专利名称：马杜拉酞嗪衍生物用作前炎症细胞因子抑制剂的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及本身是已知的和新的、作为前炎症细胞因子抑制剂的马杜拉酸(maduranic acid)衍生物用于制备治疗由这些细胞因子介导的疾病的药物的应用。
IL-4控制T细胞的分化，先生成IL-4和IL-5，以增加Th2细胞的生成(A.Mori等，Intern.Immun.8(1996)，1889)。这3种细胞因子的作用最终引发以炎症表现出来的病原体控制应答。
许多疾病被认为是与这一系统的失调有关。因而，对无害的外来物质的过量的应答可能是过敏性疾病的病因，例如，哮喘、鼻炎、结膜炎或皮炎。移植后的免疫保护应答可能导致有害的排斥反应。
能够抑制白细胞介素-2、白细胞介素-4和白细胞介素-5作用的物质因此应该具有治疗意义，用于治疗由这些细胞因子介导的疾病。
比如糖皮质激素，例如，有强效抗炎和免疫抑制活性的倍氯米松或布地缩松已被证明能够抑制IL-2、IL-4和IL-5(P.J.Barnes，Eur.Respir.J.9(1996)Suppl.22，154和J.Schmidt等，Europ.J.Pharm.260(1994)247)。副作用比如增加眼内压、增加对感染的易受性、损害激素控制系统(骨质疏松、儿童生长迟缓)可能限制糖皮质激素的应用。最后，环孢素A(CsA)已被发现对这三种细胞因子有抑制作用(B.Ryffel，Pharmacol.Rev.41(1989)，407)。也是在此情况下，各种副作用已经被发现(例如肾毒性)(D.Faulds，K.L.Goa，P.Benfield，Drugs 45(1993)953)。
本发明的目的是提供细胞因子白细胞介素-2、白细胞介素-4和白细胞介素-5的非常活泼的抑制剂以用来制备治疗由这些细胞因子介导的疾病的药物。
马杜拉酸或马杜拉羟基内酯是一种从马拉杜放线菌属(Actinomadura rubra)通过发酵得到的天然产物(DD 285 614W.F.Fleck，D.G.Strauss，J.Meyer，Z.Allg.Mikrobiol.18(1978)368-398)。该化合物的结构(式1)被Paulus及其同事们说明(E.F.Paulus，K.Dornberger，W.Werner，D.Fenske，Acta Cryst.C50(1994)2064-2067) 该化合物及其烷基同系物的抗菌作用、主要是对革兰氏阳性菌的作用已被描述(W.F.Fleck等，Z.Allg.Mikrobiol.18(1978)，389)。
另外，一些式2和式3的马杜拉酞嗪(maduraphthalazine)衍生物的合成已被描述，它们的抗微生物能力已被研究(E.Roemer等4th Int.Conf.on Chemical Synthesis of Antibiotics and RelatedMicrobial Products，Nashville，USA，1994)， 例如，其中-R为-H、-CH3、-(CH2)2CH3、-(CH2)2OH、苯基，和 例如，其中R1＝R2＝R3＝R4＝-CH3，R1＝R2＝R3＝R4＝-COCH3，R1＝R2＝-H和R3＝R4＝-CH3，R1＝R2＝-COCH3和R3＝R4＝-CH3，R1＝R2＝R4＝-H，和R3＝-COOCH3。
本发明因而涉及式4化合物 其中R1是氢，以及直链或支链的、任选被下列基团一次或多次取代的C1-12-烷基-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR7、-NO2、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R7、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、-SOR8、-SO2R8、-OSO2C1-6烷基、-OSO2C6-14芳基、-(CS)R7、-O(CO)R7、-(CO)R9、具有3-14个环成员的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环、具有5-15个环成员和1-6个杂原子、优选N、O和S的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环，其中，C6-14芳基和所述的碳环和杂环取代基又可以任选地被R10一次或多次取代；单-或多不饱和的、直链或支链的、任选被下列基团一次或多次取代的C1-12-链烯基-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR7、-NO2、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R7、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、-SOR8、-SO2R8、-OSO2C1-6烷基、-OSO2C6-14芳基、-(CS)R7、-O(CO)R7、-(CO)R9、具有3-14个环成员的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环、具有5-15个环成员和1-6个杂原子、优选N、O和S的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环，其中C6-14芳基和所述的碳环和杂环取代基又可以任选地被R10一次或多次取代；具有3-14个环成员的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环，其任选地被下列基团一次或多次取代-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR7、-NO2、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R7、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