和类二十烷酸(eicosinoids))和过程(例如炎症细胞与蛋白质基体的结合)。本文所用的术语“提取物”包括粗提取物、纯化的提取物和通过纯化所述提取物而得到的纯化的化合物。
已经发现植物茅术的根茎的有机提取物显示出选择性地抑制环加氧酶-2(COX-2)。这种抑制作用是选择性的，即对COX-2的抑制作用明显大于对环加氧酶-1(COX-1)的抑制作用。还证实这些提取物可抑制其它的促炎因子。
因此，可以将茅术的根茎的有机提取物用于选择性地抑制哺乳动物体内COX-2和其它促炎因子的活性而不会导致相当程度的对COX-1活性的抑制作用。活性受到茅术有机提取物抑制的促炎因子包括COX-2活性、15-脂氧化酶活性、血栓烷合成酶活性、炎症细胞与纤连蛋白的粘附、炎症细胞与VCAM-1粘附、IL-1β细胞因子释放、IL-2细胞因子释放、IL-6细胞因子释放、干扰素-γ细胞因子释放、TNF-α细胞因子释放、TNF-α介导的PGE2释放、IL-1α介导的PGE2释放、促炎基因的NF-AT转录和促炎基因的NF-κB转录。
可以将本发明的提取物用于治疗(manage)患有疾病或处于发生疾病危险中的哺乳动物，其中通过抑制环加氧酶-2或其它促炎因子而有利于所述疾病。通过抑制环加氧酶-2或其它促炎因子而有利的疾病包括例如一般性炎症、关节炎、疼痛和癌症。
优选茅术提取物对COX-2的抑制作用至少约是其对COX-1抑制作用的2倍大。更优选它对COX-2的抑制作用至少约是其对COX-1抑制作用的10倍大。
制备药物制剂的本领域普通技术人员可以方便地使用公知的赋形剂(例如盐水、葡萄糖、淀粉等)配制含有茅术提取物的药物组合物。类似地，制备营养剂的本领域普通技术人员可以方便地配制含有茅术提取物的营养组合物。且调配食品或食品成分配方的本领域普通技术人员可以方便地配制含有茅术提取物的食品组合物或食品成分组合物(food ingredient composition)。
此外，本领域普通技术人员可以方便地确定在使用口服、非肠道、直肠和其它给药方式时达到所需治疗或预防作用所必需的合适剂量。一般来说，将体内模型(即实验室哺乳动物)用于确定达到与炎症相关的疾病的所需缓解作用所必需的合适血浆浓度。
本发明提供了一种用于控制哺乳动物体内疾病的方法，其中通过抑制环加氧酶-2或其它促炎因子而有利于所述疾病。该方法包括对所述的哺乳动物给予治疗有效量或预防有效量的茅术有机提取物的步骤。
本发明的有机提取物可以通过提取茅术、特别是提取茅术的根茎而获得。在一种理想的方法中，将茅术的根茎研磨成细粉、将所得的粉末用溶剂提取并从该提取物中除去提取溶剂。如果需要，可以进一步将所得的提取物纯化而产生纯化的提取物或一种或多种纯化的化合物。
研磨步骤可以通过用于研磨植物物质的任意常规公知方法来完成。例如，可以使所述植物的根茎通过研磨机而获得细粉。在将茅术根茎研磨成细粉后，将它们与提取溶剂合并。
在可有效获得对COX-2和/或其它促炎因子活性具有所需抑制作用的提取物的温度和时间期限条件下搅拌该溶液。不应使所述溶液过热，因为这可导致所述提取物降解。可以在约室温(25℃)与提取溶剂的沸点之间的温度下搅拌该溶液。优选在约室温下搅拌该溶液。
使所述根茎粉末与提取溶剂接触的时间长度并不关键。到目前为止，根茎粉末与提取溶剂接触的时间越长，则可以回收的提取物的量越大。优选将所述溶液搅拌至少1分钟、更优选搅拌至少15分钟且最优选搅拌至少60分钟。
使用有机溶剂或有机溶剂的混合物可以理想地进行本发明的提取过程。可以用于本发明提取过程的有机溶剂包括烃类溶剂、醚类溶剂、氯化了的溶剂、丙酮、乙酸乙酯、丁醇、乙醇、甲醇、异丙醇及其混合物。可以用于本发明的烃类溶剂包括庚烷、己烷和戊烷。可以用于本发明的醚类溶剂包括乙醚。可以用于本发明的氯化了的溶剂包括二氯甲烷和氯仿。优选所述的溶剂是非极性有机溶剂，诸如二氯甲烷或己烷。
用于提取过程的溶剂的相对量可以随所用特定溶剂的不同而显著改变。一般来说，就每提取100克根茎粉末而言，可以使用约500ml的提取溶剂。
可以通过化学领域中众所周知的任意方法从所述提取物中除去有机溶剂以便从所需产物中除去有机溶剂，例如，所述的方法包括旋转蒸发法。
认为本发明茅术提取物对COX-2和其它促炎因子活性的抑制作用是由于在所述提取物中存在的一种或多种化合物所导致的。本领域普通技术人员可以使用本领域中公知的方法分离并纯化存在于该提取物中可抑制COX-2和其它促炎因子活性的化合物。例如，可以将柱层析和分馏法用于从本发明的茅术提取物中获得纯化合物。
