专利名称：鉴定用于肝病处置的治疗性化合物的方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴定治疗性化合物的方法，具体涉及鉴定用于肝病处置的治疗性化合物的方法。
背景肝病是西方国家发病率的一个主要原因。例如丙型肝炎通过血液污染传播，现在的许多病例是在普遍血液检查之前由输血感染。大多新病例与吸毒相关。大约80％感染者发生慢性肝炎(20％肝硬化)，大约10％最终发生肝细胞瘤。直到最近，唯一有效的治疗为昂贵的干扰素，通过非肠道给药，具有许多副作用，只有有限的价值。
酒精摄取可导致肝病。它影响正常免疫功能，尤其是细胞介导的免疫1-3。在酒精相关疾病的进展中T细胞起了重要作用4-6。在人和动物中进行的酒精性肝病研究表明，T细胞在体外响应有丝分裂原如伴刀豆球蛋白A(ConA)或植物凝血素(PHA)的增殖发生了很大改变。酒精喂养的大鼠和小鼠中，血液T细胞对ConA刺激的增殖反应降低，而对PHA的反应升高，效应细胞类型为CD4+T辅助细胞2，3，8，10。这提示酒精暴露后T细胞活化水平10、效应细胞表型3和细胞因子分泌模式11都可能在酒精相关的肝病中起作用。与蔗糖或等热的蔗糖(isocaloricsucrose)喂养的大鼠相比，酒精喂养的大鼠注射ConA后发生更严重的肝坏死，门静脉和中央静脉区CD4+和CD8+T细胞浸润。在这些大鼠中，观察到更多数量与活化的肝脏相关的CD4+T细胞，它们在培养中分泌高水平的TNF-α和IL-64-6。这些酒精喂养的大鼠已作为基本研究工具，用于研究T细胞在肝损伤发作中的作用。
虽然假设酒精暴露后的T细胞活化水平、效应细胞类型和细胞因子分泌模式均可能在酒精相关肝病中起作用，但必须注意这类疾病在本质上是复杂的。因为许多其它尚未阐明的因素也可能与这种疾病有关。这样，需要进一步的研究来阐明参与疾病起始和进展的精确的细胞和生化机制及相互作用。此外，必须注意，参与酒精诱发性肝炎的精确细胞和生化机制及相互作用可能与参与病原体介导性肝炎(例如丙型肝炎和自身免疫性肝病)的精确机制不同。
许多肝病的处置显然不令人满意，迫切需要改良的治疗方法。相应地也需要合适的方法和特别是动物模型来预测潜在有用的化合物的治疗价值。
本发明的目的是提供动物模型、方法和治疗性化合物，它们可能克服或实质性地改善现有技术的至少一些缺陷，或提供有用的替代物。
还发现中草药CH-100对处置酒精诱发的肝炎特别有用。
根据第一方面，本发明提供了鉴定对哺乳动物肝病预防性处置或治疗性处置有用的化合物的方法，包括(a)给哺乳动物施用一种或多种已知诱生肝病的药剂；(b)给哺乳动物施用潜在治疗性化合物；(c)与预先确定的标准比较该化合物对肝病发展的作用。
根据第二方面，本发明提供了鉴定对哺乳动物肝病预防性处置或治疗性处置有用的化合物的方法，包括(a)给哺乳动物施用酒精；(b)给哺乳动物施用潜在治疗性化合物；(c)给哺乳动物施用已知诱发肝病的药剂；(d)与预先确定的标准比较该化合物对肝病发展的作用。
根据第三方面，本发明提供了鉴定对预防性处置或治疗性处置哺乳动物T细胞介导的肝损伤有用的化合物的方法，包括(a)给哺乳动物施用一种或多种已知诱发T细胞介导的肝损伤的药剂；
(b)给哺乳动物施用潜在治疗性化合物；(c)与预先确定的标准比较该化合物对肝损伤发展的作用。
根据第四方面，本发明提供了鉴定对预防性处置或治疗性处置哺乳动物T细胞介导的肝损伤有用的化合物的方法，包括(a)给哺乳动物施用酒精；(b)给哺乳动物施用潜在治疗性化合物；(c)给哺乳动物施用T细胞激活剂；和(d)与预先确定的标准比较该化合物对肝病发展的作用。