、-SOR8、-SO2R8、-OSO2C1-6烷基、-OSO2C6-14芳基、-(CS)R7、-O(CO)R7、-(CO)R9，其中C6-14芳基又可以任选地被R10一次或多次取代；具有5-15个环成员和1-6个杂原子、优选N、O和S的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环，其任选地被下列基团一次或多次取代-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR7、-NO2、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R7、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、-SOR8、-SO2R8、-OSO2C1-6烷基、-OSO2C6-14芳基、-(CS)R7、-O(CO)R7、-(CO)R8，其中C6-14芳基又可以任选地被R10一次或多次取代；具有3-10个环成员、杂环系统含有1-6个杂原子、优选N、O和S的碳环或杂环状的饱和的或单或多不饱和的螺环，其任选地被下列基团一次或多次取代-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR7、-NO2、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R7、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、-SOR8、-SO2R8、-OSO2C1-6烷基、-OSO2C6-14芳基、-(CS)R7、-O(CO)R7、-(CO)R8，其中C6-14芳基又可以任选地被R10一次或多次取代；R2、R3、R4、R5、R6可以相同或不同，它们可以是氢，以及任选地被下列基团一次或多次取代的、直链或支链C1-6--烷基-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR7、-NO2、-CN、-(CO)R8、-(CS)R7、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R7、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、-SOR8、-SO2R8；
任选地被下列基团一次或多次取代的CO-C1-6烷基-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR7、-NO2、-CN、-(CO)R8、-(CS)R7、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R7、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、-SOR8、-SO2R8；任选地被下列基团一次或多次取代的COO-C1-6烷基-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR7、-NO2、-CN、-(CO)R8、-(CS)R7、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R7、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、-SOR8、-SO2R8；R7是C1-6-烷基、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6烷基)2、-NHC6-14-芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、或具有3-14个环成员的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环、或具有5-15个环成员和1-6个杂原子、优选N、O和S的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环；R8是-H、-C1-6-烷基、-NH2、-NHC1-6烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR7、-OH、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、或具有3-14个环成员的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环、或具有5-15个环成员和1-6个杂原子、优选N、O和S的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环；R9是-H、-C1-6-烷基、或具有3-14个环成员的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环、或具有5-15个环成员和1-6个杂原子、优选N、O和S的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环；R10是-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR7、-NO2、-CN、-(CO)R8、-(CS)R7、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R7、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、-SOR8、-SO2R8，和A，B可以是-CH2-、-CH(OH)或A+B可以是-CH＝CH-。
本发明的化合物是新的，除了应用实施例1-5中具有下列取代基的化合物R2、R3、R4、R5＝-H.