可以如Resch等在《天然产物杂志》(J.Nat.Prod.)61，347-350(1998)中所述从茅术的有机提取物中分离并纯化特定的化合物，将该文献的全部内容引入本文作为参考。可以将其中公开的方法用于分离和纯化对COX-2和其它促炎因子表现出选择性抑制活性的化合物。
下列实施例用来解释本发明的某些优选的实施方案且并不意味着用来限定本发明。
制备实施例1将茅术根茎(Oriental Ginseng and Gift，St.Louis，MO)干燥并切片。使用咖啡磨碎机将切片的根茎研磨成细粉。将100克所得的粉末加入到500ml的二氯甲烷中并在室温下搅拌1小时。然后通过旋转蒸发法除去溶剂，从而产生5.1克的黄棕色油、为提取物。
实施例1茅术根茎的有机提取物对COX-1和COX-2活性的抑制作用评价在制备实施例1中获得的有机提取物对COX-1和COX-2的选择性抑制作用。通过Gierse等在《生化杂志》(J.Biochem.)305，479-484(1995)所述的人工识别法(art-recognized method)在体外测定对COX-1和COX-2的抑制活性，如下所概括。重组COX杆状病毒的制备按照与D.R.O’Reilly等在《杆状病毒表达载体实验室手册》(Baculovirus Expression VectorsA Laboratory Manual)(1992)中所述类似的方法，通过将含有人或鼠COX-1编码区的2.0kb片段克隆入杆状病毒转移载体pVL1393(Invitrogen)的BamH1位点而生成用于COX-1的杆状病毒转移载体来制备重组COX-1。
通过用磷酸钙法将4μm杆状病毒转移载体DNA与200mg线性化杆状病毒质粒DNA一起转染入(2×108)SF9昆虫细胞来分离重组杆状病毒。(参见M.D.Summers和G.E.Smith，“杆状病毒载体和昆虫细胞培养过程的方法指南”(A Manual of Methods for BaculovirusVectors and Insect Cell Culture Procedures)-《德克萨斯农业实验站简报》(Texas Agric.Exp.Station Bull.)1555(1987))。通过3个循环的噬斑纯化来纯化重组病毒并制备高滴度(107-108pfu/ml)的病毒储备液。
就大规模生产而言，使SF9昆虫细胞用重组病毒储备液在10升发酵罐中受到感染(0.5×106/ml)，使得感染复数为0.1。在72小时后，离心细胞并在含有1％ 3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)的Tris/蔗糖(50mM25％，pH8.0)中匀化细胞沉淀。以10,000×G将匀化物离心30分钟并将所得的上清液保存在-80℃下。
按照与上述相同的方式通过克隆含有人或鼠COX-2编码区的2.0kb片段来制备重组COX-2。COX-1和COX-2活性的测定使用用于检测从花生四烯酸合成的前列腺素E2的ELISA将COX-1和COX-2测定为形成的PGE2/μg蛋白质/时间。在含有肾上腺素、苯酚和血红素的磷酸钾缓冲液(50mM，pH8.0)中培养含有COX-1和COX-2酶的CHAPS溶解的昆虫细胞膜。用合适的酶将化合物预培养10-20分钟。然后将花生四烯酸(10μM)加入到该混合物中并使该反应在室温(25℃)下进行10分钟。
在10分钟后通过将40μl反应混合物转入160μl ELISA缓冲液和25μM吲哚美辛中来终止花生四烯酸与酶之间的任何反应。通过标准的ELISA技术(Cayman Chemical)来测定形成的PGE2。
为进行生物测定试验检测而将获自制备实施例1中的200mg提取物样品溶于2ml的二甲亚砜(DMSO)以便测定提取物的COX-1和COX-2的抑制作用。将这些生物测定试验的结果报导在表1中。
表1
附
图1是表示表1数据的示意图。正如可以在附图1中观察到的，实施例1中获得的提取物对COX-2的抑制作用远大于它对COX-1的抑制作用。附图1表示提取物的COX-1 IC50是350μg/ml，而提取物的COX-2 IC50是5μg/ml。因此，实施例1的茅术提取物对COX-2的抑制作用是它对COX-1的抑制作用的70倍。
为进行HPLC分析而制备制备实施例1的有机提取物于异丙醇中(1mg/ml)的样品。制备实施例1的HPLC分析结果如附图2中所示。