根据第五方面，本发明提供了鉴定对预防性处置或治疗性处置哺乳动物T细胞介导的肝损伤有用的化合物的方法，包括(a)给哺乳动物供体施用酒精；(b)给哺乳动物供体施用T细胞激活剂；(c)给哺乳动物受体施用潜在治疗性化合物；(d)从哺乳动物供体分离肝内T细胞并输入给受体；和(e)与预先确定的标准比较该化合物对哺乳动物受体中T细胞介导的肝损伤发展的作用。
根据第六方面，本发明提供了鉴定对预防性处置或治疗性处置哺乳动物T细胞介导的肝损伤有用的化合物的方法，包括(a)给哺乳动物供体施用酒精；(b)给哺乳动物供体施用T细胞激活剂；(c)从哺乳动物供体分离肝内T细胞并输入给受体；(d)给哺乳动物受体施用潜在治疗性化合物；和(e)与预先确定的标准比较该化合物对T细胞介导的肝损伤发展的作用。
如果需要，哺乳动物受体也可在转移了供体T细胞后给予T细胞激活剂。
优选地，在此所指的哺乳动物为啮齿类，最优选啮齿类为大鼠。然而，本领域普通技术人员也会理解，可以在本发明中使用各种其它哺乳动物。
优选地，通过T淋巴细胞迁移到肝脏中诱发肝病。更优选地，肝病为酒精性肝炎。
优选地，T淋巴细胞分泌TNFα。
在此所指的已知诱发肝病的药剂优选地包括酒精和辅因子。优选地，上述辅因子为T细胞激活剂。在首先特异性给予酒精的方法中，随后给予的已知诱发肝病的上述药剂为T细胞激活剂。
本发明使用酒精的方法中，酒精优选以乙醇水溶液形式给药。优选地，该溶液含有2-40％乙醇(v/v)。最优选该溶液含有5-40％乙醇(v/v)。优选地，在动物足以适应乙醇的时间内用浓度不断增加的乙醇喂养哺乳动物。优选地，在适应期内，酒精浓度为从大约5％乙醇水溶液(v/v)到大约40％乙醇水溶液(v/v)，优选适应期大约为7周。
这里所指的辅因子优选为T细胞激活剂。优选地，这里所指的T细胞激活剂为伴刀豆球蛋白A(ConA)。然而，显然对技术人员来说其它化合物也可能有用，例如内毒素。
优选地，给予单剂量的ConA。优选单剂量为1-40mg/kg体重。更优选单剂量为5-30mg/kg，最优选单剂量为20mg/kg。优选地，ConA溶解在磷酸缓冲盐水中。优选地ConA通过注射给药。
优选地，这里所指的治疗性化合物设想用来处置酒精诱发的肝炎或病原体介导的肝病。病原体介导的肝病指病毒或细菌感染等导致的肝病，如乙型肝炎或丙型肝炎。然而，显然技术人员也考虑其它类型的肝病，包括自身免疫性肝炎。
根据第七方面，本发明提供哺乳动物，用于通过使用这里描述的任何一种方法来鉴定对预防性处置或治疗性处置肝病有用的化合物。
根据第八方面，本发明提供根据任何上述方面鉴定的用于处置肝病的治疗性化合物或治疗性组合物。
优选地该化合物含有至少一种上述对处置酒精诱发的肝炎或病原体介导的肝病有用的活性成分。然而对于本领域技术人员，显然也考虑处置其它类型的肝病。
根据本发明的第十方面，提供CH-100在处置肝病，优选酒精诱发的肝炎中的用途。
CH-100可通过任一以下途径给药口服、系统性(如经皮、鼻内或栓剂)或非肠道(如肌内、静脉内或皮下)给药。然而优选地给药方式为口服，使用方便的可根据患病程度调整的日剂量用药方案。含有CH-100和任何可药用赋形剂等的组合物可采用以下形式，例如片剂、丸剂、胶囊剂、半固体、粉剂、持续释放制剂、溶液、悬液、酏剂(elixers)、气雾剂或任何其它合适组合物。CH-100也可以与其它可能对人体有益的物质的组合形式出现。