R6＝-CH3，A、B＝-CH2-，和R1＝-H、-CH3、-(CH2)2CH3、-(CH2)2OH、-苯基；以及具有下列取代基的式4化合物R1＝-苯基，R6＝-CH3，A、B＝-CH2-，和a) R2＝R3＝R4＝R5＝-CH3，b)R2＝R3＝R4＝R5＝-COCH3(应用实施例12)，c)R2＝R3＝-H，和R4＝R5＝-CH3，d)R2＝R3＝-COCH3和R4＝R5＝-CH3，e)R2＝R4＝R5＝-CH3，和R3＝-H，f)R2＝R4＝R5＝-CH3，和R3＝-COCH3，g)R2＝R3＝R5＝-H，和R4＝-COCH3，h)R2＝R3＝R5＝-H，和R4＝-COOCH3(应用实施例7)，i)R2＝R3＝R5＝-H，和R％-CH2COOH。
本发明进一步地涉及式4化合物的可药用盐。可药用盐是用常规方法，通过将碱用无机酸或有机酸中和得到的，或通过将酸用无机碱或有机碱中和得到的。适宜的无机酸的例子是盐酸、硫酸、磷酸或氢溴酸；适宜的有机酸的例子是羧酸、磺酸，比如醋酸、酒石酸、乳酸、丙酸、羟基乙酸、丙二酸、马来酸、富马酸、鞣酸、琥珀酸、藻酸、苯甲酸、2-苯氧苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、柠檬酸、苹果酸、水杨酸、3-氨基水杨酸、抗坏血酸、双羟萘酸、烟酸、异烟酸、草酸、氨基酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、乙烷-1，2-二磺酸、苯磺酸、4-甲基苯磺酸或萘-2-磺酸。适宜的无机碱的例子是氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、氨；有机碱的例子是胺、但优选叔胺，比如三甲胺、三乙胺、吡啶、N，N-二甲基苯胺、喹啉、异喹啉、α-甲基吡啶、β-甲基吡啶、γ-甲基吡啶、喹哪啶或嘧啶。
此外，可以通过已知的方法将有叔胺基的衍生物在季铵化剂存在下转化成相应的季铵盐得到式4化合物的可药用盐。适宜的季铵化剂的例子是烷基卤化物，比如甲基碘、乙基溴和n-丙基氯，也可以是芳基烷基卤化物，比如苄基氯或2-苯乙基溴。
本发明进一步地涉及含有不对称碳原子的式4化合物的D型化合物、L型化合物和D，L混合物，在多个不对称碳原子的情况下，还涉及它们的非对映形式。含有不对称碳原子并且通常以外消旋体得到的式4化合物可用已知方法例如光学活性的酸拆分成光学活性异构体。然而，也可能从头开始使用光学活性的起始原料，在此种情况下得到的最终产物是一种相应的光学活性化合物或非对映体化合物。
本发明涉及本发明的化合物或其可药用盐作为细胞因子IL-2、IL-4和IL-5的抑制剂用于制备治疗由这些细胞因子介导的疾病的药物的应用。
这些疾病包括例如，支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、特应症皮炎、湿疹、变应性脉管炎；由嗜酸性粒细胞介导的炎症比如嗜酸性粒细胞筋膜炎、嗜酸性粒细胞肺炎和PIE综合症；自身免疫病比如类风湿关节炎、类风湿脊椎炎、红斑狼疮、多发性硬皮病、牛皮癣、肾小球肾炎和眼色素层炎、依赖胰岛素糖尿病和败血症。
本发明的化合物或其可药用盐另外还可用于制备细胞、组织或器官移植后的预防排斥反应的药物。
除了常规的助剂、载体和添加剂外，这些药物是使用有效量的本发明的化合物或其盐制备的。
活性成分的剂量可根据给药途径、病人的年龄、体重、欲治疗疾病的性质和严重程度及类似因素来改变。每日剂量通常为0.001-100mg，可以作为给药的单一剂量一次服用或分成每日两次或多次给药。
适宜的给药形式是口服、非经胃肠、静脉、经皮、局部、吸入和鼻内给药制剂。
通常使用盖仑制剂比如片剂、包衣片、胶囊、分散粉末、颗粒、水溶液、水悬浮液或油性悬浮液、糖浆、汁液或滴剂。
固体药物形式可含有比如惰性成分和载体，例如，碳酸钙、磷酸钙、磷酸钠、乳糖、淀粉、甘露糖醇、藻酸盐、明胶、瓜尔胶、硬脂酸镁或硬脂酸铝、甲基纤维素、滑石、高分散硅石、硅油、高分子量脂肪酸(比如硬脂酸)、明胶、琼脂或植物或动物脂和油、固体高分子量聚合物(比如聚乙二醇)；如果需要的话，适于口服的制剂可另外含有调味剂和/或甜味剂。
液体药剂可以是灭菌的，和/或需要时可含有助剂，比如防腐剂、稳定剂、湿润剂、渗透剂、乳化剂、分散剂、增溶剂、盐、糖或糖醇以调节渗透压或缓冲，和/或需要时可含有粘度调节剂。这些类型的添加剂的例子是酒石酸和柠檬酸缓冲液、乙醇、配位剂(比如乙二胺四乙酸及其无毒盐)。适于调节粘度的是比如高分子量聚合物，例如，液态聚环氧乙烷、微晶纤维素、羧甲基纤维素、聚乙吡咯烷酮、葡聚糖或明胶。固体载体的例子是淀粉、乳糖、甘露糖醇、甲基纤维素、滑石、高分散硅石、高分子量脂肪酸(比如硬脂酸)、明胶、琼脂、磷酸钙、硬脂酸镁、动物和植物脂、固体高分子量聚合物比如聚乙二醇。
非经胃肠或局部使用的油悬浮液可含有比如合成或半合成植物油，例如，各种情况下，脂肪酸链上具有8-22个碳原子的液态脂肪酸酯，例如，棕榈酸、月桂酸、十三烷酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸、十四烷酸、二十二烷酸、十五烷酸、亚油酸、反油酸、巴西烯酸、芥酸或油酸，其被比如具有1-6个碳原子的一至三元醇酯化，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇或它们的异构体、乙二醇或丙三醇。这些类型的脂肪酸酯的例子是市售的Miglyols、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸异丙酯、6-癸酸PEG酯、饱和脂肪醇的辛酸/癸酸酯、多乙氧基丙三醇三油酸酯、油酸乙酯、含蜡脂肪酸酯比如，人工鸭尾脂腺脂肪、椰子脂酸异丙酯、油酸油酯、油酸癸酯、乳酸乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、己二酸二异丙酯、特别是多元醇脂肪酸酯。同样适宜的是不同粘度的硅油或脂肪醇，比如异十三烷醇、2-辛基十二烷醇、十六烷基硬脂醇或油醇，脂肪酸，例如油酸。进一步地，可以使用植物油，比如蓖麻油、杏仁油、橄榄油、芝麻油、棉籽油、花生油或豆油。