制备实施例2将茅术的根茎(East Earth Herb，Eugene，OR)干燥并切片。使用咖啡磨碎机将切片的根茎研磨成细粉。将100克所得的粉末加入到500ml的二氯甲烷中并在室温下搅拌1小时。然后通过旋转蒸发法除去溶剂，从而产生5.1克的黄棕色油。
实施例2将获自制备实施例2中的200mg提取物样品溶于2ml的二甲亚砜(DMSO)并按照与实施例1中所用相同的方式进行生物测定试验检测。将这些生物测定试验的结果报导在表2中。
表2
附图3是表示表2数据的示意图。正如可以在附图3中观察到的，实施例2中获得的提取物对COX-2的抑制作用远大于它对COX-1的抑制作用。附图3表示提取物的COX-1 IC50是150μg/ml，而提取物的COX-2 IC50是4μg/ml。因此，实施例2的茅术提取物对COX-2的抑制作用是它对COX-1的抑制作用的37倍。
为进行HPLC分析而制备制备实施例2的有机提取物于异丙醇(1mg/ml)中的样品。制备实施例2的HPLC分析结果如附图4中所示。
实施例3将获自制备实施例2中的200mg茅术提取物样品溶于2ml的DMSO。如下将100μl所得溶液的样品在500mg C-18 Bond Elute SPE柱上进行分级分离将该柱用100％甲醇平衡，随后用1∶1的水与甲醇的混合物平衡。将100μl DMSO提取物溶液加入到2.0ml的1∶1水与甲醇的混合溶液中并使所得溶液上柱。然后将该柱另外用1.0ml的水与甲醇的1∶1混合物洗脱，由此产生第一部分级分，将其用3.0ml的1∶1水与甲醇的混合物洗脱。将下一种级分用3.0ml的1∶1水与甲醇溶液洗脱。将第三部分级分用3.0ml的纯甲醇洗脱并将最后一部分级分用3.0ml的二氯甲烷洗脱。通过旋转蒸发干燥4种级分且然后将这4种级分与粗茅术提取物样品一起溶于100μl DMSO以便进行COX-2的生物测定试验。将这些生物测定试验的结果报导在表3中。
表3
附图5是表示表3数据的示意图。正如在附图5中所观察到的，纯甲醇级分表现出的对COX-2的抑制作用高于任何其它纯化的级分。粗提取物也显示出明显的对COX-2的抑制作用。使用HPLC分析纯甲醇级分和阳性对照(即粗提取物)。甲醇级分和阳性对照的HPLC分析结果分别如附图6和7中所示。
实施例4将5g制备实施例1中的茅术提取物样品溶于50ml的二氯甲烷并在100g SiO2真空快速柱上进行层析。在将50ml提取物溶液上柱后，将该柱用下列200ml级分洗脱100％二氯甲烷；9∶1二氯甲烷∶甲醇；7∶3二氯甲烷∶甲醇；3∶7二氯甲烷∶甲醇和100％甲醇。通过旋转蒸发干燥5种级分且然后将5综级分和阳性对照(即粗提取物)溶于DMSO(100μg/ml)以便进行COX-2的生物测定试验。将生物测定试验的结果报导在表4中。
表4
附图8是表示表4数据的示意图。正如在附图8中所观察到的，第三部分和第四部分级分(分别为7∶3 CH2Cl2∶CH3OH和3∶7CH2Cl2∶CH3OH)表现出明显的对COX-2的抑制活性。
通过HPLC分析7∶3 CH2Cl2∶CH3OH级分。HPLC分析结果如附图9中所示。
实施例5茅术的根茎的有机提取物对15-脂氧化酶活性的抑制作用使用Auerback等在《生化分析》(Anal.Biochem.)201，375-380(1992)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对15-脂氧化酶的抑制作用。制备100μg/ml的溶于0.1％ DMSO的100μg/ml提取物测试溶液。
在pH 7.4和4℃的温度下用15U 15-脂氧化酶(获自家兔的网织红细胞)的磷酸缓冲盐水溶液培养100μg/ml测试溶液样品。通过添加256μM亚油酸作为底物启动反应并使反应进行10分钟，此后通过添加N-苯甲酰基无色美蓝(LMB)使该反应终止。通过测定660nm处的吸收度来确定15-HETE的水平。将这些测定结果列在表5中。
实施例6茅术根茎的有机提取物对血栓烷合成酶活性的抑制作用使用Fiddler等在《循环》(Circulation)81(附录)I69-I78，(1990)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对血栓烷合成酶的抑制作用。制备溶于0.1％ DMSO的100μg/ml的提取物测试溶液。