优选地，CH-100根据实施例中描述的用药方案通过口服给予有此需要的哺乳动物。更优选地，哺乳动物，优选人，可使用以下用药方案进行处置每天口服给药五个剂量的CH-100(含有大约340mg的活性草药)，持续六个月。
然而，本发明领域普通技术人员会理解，给予哺乳动物的CH-100剂量以及用药方案可视具体情况而改变。可能需要考虑的因素包括如下例如对CH-100的个人喜好或耐受，特定个体的疾病严重性，疾病进展阶段，给药是否仅仅为了预防，以及个体的总体健康状况。此外，可调整用药方案以获得最优治疗反应。例如，每周或每月或以其它合适的时间间隔给予几个分开的剂量，或根据情况的紧急性按比例减少或增加剂量。此外，可通过本领域熟知的肝功能和血液学测试来评价情况的紧急性。
在本发明中，术语“乙醇适应”包括诱导接受通常不为动物所接受的酒精溶液浓度，如对于大鼠大约40％酒精(v/v)。
在此使用的可药用赋形剂指可用于制备总体上安全、无毒并且在生物学和其它方面无害的药物组合物的赋型剂，包括为兽医使用和人体药物使用所接受的赋型剂。说明书和权利要求书中使用的可药用赋型剂包括一种或多于一种这类赋型剂。
这里所用的术语“预先确定的标准”指用与实验动物基本相同的条件(如环境、热量摄入等)处理的对照动物，但是不给予潜在治疗性药物。优选地，使用多个对照哺乳动物，每个动物给予已知诱发肝病的一种或多种药剂的组合，或没有这类药剂。在这种情况下，将使用合适的相应条件处理的多个实验动物，如以下实施例所述。使用这种策略目的是使可能产生的误导性实验结果减至最低。为了进一步减少实验假象，本发明领域普通技术人员会理解，优选对照哺乳动物和实验哺乳动物同时进行处理的实验程序。然而也考虑使用获自如下对照哺乳动物研究的数据，该研究在根据本发明鉴定潜在治疗性化合物的方法起始之前或之后进行。
此外在此所指的“处置”应在最宽的范围内加以考虑。术语“处置”并不一定指处置一个个体直至完全恢复。因此，“处置”包括症状或特定疾病严重性的减轻，或者防止或降低发展某种特定疾病的危险性，因而也包括预防性措施。
实施例12-草药对血浆转氨酶水平的影响注射ConA后，早在12小时就可检测到血浆转氨酶水平(ALT)的显著提高，而在安慰剂大鼠中峰值出现在24小时(图2)。数据表明在喂酒精的大鼠中，血浆ALT水平比在对照动物中的要高(p＜0.01)，但在2％蔗糖和等热蔗糖大鼠间没有显著性差异。相比之下，在给予草药处理的大鼠中ALT水平要显著低(图2)(p＜0.01)。
实施例13-草药对血清TNFα水平的影响所有没有给予草药但给予了ConA的动物注射ConA 4小时后，可观察到血清TNFα水平的剧烈增长。在24小时后逐渐降至基线水平(图～3)。这些数据表明，注射一针ConA后，检测到血清TNFα显著增加的时间比血浆ALT水平的增加要早。与两组蔗糖对照组相比，酒精喂养大鼠中的TNFα要高，但在两个对照组之间没有显著性差异(图3)。有趣的是给予ConA后，草药处置的大鼠中TNFα水平显著低于安慰剂处理的大鼠(图3)。
实施例14-肝脏相关CD4+T细胞培养物中的TNFα分泌如图4所示，安慰剂大鼠注射ConA 24小时后，ConA刺激的肝脏相关CD4+T细胞TNFα的分泌显著增加。安慰剂大鼠注射ConA 24小时后，肝脏相关CD4+T细胞TNFα的分泌显著增加。在接受了ConA而没有用草药处理的乙醇暴露大鼠中，与ConA一起培养的肝脏相关CD4+T细胞中TNFα的产量显著增高。相比之下，ConA注射后，草药处理的大鼠CD4+T淋巴细胞分泌的TNFα水平显著低于ConA注射后的安慰剂大鼠。