适宜的溶剂、凝胶剂和增溶剂是水或与水混溶的溶剂。适宜的例子是乙醇或异丙醇、苄醇、2-辛基十二烷醇、聚乙二醇、也可以是邻苯二甲酸酯、己二酸酯、丙二醇、丙三醇、二-或三-丙二醇、蜡、甲基纤维素、溶纤剂、酯、吗啉、二噁烷、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、环己酮等。
可用的成膜剂是，比如可以溶解或在水和有机溶剂中部分膨胀的纤维素醚，例如，羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素或可溶淀粉。
同样地，凝胶剂和成膜剂的混合形式也是完全可能的。这种情况下使用的，特别是比如离子型大分子，例如羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸以及它们的盐，支链淀粉半乙醇酸钠、作为钠盐的藻酸或藻酸丙二醇酯、阿拉伯胶、黄原胶、瓜尔胶或角叉胶。
可使用的进一步的配制助剂是甘油、不同粘度的石蜡、三乙醇胺、胶原质、尿囊素、novantisolic acid。也可能有必要对制剂使用表面活性剂、乳化剂或湿润剂，例如十二烷基硫酸钠、脂族醇醚硫酸酯、N-十二烷基-β-亚氨基二丙酸二钠盐、多氧乙基化蓖麻油或油酸山梨醇酯、单硬脂酸山梨醇酯、多乙氧基醚(例如吐温)、十六醇、卵磷脂、单硬脂酸甘油酯、多氧化乙烯硬脂酸酯、烷基酚聚乙二醇醚、十六烷基三甲基氯化铵或一/二烷基聚乙二醇醚磷酸单乙醇胺盐。
制备所需制剂时，需要的时候，同样地也有必要加入用于稳定乳液的稳定剂，比如蒙脱土或胶态硅石；或防止活性物质被破坏的抗氧化剂，例如生育酚或丁基羟基苯甲醚；或防腐剂比如p-羟苯甲酸酯。
这些产品是在通常的灭菌或无菌条件下制造和分装到容器中并密封的。
应用实施例本发明化合物的下列代表物是通过举例的方式被提到的
本发明的化合物可用已知的合成方法制备，例如通过下列变化方法2-苯基-10，12，15，16-四羟基-8-甲氧基-11-甲基-9，14-二氧代-6，7，9，14-四氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮(5)将马杜拉羟基内酯与冰醋酸的5％的混合物与2摩尔当量的苯肼混合并煮沸回流30分钟。然后将反应混合物室温放置约12小时。抽滤，滤出结晶出来的红色固体，用冰醋酸洗涤，干燥。将粗产物在索格利特萃取器中用四氢呋喃(THF)萃取。冷却时，产品结晶析出，抽滤，滤出产品，干燥。收率约为理论量的大约83％。
mp350-353℃(分解)，MS(C32H22N2O8，M＝562)m/z＝563.0[M+H]+。
下列应用实施例是用类似方法制备的10，12，15，16-四羟基-8-甲氧基-11-甲基-9，14-二氧代-6，7，9，14-四氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮(1)mp＞360℃，MS(C26H18N2O8，M＝486)m/z＝487.2[M+H]+。
2-甲基-10，12，15，16-四羟基-8-甲氧基-11-甲基-9，14-二氧代-6，7，9，14-四氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮(2)mp＞350℃，MS(C27H20N2O8，M＝500)m/z＝501.1[M+H]+。
2-丙基-10，12，15，16-四羟基-8-甲氧基-11-甲基-9，14-二氧代-6，7，9，14-四氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮(3)mp350-351℃，MS(C29H24N2O8，M＝528)m/z＝529.1[M+H]+。
2-(2-羟乙基)-10，12，15，16-四羟基-8-甲氧基-11-甲基-9，14-二氧代-6，7，9，14-四氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮(4)mp＞300℃，MS(C28H22N2O9，M＝530)m/z＝531.1[M+H]+。
2-(2-乙酰氧基乙基)-10，12，15，16-四羟基-8-甲氧基-11-甲基-9，14-二氧代-6，7，9，14-四氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮(6)mp＞350℃，MS(C30H24N2O10，M＝572)m/z＝573.1[M+H]+。
2-(2-氨基乙基)-10，12，15，16-四羟基-8-甲氧基-11-甲基-9，14-二氧代-6，7，9，14-四氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮(8)mp＞350℃(分解)，MS(C28H25N3O8，M＝529)m/z＝530.1[M+H]+。
2-(2，2-二乙氧基乙基)-10，12，15，16-四羟基-8-甲氧基-11-甲基-9，14-二氧代-6，7，9，14-四氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮(11)mp285℃，MS(C32H31N2O10，M＝603)m/z＝604.1[M+H]+。
2-(2-咪唑基)-10，12，15，16-四羟基-8-甲氧基-11-甲基-9，14-二氧代-6，7，9，14-四氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮(15)mp＞350℃(分解)，MS(C29H20N4O8，M＝552)m/z＝553.1[M+H]+。
2-(2-吡啶基)-10，12，15，16-四羟基-8-甲氧基-11-甲基-9，14-二氧代-6，7，9，14-四氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮(16)mp＞350℃，MS(C31H21N3O8，M＝563)m/z＝564.1[M+H]+。