在pH 7.5和37℃的温度下的Tris缓冲液中用按1∶200稀释的血栓烷A2合酶(获自家兔血小板的微粒体部分)和5ng前列腺素G2作为底物将100μg/ml测试溶液样品培养30分钟。立即将形成的血栓烷A2转化成血栓烷B2，通过放射免疫测定法对其进行定量。将这些测定结果列在表5中。
实施例7茅术根茎的有机提取物对纤连蛋白介导的细胞粘附的抑制作用使用Nowlin等在《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)268，20352-20359(1993)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对纤连蛋白介导的细胞粘附的抑制作用。制备溶于0.1％ DMSO的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
这些试验测试NRK 2(正常大鼠肾)细胞与纤连蛋白包被的孔的粘附作用。在37℃的温度下将pH7.4的各改性MEM-HEPES缓冲液中的测试溶液培养30分钟。通过添加NRK 2细胞(2×106/ml)启动反应并培养30分钟。然后用Dulbecco’s PBS将各孔洗涤6次，随后添加5μM钙黄绿素AM并进一步培养2小时的期限。使用Cytofuor 2300平板读出器定量读取由钙黄绿素AM与粘附纤连蛋白包被的平板的细胞的相互作用而产生的荧光强度，其中所述的读出器带有在485nm处激发和在530nm处发射的B滤波器。将这些试验的结果列在表5中。
实施例8茅术根茎的有机提取物对VCAM-1介导的细胞粘附的抑制作用使用Stoltenborg等在《免疫方法杂志》(J.ImmunologicalMethods)175，59-68(1994)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对VCAM-1介导的细胞粘附的抑制作用。制备溶于0.1％DMSO的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
这些试验测试Jurkat(人T淋巴样)细胞与获自受感染SF9细胞膜的重组人VCAM-1包被的孔的粘附作用。在本试验开始时，在pH7.2下用Dubelco’s PBS(DPBS)洗涤平板。在包被的孔中用pH7.5的RPMI中的Jurkat细胞(用5μg/ml钙黄绿素AM标记的0.5-1×106/ml)和2.5ng/ml PMA(肉豆蔻酰佛波醇乙酯)培养各测试溶液。在25℃下不需振摇而将平板培养60分钟并用PBS洗涤。然后通过在Cytoflour2300上进行平板读数来对粘附情况进行定量。将这些试验的结果列在表5中。
实施例9茅术根茎的有机提取物对IL-1β细胞因子释放的抑制作用使用Welker等在《国际变态反应与免疫学档案》(InternationalArch of Allergy and Immunology)109，110-115(1996)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对IL-1β细胞因子释放的抑制作用。制备溶于0.1％ DMSO的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
在pH7.4和37℃的温度下在生长培养基RPMI-1640中用25ng/ml脂多糖(LPS)和受刺激的人外周血液单核白细胞(PBMNL)将各测试溶液培养过夜。使用夹层ELISA试剂盒对条件培养基中产生的IL-1β细胞因子的浓度进行定量。将这些试验的结果列在表5中。
实施例10茅术根茎的有机提取物对IL-2细胞因子释放的抑制作用使用Welker等在《国际变态反应与免疫学档案》(InternationalArch of Allergy and Immunology)109，110-115(1996)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对IL-2细胞因子释放的抑制作用。制备溶于0.1％ DMSO的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
在pH7.4和37℃的温度下在生长培养基RPMI-1640中用10μg/ml伴刀豆凝集素A(Con-A)和受刺激的人外周血液单核白细胞(PBMNL)培养各测试溶液。使用夹层ELISA试剂盒对条件培养基中产生的IL-2细胞因子的浓度进行定量。将这些试验的结果列在表5中。
