专利名称：抗冻/融损害的脂质体组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种脂质体组合物，具有改进的在冷冻和随后的融化之后，防护发生微囊聚集、微囊融合和包容物的损失。
有关申请的交叉引用本文引用于1999年7月16日向美国专利与商标局提交的美国临时专利申请No.60/144,380的完整公开内容，发明名称为“脂质体组合物的低温防护”。这些申请一般是申请人自有的。
背景技术：
脂质体是用于各种目的的密封脂质微囊。确切地说，通过脂质体的全身给药，脂质体可以用来运送治疗剂到达靶部位或细胞。已经证实脂质体特别可用于缓冲药物毒性和改变某些治疗化合物的药动学参数，例如阿霉素和两性霉素B。结合有这些化合物的产品是市售的。
药物脂质体制剂的稳定性和有效贮存是脂质体产品的重要方面。具体来说，重要的是脂质体制剂在适当条件下长期贮存而不发生包封的药物的不当损失或脂质体大小的改变。不过，有种担心是当脂质体被脱水时或者冷冻随后融化时，可能发生微囊融合和/或包容物的渗漏。
保护微囊在脱水和冷冻期间完整的通常方法是在脂质体制剂中包括一种低温防护剂，例如糖(Harrigan等《脂质的化学与物理学》52139-149(1990))。低温防护剂保持脂质的完整，防止微囊融合和微囊内容物的损失。
例如，美国专利No.4,927,571涉及从冻干形式再生的、含有阿霉素的脂质体组合物，它包括1％至10％的一种低温防护剂，例如海藻糖或乳糖。
美国专利No.4,880,635涉及通过在糖的存在下干燥脂质体而制备的脱水脂质体组合物，其中的糖存在于脂质体双分子层膜的内部和外部表面。类似地，美国专利No.5,077,056涉及脱水脂质体组合物，它优选地在脂质体表面的内部和外部包括防护性糖。
其他脂质体制剂例如DOXIL，这是一种含有阿霉素的脂质体制剂悬液，其中脂质体不被脱水用于后面的再生，而是在贮存期间留在悬液中。不过，悬液介质通常包括糖，用于防护冷冻损害。
发明概述因此，本发明在一方面提供脂质体组合物，防护经过冷冻和随后的融化之后发生微囊聚集和融合，防护发生包容物的损失。
本发明在另一方面提供脂质体组合物，与由单独的低温防护剂所提供的防护作用相比，它提高了对冻/融损害的防护作用，这一点可由微囊融合减少和包容物损失减少加以证明。
本发明进一步提供包埋有高离子强度药物的脂质体组合物，防护在经过冷冻和随后的融化之后发生微囊融合和内容物的损失。
本发明在另外一方面提供脂质体组合物，它提高了对冻/融损害的防护作用。在一种实施方案中，组合物由脂质体悬液组成，每粒脂质体包埋有具有一定内部重量克分子渗透浓度的水性介质。脂质体是悬浮在外部介质中的，外部介质是由水溶性盐和低温防护剂组成的，其中外部介质的外部重量克分子渗透浓度高于内部脂质体重量克分子渗透浓度，由此建立跨越每粒脂质体的内低/外高渗透梯度。
在另一种实施方案中，外部介质包括一种盐，选自硝酸盐、钠盐、钾盐、铵盐和硫酸盐。在优选的实施方案中，盐是氯化钠(NaCl)或氯化钾(KCl)。
低温防护剂通常是一种糖，单糖或二糖、甘油、或聚乙二醇。在优选的实施方案中，低温防护剂选自海藻糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、葡聚糖、甘油、聚乙二醇和氨基苷类。
在另一种实施方案中，组合物进一步包括包埋在脂质体中的治疗剂。在优选的实施方案中，治疗剂是顺铂或顺铂类似物、或其衍生物。
在另外一种实施方案中，脂质体组合物包括与亲水性聚合物链衍生的成微囊脂质。