下列进一步的应用实施例是用去甲基马杜拉羟基内酯作起始原料同样地用类似于实施例(5)的方法制备的2-(2-吡啶基)-8，10，12，15，16-五羟基-11-甲基-9，14-二氧代-6，7，9，14-四氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮(9)
mp＞350℃，MS(C30H19N3O8，M＝549)m/z＝550.1[M+H]+。
2-苯基-8，10，12，15，16-五羟基-11-甲基-9，14-二氧代-6，7，9，14-四氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮(10)mp＞350℃，MS(C31H20N2O8，M＝548)m/z＝549.1[M+H]+。
制备demethyl马杜拉羟基内酯将40ml 35％的HBr溶于冰醋酸的溶液加到400mg(0.8mmol)马杜拉羟基内酯溶于50ml冰醋酸的溶液中，将混合物加热至沸腾，煮沸1小时。冷至室温后，将反应混合物蒸发至干。用THF萃取粗产物。得到280mg demethyl马杜拉羟基内酯。收率为理论量的75％。
mp＞350℃(分解)，MS(C25H16O10，M＝476)m/z＝477.3[M+H]+。
2-苯基-10，15，16-三羟基-8-甲氧基-12-甲氧基羰基氧基-11-甲基-9，14-二氧代-6，7，9，14-四氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮(7)将281.2mg(0.5mmol)2-苯基-10，12，15，16-四羟基-8-甲氧基-11-甲基-9，14-二氧代-6，7，9，14-四氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮(5)溶于2ml 2M氢氧化钠的溶液用5ml水稀释。将该溶液调至5℃，搅拌下，加入2ml氯甲酸甲酯。随后将该混合物于室温搅拌30分钟，然后用醋酸中和。吸滤，滤出沉淀的产物，得到260mg产品。收率为理论量的84％。
mp＞350℃，MS(C34H24N2O10，M＝620)m/z＝621.0[M+H]+。
2-苯基-10，12，15，16-四乙酰氧基-8-甲氧基-11-甲基-9，14-二氧代-6，7，9，14-四氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮(12)将醋酐和吡啶各0.5ml加到167mg(0.3mmol)2-苯基-10，12，15，16-四羟基-8-甲氧基-11-甲基-9，14-二氧代-6，7，9，14-四氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮(5)与5ml CH2Cl2的溶液中。加完1mg DMAP后，将混合物于室温搅拌1小时。为了后处理，将反应混合物用稀盐酸酸化，用CH2Cl2萃取水相。合并有机相，用MgSO4干燥并蒸发至干。得到180mg产物。收率为理论量的83％。
mp273℃，MS(C40H30N2O12，M＝730.7)m/z＝731.5[M+H]+。
2-苯基-12-烯丙基-10，15，16-三羟基-8-甲氧基-11-甲基-9，14-二氧代-6，7，9，14-四氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮(17)搅拌下，连续地将10ml水、10mg溴化四丁铵、120mg(3mmol)氢氧化钠细粉和0.26ml(2.8mmol)烯丙基溴加到1g(1.78mmol)2-苯基-10，12，15，16-四羟基-8-甲氧基-11-甲基-9，14-二氧代-6，7，9，14-四氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮(5)溶于10ml CH2Cl2的溶液中，各种物料加入时间隔数分钟。室温24小时后，将混合物用40ml水稀释，用10％HCl溶液酸化。分出有机相，水相用30ml CH2Cl2萃取两次。合并有机相，用MgSO4干燥，不需要预先浓缩，通过20g硅胶60过滤，用CH2Cl2洗脱至无色，蒸发至干。得到370mg产物。收率为理论量的35％。
mp163℃，MS(C35H26N2O8，M＝602)m/z＝603.0[M+H]+。
2-苯基-10，12，15，16-四羟基-8-甲氧基-11-甲基-9，14-二氧代-9，14-二氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮(13)将一勺尖过氧化二苯甲酰加到1.1g(1.5mmol)2-苯基-10，12，15，16-四乙酰氧基-8-甲氧基-11-甲基-9，14-二氧代-6，7，9，14-四氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮(12)和0.53g(3mmol)N-溴代琥珀酰亚胺与120ml四氯甲烷和30ml 1，1，2，2-四氯乙烷的混合物中，略微回流下，将混合物搅拌直到转化完全。冷却后，将反应混合物用Na2S2O3溶液和水洗涤。将用Na2SO4干燥过的溶液蒸发至干。将残留物溶于20ml四氢呋喃，用冰冷却下，加入2.1ml sym-可力丁。将反应混合物搅拌过夜，然后倾入冰冷的稀柠檬酸溶液中。用二氯甲烷萃取产物，合并有机相，用Na2SO4干燥，浓缩。
在冰冷却下，将得到的中间体2-苯基-10，12，15，16-四乙酰氧基-8-甲氧基-11-甲基-9，14-二氧代-9，14-二氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮112mg(0.15mmol)溶于2.3ml N，N-二甲基甲酰胺的溶液与2.3ml 1M的氢氧化钾溶液混合，并在室温下搅拌2小时。用柠檬酸水溶液酸化，产物沉淀析出，为红色固体(78mg)。收率为理论量的93％。
MS(C23H20N2O8，M＝560)m/z＝561[M+H]+。