实施例11茅术根茎的有机提取物对IL-2细胞因子释放的抑制作用使用Koizumi等在103，469-475(1986)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对IL-2细胞因子释放的抑制作用，其中该方法使用胰蛋白酶消化的Jurkat细胞而非PBMNL。制备溶于0.1％DMSO的00μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
在pH7.4和37℃的温度下以及有或没有1μg/ml钙离子载体(A23187)和25ng/ml PMA(肉豆蔻酰佛波醇乙酯)共刺激存在的情况下用与10％胎牛血清一起悬浮于RPMI-1640中的胰蛋白酶消化的Jurkat(人T淋巴样)细胞(2×106/ml)将各测试溶液培养过夜。将该细胞混悬液进行离心并使用IL-2免疫测定试剂盒对上清液评价IL-2的释放情况。将这些试验的结果列在表5中。
实施例12
茅术根茎的有机提取物对IL-6细胞因子释放的抑制作用使用Welker等在《国际变态反应与免疫学档案》(InternationalArch of Allergy and Immunology)109，110-115(1996)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对IL-6细胞因子释放的抑制作用。制备溶于0.1％DMSO的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
在pH7.4和37℃的温度下在生长培养基RPMI-1640中用LPS(25ng/ml)和受刺激的人外周血液单核白细胞(PBMNL)将各测试溶液培养过夜。使用夹层ELISA试剂盒对条件培养基中产生的IL-6细胞因子的浓度进行定量。将这些试验的结果列在表5中。
实施例13茅术根茎的有机提取物对干扰素-γ细胞因子释放的抑制作用使用下列参考文献中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对干扰素-γ(IFN-γ)细胞因子释放的抑制作用(1)Cohen等《美国临床病理学杂志》(Am.J.Clin.Pathol.)105，589-598(1996)；(2)Henderson等《TIPS》13，145-151(1992)；(3)Welker等《国际变态反应与免疫学档案》(International Arch ofAllergy and Immunology)109，110-115(1996)；和(4)Elias等《免疫学杂志》(J.Immunol.)138，3812-3816(1987)。制备溶于0.1％ DMSO的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
在pH7.4和37℃的温度下在生长培养基RPMI-1640中用10μg/ml伴刀豆凝集素A(Con-A，10μg/ml)刺激的人外周血液单核白细胞(PBMNCs)将各测试溶液培养过夜。使用夹层ELISA试剂盒对条件培养基中产生的干扰素-γ细胞因子的浓度进行定量。将这些试验的结果列在表5中。
实施例14
茅术根茎的有机提取物TNF-α细胞因子释放的抑制作用使用下列参考文献中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对TNF-α细胞因子释放的抑制作用(1)Cohen等《美国临床病理学杂志》(Am.J.Clin.Pathol.)105，589-598(1996)；(2)Henderson等《TIPS》13，145-151(1992)；和(3)Welker等《国际变态反应与免疫学档案》(International Arch of Allergy andImmunology)109，110-115(1996)。制备溶于0.1％ DMSO的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
在pH7.4和37℃的温度下在生长培养基RPMI-1640中用LPS(25ng/ml)和受刺激的人外周血液单核白细胞(PBMNCs)将各测试溶液培养过夜。使用夹层ELISA试剂盒对条件培养基中TNF-α细胞因子的浓度进行定量。将这些试验的结果列在表5中。