实施例15-肝脏病理学和免疫组织学在光学显微镜下，对以下指标记0-4分坏死、分别对1、2、3区的细胞浸润，以及脂肪的变化，结果总结于表1。与两个对照组相比，在给予ConA后不用草药处理的酒精喂养大鼠中，肝病理改变更显著，其肝细胞显著坏死，伴随细胞浸润。这主要由门管区中、中央静脉周围和肝小叶中的单个核细胞和嗜中性粒细胞组成。在坏死区周围可看到带有炎症细胞的病灶和小叶坏死。与安慰剂大鼠相比，在草药处理的大鼠中病理改变显著降低。
小鼠抗CD4+单克隆抗体的免疫染色显示，不用草药处理的酒精喂养大鼠注射ConA 24小时后，在门管区和中央静脉区有比两个对照组大鼠更多的CD4+T细胞。然而，在草药处理后，在酒精喂养的大鼠和两个对照组大鼠中鉴定到较少的CD4+T细胞。
表1
表1，喂CH 100或安慰剂并如表所示处理的动物的肝脏组织学结果。
实施例16-避免酒精对目的化合物的干扰动物中酒精的存在可能干扰某些化合物的作用，否则该化合物在肝病处置中提供有益作用。因上述模型依赖于T细胞向肝脏迁移并在该处诱导损伤，所以它可用于测试这种化合物。供体大鼠用酒精和上述的T细胞激活剂处理。如Cao等(该文献在此引入本文作为参考)所描述15，取出肝内T细胞并注入受体大鼠。受体大鼠可在注入供体细胞之前用目的化合物“致敏”或接受细胞并随后用该化合物处理。以描述的方法进行分析。结果，减少了给予受体大鼠酒精的需要，并避免了酒精和目的化合物之间的干扰。
草药CH 100的组成
为了让读者能不需过多的实验来实施本发明，在此参照具体实施例描述了本发明。然而，本领域普通技术人员容易明白，许多成分和参数可以有一定程度的改变或修饰而不脱离本发明的范围，本发明可能具体表现为许多其它形式。而且，提供了题目、标题等以帮助读者理解本文件，这些不应当用来限制本发明的范围。
最后，在整个说明书和后面的权利要求书中，除非有其它要求，术语“包括”及“包含”，应被理解为指包括所述的整体或步骤或一组整体或步骤，但不排除任何其它整体或步骤或一组整体或步骤。
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15.Cao Q，Batey R，Pang G和clancy R(1991)乙醇修饰的T细胞激活介导给予了ConA的大鼠的肝损伤。(印刷中)
权利要求
1.一种鉴定对哺乳动物肝病预防性处置或治疗性处置有用的化合物的方法，包括(a)给哺乳动物施用一种或多种已知诱发肝病的药剂；(b)给哺乳动物施用潜在治疗性化合物；(c)与预先确定的标准比较该化合物对肝病发展的作用。
2.根据权利要求1的方法，其中一种或多种已知诱发肝病的药剂包括酒精和辅因子。
3.根据权利要求2的方法，其中辅因子是T细胞激活剂。
4.一种鉴定对哺乳动物肝病预防性处置或治疗性处置有用的化合物的方法，包括(a)给哺乳动物施用酒精；(b)给哺乳动物施用潜在治疗性化合物；(c)给哺乳动物施用已知诱发肝病的药剂；和(d)与预先确定的标准比较该化合物对肝病发展的作用。
5.根据权利要求4的方法，其中已知诱发肝病的药剂是T细胞激活剂。
6.根据权利要求5的方法，其中T细胞激活剂是伴刀豆球蛋白A。
7.一种鉴定对哺乳动物T细胞介导肝损伤的预防性处置或治疗性处置有用的化合物的方法，包括(a)给哺乳动物施用一种或多种已知诱导T细胞介导肝损伤的药剂；(b)给哺乳动物施用潜在治疗性化合物；(c)与预先确定的标准比较该化合物对肝损伤发展的作用。