2-苯基-6，7，10，12，15，16-六羟基-8-甲氧基-11-甲基-9，14-二氧代-6，7，9，14-四氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮(14)将222mg(0.88mmol)四氧化锇(VIII)和142μl(1.77mmol)吡啶加到516mg(0.71mmol)2-苯基-10，12，15，16-四乙酰氧基-8-甲氧基-11-甲基-9，14-二氧代-9，14-二氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮溶于7ml二噁烷的溶液中。然后将混合物室温搅拌6天。为了分解锇酸酯，将混合物用乙醇稀释，加完NaHSO3水溶液后，剧烈搅拌1小时。用CH2Cl2萃取产物，合并有机相，用水洗涤，用Na2SO4干燥。将粗产物吸附到硅胶上，用5∶1的甲苯/甲醇洗脱。得到371mg深黄色固体。
在冰冷却下，将得到的中间体2-苯基-10，12，15，16-四乙酰氧基-6，7-二羟基-8-甲氧基-11-甲基-9，14-二氧代-9，14-二氢-并四苯并[1，2-g]酞嗪-1-酮100mg(0.13mmol)溶于2ml N，N-二甲基甲酰胺的溶液与2ml 1M的氢氧化钾溶液混合，室温搅拌2小时。用柠檬酸水溶液酸化，产物沉淀析出，为红色固体(60 mg)。收率为理论量的77％。
MS(C32H22N2O10，M＝594)m/z＝595[M+H]+。
为了测定本发明化合物对所述细胞因子的作用，对抑制T细胞释放IL-2、IL-4和IL-5进行了体外研究。抑制Jurkat细胞释放IL-2方法将Jurkat细胞(克隆E6-1，批号F-12871，由ATCC，Rockville，MD提供)在微量滴定板中以每孔50μl、大约100,000个细胞进行接种，并在恒温箱中预先恒温(5％CO2/37℃/100％湿度)。所用培养基是带有HEPES/10％FKS/2mM谷氨酰胺/100U/ml青霉素/100mg/ml链霉素和50μM巯基乙醇的RPMI-1640。3小时后，使用各种浓度的待测物质(每孔100μl)。为了测定自发值和最大值，各种情况下，只使用培养基/O.2％DMSO。加入物质和培养30分钟后，各种情况下，每一小孔中都用25μl lonomycin(最终浓度1μM，Sigma I-0634)和肉豆蔻酸乙酸佛波酯(phorbol myristate acetate)(PMA，最终浓度25ng/ml，Sigma P-8139)进行激发。自发值使用50μl培养基代替lonomycin/PMA。然后培养过夜。在IL-2 ELISA中(Pharmingen，俘获mab18951 D，测定mab20672 D)测定未稀释的上清夜。用分对数-对数坐标图分析IC50测定值。
抑制D10.G4.1细胞(D10)释放IL-4方法将D10细胞在带有Rat StimTM(Collaborative Biomedical公司的产品，Bedford MA)的培养基(RPMI-1640与HEPES/10％FKS/2mM谷氨酰胺/100U/ml青霉素/100mg/ml链霉素和50μm巯基乙醇)中保温和培养3天后，离心，用不含Rat StimTM的培养基洗涤，在微量滴定板中以每孔40,000至60,000个细胞的浓度进行接种并于37℃/5％CO2/100％湿度的条件下培养3.5小时。然后各种情况下每孔50μl使用各种浓度的待测物质。最大值和自发值测定时各自使用50μl培养基/0.4％DMSO。再培养30分钟后，各种情况下，每孔用50μl抗-CD3抗体(145-2C11，Cedarlane Laboratories有限公司，Hornby/安大略省)进行激发(最终稀释度1∶100)。自发值测定使用50μl培养基。培养过夜后，在IL-4 ELISA中测定上清液(Pharmingen俘获mab18031 D；测定mab18042 D)。用分对数-对数坐标图分析IC50测定值。
抑制D10.G 4.1细胞(D10)释放IL-5方法将D10细胞在带有Rat StimTM(Collaborative BiomedicalProducts，Bedford MA)的培养基(RPMI-1640与HEPES/10％FKS/2mM谷氨酰胺/100U/ml青霉素/100mg/ml链霉素和50μM巯基乙醇)保温和培养3天后，离心，用不含Rat StimTM的培养基洗涤，在微量滴定板中以每孔40,000至60,000个细胞的浓度进行接种并于37℃/5％CO2/100％湿度的条件下培养3.5小时。然后各种情况下每孔50μl使用各种浓度的待测物质。测定最大值和自发值各使用50μl培养基/0.4％DMSO。再培养30分钟后，各种情况下，每孔用50μl抗-CD3抗体(145-2C1l，Cedarlane Laboratories有限公司，Hornby/安大略省)进行激发(最终稀释度1∶100)。测定自发值使用50μl培养基。培养过夜后，在IL-5 ELISA中测定上清液(Pharmingen俘获mab18051D；测定mab18062D)。用分对数-对数坐标图分析IC50测定值。
已发现的抑制细胞因子IL-2、IL-4和IL-5的重要性可通过体内试验来证明，例如研究本发明化合物对哮喘病人晚期反应的作用。通过吸入卵白蛋白使豚鼠剧烈致敏24小时后对晚期嗜酸性粒细胞的抑制用Dunkin-Hartley豚鼠进行体内试验，测定化合物对嗜酸性粒细胞肺渗透的抑制作用，这些豚鼠已经被卵白蛋白剧烈地敏化。敏化作用是通过两次皮下注射10μg卵白蛋白与1mg氢氧化铝溶于0.5ml生理盐水为佐药的悬浮液进行的。两次注射的时间间隔为14天。第二次注射7天后，将准备暴露于卵白蛋白气雾中的对照组的动物预先用顺丁烯二酸美吡胺(10mg/kg i.p.)进行处理，以防止它们因过敏反应而死。30分钟后，将这些动物放在塑料箱中，在卵白蛋白气雾(0.5mg/ml)中暴露30秒，卵白蛋白气雾是用空气压缩(19.6kPa)喷雾器喷出的。对照组的动物被暴露于生理盐水气雾中。在卵白蛋白气雾中暴露24小时后(免疫性试验)，将这些动物用过量的氨基甲酸乙酯麻醉(i.p.每千克体重1.5g)，用2×5ml生理盐水进行支气管肺胞洗胃。收集洗涤的流体，在转速300rpm下离心10分钟，然后将细胞片状沉淀物重新悬浮于1ml生理盐水中。用Becton-Dickinson嗜酸性粒细胞试验仪器(N.5877)将嗜酸性粒细胞染色，并用Neubauer室计数。每次试验包括两个对照组(暴露于生理盐水气雾和暴露于卵白蛋白溶液气雾)。