实施例15茅术根茎的有机提取物TNF-α介导的PGE2释放的抑制作用使用Lenardo等在《细胞》(Cell)58，227-229(1989)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对TNF-α介导的PGE2释放的抑制作用。制备溶于0.1％ DMSO的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
在pH 7.3和37℃的温度下以及有或没有25nM肿瘤坏死因子-α(TNF-α)存在的情况下用与10％胎牛血清一起悬浮于MEM中的胰蛋白酶消化的Hela(人上皮样宫颈癌)S3细胞(2×106/ml)将各测试溶液培养过夜。然后将各孔中的细胞混悬液转入Eppendorf瓶中、将其进行离心并通过放射免疫测定法对上清液评价释放的PGE2(前列腺素E2)。将这些试验的结果列在表5中。
实施例16茅术根茎的有机提取物IL-1α介导的PGE2释放的抑制作用使用Maloff等在《临床化学学报》(Clin.Chim.Acta)180，73-78(1989)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对IL-1α介导的PGE2释放的抑制作用。制备溶于0.1％ DMSO的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
在pH7.3和37℃的温度下以及有或没有1nM白细胞介素-1α(IL-1α)存在的情况下用与10％胎牛血清一起悬浮于MEM中的胰蛋白酶消化的WI-38(人二倍体肺成纤维细胞)细胞(106/ml)将各测试溶液培养过夜。然后将各孔中的细胞混悬液转入Eppendorf瓶中、将其进行离心并通过放射免疫测定法对上清液评价PGE2(前列腺素E2)的释放情况。将这些试验的结果列在表5中。
实施例17茅术根茎的有机提取物对NFκB的抑制作用使用Karttumen等在《美国国家科学院学报》(Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA)88，3972-3976(1991)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对NFκB的抑制作用。制备溶于0.1％ DMSO的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
在这些试验中使用用效应元件-LacZ报道基因转染的Jurkat(人T淋巴样)细胞，其中由BF-κB转录因子(κB-Z细胞)的结合位点指导β-半乳糖苷酶基因的转录。在pH7.4和37℃下的RPMI缓冲液中以及有2μM钙离子载体(A23187)和20ng/ml PMA存在的情况下用κB-Z细胞2μg/ml(2×105)将各测试溶液培养4小时。然后将细胞离心、重新悬浮于缓冲液中并在25℃下在暗处培养过夜后测定通过诱导的β-半乳糖苷酶活性将FDG(荧光素二-β-D-吡喃半乳糖苷)转化成荧光素的情况。使用具有在485nm处激发和在530nm处发射的Cytoflour(2300)平板读出器测定荧光强度。将这些试验的结果列在表5中。
实施例18茅术根茎的有机提取物对NF-AT的抑制作用使用Emmel等在《科学》(Science)246，1617-1620(1989)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对NF-AT的抑制作用。制备溶于0.1％ DMSO的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
将用效应元件-LacZ报道基因转染的Jurkat(人T淋巴样)细胞用于本试验，其中由NFAT-1转录因子的结合位点指导β-半乳糖苷酶基因的转录。在pH7.4和37℃下的RPMI缓冲液中以及有2μM钙离子载体(A23187)和20ng/ml PMA存在的情况下用细胞2×105将各测试溶液培养4小时。然后将细胞离心并重新悬浮于缓冲液中并在25℃下在暗处培养过夜后测定通过诱导的β-半乳糖苷酶活性将FDG(荧光素二-β-D-吡喃半乳糖苷)转化成荧光素的情况。使用具有在485nm处激发和在530nm处发射的Cytoflour(2300)平板读出器测定荧光强度。将这些试验的结果列在表5中。
表5