8.根据权利要求7的方法，其中一种或多种已知诱导肝损伤的物质包括酒精和T细胞激活剂。
9.根据权利要求8的方法，其中T细胞激活剂是伴刀豆球蛋白A。
10.一种鉴定对哺乳动物T细胞介导肝损伤的预防性处置或治疗性处置有用的化合物的方法，包括(a)给哺乳动物施用酒精；(b)给哺乳动物施用潜在治疗性化合物；(c)给哺乳动物施用T细胞激活剂；和(d)与预先确定的标准比较该化合物对肝病发展的作用。
11.根据权利要求10的方法，其中T细胞激活剂是伴刀豆球蛋白A。
12.一种鉴定在哺乳动物T细胞介导的肝损伤的预防性处置或治疗性处置中有用的化合物的方法，包括(a)给哺乳动物供体施用酒精；(b)给哺乳动物供体施用T细胞激活剂；(c)给哺乳动物受体施用潜在治疗性化合物；(d)从哺乳动物供体分离肝内T细胞并输入受体；和(e)与预先确定的标准比较该化合物对哺乳动物受体中T细胞介导肝损伤发展的作用。
13.根据权利要求12的方法，其中T细胞激活剂是伴刀豆球蛋白A。
14.一种鉴定对哺乳动物T细胞介导肝损伤的预防性处置或治疗性处置有用的化合物的方法，包括(a)给哺乳动物供体施用酒精；(b)给哺乳动物供体施用T细胞激活剂；(c)从哺乳动物供体分离肝内T细胞并输入受体；(d)给哺乳动物受体施用潜在治疗性化合物；和(e)与预先确定的标准比较该化合物对T细胞介导肝损伤发展的作用。
15.根据权利要求14的方法，其中哺乳动物受体在从供体转移T细胞后还给予T细胞激活剂。
16.根据权利要求14或15的方法，其中T细胞激活剂是伴刀豆球蛋白A。
17.根据权利要求2-6和8-15之任意一项的方法，其中酒精以乙醇水溶液的形式给药。
18.根据权利要求17的方法，其中该溶液含有2-40％的乙醇(v/v)，优选5-40％的乙醇(v/v)。
19.根据权利要求17的方法，其中在足以适应乙醇的时间内给哺乳动物饲喂浓度增加的乙醇。
20.根据权利要求19的方法，其中在足以适应乙醇的时间内酒精浓度范围是从大约5％乙醇水溶液(v/v)到约40％乙醇水溶液(v/v)。
21.根据权利要求19或20的方法，其中足以适应乙醇的时间为大约7周。
22.根据权利要求2、6、9、11、13或16之任意一项的方法，其中伴刀豆球蛋白A以1-40mg/kg体重的单剂量给药。
23.根据权利要求22的方法，其中单剂量为5-30mg/kg，优选20mg/kg。
24.用于采用权利要求1-23之任意一项的方法鉴定对肝病预防性处置或治疗性处置有用的化合物的哺乳动物。
25.通过权利要求1-23之任一项的方法鉴定的对肝病处置有用的治疗性化合物或组合物。
26.根据权利要求25的治疗性化合物，其中该化合物含有至少一种对肝病处置有用的活性成分，该肝病选自酒精诱发的肝炎；病原体介导的肝炎；和自身免疫性肝炎。
27.CH-100在处置肝病，优选酒精诱发的肝炎中的用途。
28.CH-100在制造用于处置肝病，优选酒精诱发的肝炎的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及鉴定用于处置肝病(优选酒精诱发的肝炎)的潜在治疗性化合物的方法。此外描述了在这类方法中哺乳动物的用途,用上述方法鉴定的治疗性化合物和中草药CH－100在治疗肝病(优选酒精诱发的肝病)中的用途。
文档编号A61K45/00GK1355705SQ00808957
公开日2002年6月26日 申请日期2000年5月15日 优先权日1999年5月14日
发明者R·克兰西, R·贝蒂, G·潘 申请人:纽卡斯尔大学研究协会有限公司