过敏原免疫性试验前2小时，将试验物质与10％聚乙二醇300和0.5％5-羟乙基纤维素的悬浮液腹膜内注射或口服给药。将对照组用对应于试验物质的赋形剂进行处理。各对照组和试验组的动物数为3-10只。结果列于下表表
A＝卵白蛋白免疫性试验和赋形剂对照组的嗜酸性粒细胞数。B＝试验物质处理组卵白蛋白免疫性试验的嗜酸性粒细胞数。C＝0.9％NaCl免疫性试验和赋形剂对照组的嗜酸性粒细胞数。X＝平均值 s＝标准误差本发明化合物因此特别适用于制备治疗与嗜酸性粒细胞作用相关的疾病的药物。
权利要求
1.式4的化合物 其中R1是氢，以及直链或支链的、任选地被下列基团一次或多次取代的C1-12-烷基-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR7、-NO2、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R7、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、-SOR6、-SO2R8、-OSO2C1-6烷基、-OSO2C6-14芳基、-(CS)R7、-O(CO)R7、-(CO)R9、具有3-14个环成员的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环、具有5-15个环成员和1-6个杂原子、优选N、O和S的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环，其中C6-14芳基和所述的碳环和杂环取代基又可以任选地被R10一次或多次取代；单-或多不饱和的、直链或支链的、任选地被下列基团一次或多次取代的C1-12-链烯基-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR7、-NO2、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R7、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、-SOR8、-SO2R8、-OSO2C1-6烷基、-OSO2C6-14芳基、-(CS)R7、-O(CO)R7、-(CO)R9、具有3-14个环成员的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环、具有5-15个环成员和1-6个杂原子、优选N、O和S的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环，其中C6-14芳基和所述的碳环和杂环取代基又可以任选地被R10一次或多次取代；具有3-14个环成员的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环，其任选地被下列基团一次或多次取代-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR7、-NO2、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R7、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、-SOR8、-SO2R8、-OSO2C1-6烷基、-OSO2C6-14芳基、-(CS)R7、-O(CO)R7、-(CO)R9，其中C6-14芳基又可以任选地被R10一次或多次取代；具有5-15个环成员和1-6个杂原子、优选N、O和S的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和杂环，其任选地被下列基团一次或多次取代-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR7、-NO2、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R7、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、-SOR8、-SO2R8、-OSO2C1-6烷基、-OSO2C6-14芳基、-(CS)R7、-O(CO)R7、-(CO)R8，其中C6-14芳基又可以任选地被R10一次或多次取代；具有3-10个环成员、杂环系统含有1-6个杂原子、优选N、O和S的碳环或杂环状的饱和的或单或多不饱和的螺环，其任选地被下列基团一次或多次取代-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR7、-NO2、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R7、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、-SOR8、-SO2R8、-OSO2C1-6烷基、-OSO2C6-14芳基、-(CS)R7、-O(CO)R7、-(CO)R8，其中C6-14芳基又可以任选地被R10一次或多次取代；R2、R3、R4、R5、R6可以相同或不同，并且代表氢，以及直链或支链的、任选地被下列基团一次或多次取代的C1-6-烷基-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR7、-NO2、-CN、-(CO)R8、-(CS)R7、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R7、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