实施例19可以用治疗有效量或预防有效量的本发明茅术提取物治疗患有疾病或处于发生疾病危险中的哺乳动物，其中该疾病通过抑制COX-2或其它促炎因子而受益。可以通过对患者给予药物活性剂的任意公知途径对哺乳动物给予治疗有效量或预防有效量的茅术提取物，其中所述的给药途径包括非肠道、口服和直肠给药。可以使用将哺乳动物体内COX-2或其它促炎因子活性有效抑制所需时间期限的给药方案来给予茅术提取物。可以使用本领域中公知的方法、通过常规实验测定合适的剂量。
本发明的其它变化形式和修改形式对本领域技术人员来说是显而易见的。除权利要求中所列之外，并不对本发明进行限定。
权利要求
1.一种用于抑制哺乳动物体内促炎因子活性的方法，所述的方法包括对所述的哺乳动物给药茅术的有机提取物的步骤。
2.一种根据权利要求1所述的方法，其中所述的促炎因子选自环加氧酶-2、15-脂氧化酶、血栓烷合成酶、炎症细胞与纤连蛋白的粘附、炎症细胞与VCAM-1的粘附、IL-1β细胞因子释放、IL-2细胞因子释放、IL-6细胞因子释放、干扰素-γ细胞因子释放、TNF-α细胞因子释放、TNF-α介导的PGE2释放、IL-1α介导的PGE2释放、促炎基因的NF-AT转录和促炎基因的NF-κB转录。
3.一种根据权利要求1所述的方法，其中所述的促炎因子是环加氧酶-2。
4.一种根据权利要求3所述的方法，其中所述提取物对环加氧酶-2的抑制作用是所述提取物对环加氧酶-1的抑制作用的约2倍或更多倍大。
5.一种根据权利要求3所述的方法，其中所述提取物对环加氧酶-2的抑制作用是所述提取物对环加氧酶-1的抑制作用约10倍或更多倍大。
6.一种根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中所述的有机提取物是一种通过包括下列步骤的方法获得的纯化的化合物(i)使茅术的根茎与有机溶剂在适合于从所述根茎中提取出促炎因子抑制的提取物的条件下进行接触；和(ii)分离所述的促炎因子抑制的提取物。
7.一种根据权利要求6所述的方法，其中步骤(i)包括将所述的根茎与所述的溶剂混合并在约25℃-所述溶剂沸点的温度下将所得的混合物搅拌至少1分钟。
8.一种根据权利要求7所述的方法，其中所述的溶剂是有机溶剂。
9.一种根据权利要求8所述的方法，其中所述的有机溶剂选自烃类溶剂、醚类、氯化溶剂、丙酮、乙酸乙酯、丁醇、乙醇、甲醇、异丙醇及其混合物组成的组。
10.一种根据权利要求9所述的方法，其中所述的非极性有机溶剂是二氯甲烷。
11.一种根据权利要求9所述的方法，其中步骤(ii)包括通过蒸发所述溶剂而从所述有机提取物中分离所述溶剂。
12.一种根据权利要求6所述的方法，该方法包括对患有疾病或处于发生疾病危险中的哺乳动物给予治疗有效量或预防有效量的所述纯化的化合物的步骤，其中该疾病通过抑制促炎因子的活性而受益。
13.一种根据权利要求12所述的方法，其中所述的疾病是一种环加氧酶-2介导的疾病。
14.一种根据权利要求13所述的方法，其中所述的环加氧酶-2介导的疾病是一般性炎症。
15.一种根据权利要求13所述的方法，其中所述的环加氧酶-2介导的疾病是关节炎。
16.一种根据权利要求13所述的方法，其中所述的环加氧酶-2介导的疾病是疼痛。
17.一种根据权利要求13所述的方法，其中所述的环加氧酶-2介导的疾病是癌症。
18.一种根据权利要求12所述的方法，其中将所述的纯化的化合物作为包括药物上可接受的赋形剂的药物组合物的形式给药。
19.一种根据权利要求12所述的方法，其中将所述的纯化的化合物作为包括营养上可接受的赋形剂的营养组合物的形式给予。
20.一种根据权利要求12所述的方法，其中将所述的纯化的化合物作为一种食品组合物的形式给予。
21.一种根据权利要求12所述的方法，其中将所述的纯化的化合物作为食品成分组合物的形式给予。
全文摘要
本发明提供了一种用于抑制哺乳动物体内环加氧酶－2和其它促炎因子活性的方法。该方法包括对所述的哺乳动物给予治疗有效量或预防有效量的茅术有机提取物的步骤。本发明有机提取物对环加氧酶－2活性的抑制作用显著大于该有机提取物对环加氧酶－1活性的抑制作用。本发明还提供了一种用于治疗患有疾病或处于发生疾病的危险中的哺乳动物的方法,其中该疾病受益于抑制环加氧酶－2或其它促炎因子。该方法包括对所述的哺乳动物给予治疗有效量或预防有效量的茅术有机提取物的步骤。
文档编号A61P29/02GK1362881SQ00805265
公开日2002年8月7日 申请日期2000年3月20日 优先权日1999年3月19日
发明者D·G·克里, M·奥布科维克兹 申请人:法玛西雅公司