、-SOR8、-SO2R8；任选地被下列基团一次或多次取代的CO-C1-6烷基-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR7、-NO2、-CN、-(CO)R8-(CS)R7、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R7、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、-SOR8、-SO2R8；任选地被下列基团一次或多次取代的COO-C1-6烷基-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR7、-NO2、-CN、-(CO)R8、-(CS)R7、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R7、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、-SOR8、-SO2R8；R7是C1-6-烷基、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14芳基、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6--烷基)2、-NHC6-14-芳基、-N(C6-14-芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、或具有3-14个环成员的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环、或具有5-15个环成员和1-6个杂原子、优选N、O和S的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环；R8是-H、-C1-6-烷基、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14-芳基、-N(C6-14-芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR7、-OH、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、或具有3-14个环成员的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环、或具有5-15个环成员和1-6个杂原子、优选N、O和S的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环；R9是-H、-C1-6-烷基、或具有3-14个环成员的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环、或具有5-15个环成员和1-6个杂原子、优选N、O和S的单-、双-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环；R10是-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR7、-NO2、-CN、-(CO)R8、-(CS)R7、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R7、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、-SOR8、-SO2R8，和A，B可以是-CH2-、-CH(OH)或A+B可以是-CH＝CH-；以上化合物是新的，但除了下列式4化合物，其中R2、R3、R4、R6＝-H，R6＝-CH3，A、B＝-CH2-，X＝O，和R1＝-H、-CH3、-(CH2)2CH3、-(CH2)2OH、-CH2CHO、-苯基；以及下列式4化合物，其中R1＝-苯基，R6＝-CH3、A、B＝-CH2-，X＝O和a)R2＝R3＝R4＝R5＝-CH3，b)R2＝R3＝R4＝R5＝-COCH3，c)R2＝R3＝-H，和R4＝R5＝-CH3，d)R2＝R3＝-COCH3和R4＝R5＝-CH3，e)R2＝R4＝R5＝-CH3，和R3＝-H，f)R2＝R4＝R5＝-CH3，和R3＝-COCH3，g)R2＝R3＝R5＝-H，和R4＝-COCH3，h)R2＝R3＝R5＝-H，和R4＝-COOCH3，i)R2＝R3＝R5＝-H，和R4＝-CH2COOH。
2.权利要求1的已知的和新的式4化合物的生理可接受的盐，其特征是通过将碱用无机酸或有机酸中和、或通过将酸用无机碱或有机碱中和、或将叔胺季铵化生成季铵盐得到。
3.式4化合物及其盐作为治疗活性成分用于制备治疗由细胞因子IL-2、IL-4和IL-5介导的疾病的药物的应用。
4.根据权利要求3的式4化合物及其盐作为治疗活性成分用于制备治疗与嗜酸性粒细胞作用相关的疾病的药物的特别优选的应用。
5.除了常规的生理上可接受的载体和/或稀释剂或助剂以外还含有一种或多种权利要求3中的化合物的药物。
6.制备权利要求5的药物的方法，特征在于，将一种或多种权利要求3中的化合物与常规的生理可接受的载体和/或稀释剂或其它助剂一起加工成药物制剂或一起制成可用于治疗的形式。
7.权利要求3中的式4化合物和/或权利要求5和6的药物制剂单独地或相互结合地或与载体和/或稀释剂或其它助剂结合地使用的用途。
全文摘要
本发明涉及马杜拉酞嗪衍生物用于前炎症细胞因子抑制剂的应用。式(4)的马杜拉酞嗪衍生物能够抑制细胞因子白细胞介素－2、白细胞介素－4和白细胞介素－5的作用,并且适用于制备药物。
文档编号A61P11/06GK1347408SQ00806298
公开日2002年5月1日 申请日期2000年4月11日 优先权日1999年4月17日
发明者R·德拉黑姆, T·克伦巴赫, L·海尼施, E·勒默, N·赫夫根, H·波佩, P·于藤, W·哈尔斯, W·维尔纳, U·格雷菲 申请人:德雷斯顿药品工厂有限公司