本发明在另一方面提供用于防护脂质体组合物免遭冻/融损害的方法。该方法包括制备脂质体悬液，悬液中的每粒脂质体包埋有具有一定内部重量克分子渗透浓度的水性介质。脂质体是悬浮在由水溶性盐和低温防护剂组成的外部介质中的，其中外部介质的外部重量克分子渗透浓度高于内部脂质体重量克分子渗透浓度，由此建立跨越每粒脂质体的内低/外高渗透梯度。
本发明在另外一方面提供用于防护含有金属配位化合物的脂质体组合物冻/融损害的方法。该方法包括制备脂质体悬液，悬液中的每粒脂质体包埋有具有一定内部重量克分子渗透浓度的水性介质和一种包埋的化合物。脂质体是悬浮在由水溶性盐和低温防护剂组成的外部介质中的，其中外部介质的外部重量克分子渗透浓度高于内部脂质体重量克分子渗透浓度，由此建立跨越每粒脂质体的内低/外高渗透梯度。在一种实施方案中，治疗剂是顺铂或顺铂类似物、或其衍生物。在另一种实施方案中，外部介质中的盐是氯化钠(NaCl)，低温防护剂是蔗糖。
本发明在另外一方面提供用于提高脂质体悬液低温防护作用的方法，在悬液介质中包括低温防护剂。这一改进在悬液介质中包括水溶性盐，以有效建立跨越每粒脂质体的渗透梯度，其中悬液介质的重量克分子渗透浓度高于脂质体内部。在一种实施方案中，渗透梯度至少为100mOsm，优选为大于约200mOsm，更优选为大于约400mOsm，最优选为大于约500mOsm。
发明的详细说明I、说明本文所用的下列术语具有下列含义“冷却损害”或“冷冻损害”指的是脂质体组合物暴露于足以导致一种不良后果的温度之后发生的若干不良后果的任意一种。足以导致冷冻损害的温度通常是低于约0℃的温度，更常见为低于约-5℃的温度，进而更常见为低于约-10℃的温度。不良后果包括但不限于因微囊聚集和/或融合而致粒径生长增加、和包封治疗剂的损失。能够导致这样一种后果发生的实际温度将因脂质体制剂而异，例如脂质和其他双分子层组分的类型、以及包埋的介质和治疗剂。有时，冷冻损害在极冷的温度下是较小的，特别是如果冷冻和随后的融化速率较快时。
本文所用的“冻/融损害”包括与冷冻损害(如上所述)有关的不良副作用，和另外作为至少一个冷冻与融化周期结果所观察到的后果，例如不均匀的粒径分布。所述后果在慢融化过程期间可能更加明显，也就是在约2-8℃，这是相对快融化过程而言的，也就是在室温下，或者水浴条件(例如参见表8)。
“低温防护剂”指的是适合于防护脂质体组合物免遭冷冻损害和/或冻/融损害的试剂或化合物。优选的低温防护剂包括例如糖类(二糖和单糖)、甘油和聚乙二醇。
本文所报道的“渗透梯度”值是这样测定的，计算脂质体组合物的内部与外部重量克分子渗透浓度，取自于摩尔浓度乘以分子(M×1)内部与外部脂质体介质中的非电解质或每分子电解质的离子数，从外部重量克分子渗透浓度减去内部重量克分子渗透浓度。
II、示范性脂质体组合物如上所述，本发明涉及抗冷冻损害和/或冻/融损害的脂质体组合物。脂质体组合物具有跨越脂质体脂质双分子层的渗透梯度，其中脂质体外部的悬液介质的重量克分子渗透浓度高于包埋在脂质体内部的介质的重量克分子渗透浓度。
例如，实施例1(如下)描述两种脂质体安慰制剂的制备，也就是一种脂质体制剂在内部与外部脂质体介质中都具有低温防护剂蔗糖，另一种脂质体制剂仅在外部介质中含有蔗糖。两种脂质体制剂在脂质体内部与外部介质中含有0.9％重量/体积(w/v)NaCl，脂质体由脂质HSPC、胆固醇和mPEG-DSPE组成，摩尔比分别为51/44/5。
将两种脂质体制剂在-20℃下冷冻2.7天(大约65小时)，随后在室温下静置融化。对两种脂质体安慰制剂进行动态光散射，以测定冷冻前后的粒径。结果如表1所示。
表1
*平均粒径是对单一样本进行三次测量的标准偏差。
在内部与外部介质中含有蔗糖的脂质体制剂(制剂#2)对冷冻损害更敏感，粒径增加证明了这一点，例如从大约116nm(从未冷冻的对照组)增至冻/融样本的204nm。仅在外部介质中含有蔗糖的脂质体制剂(制剂#1)粒径在冷冻后增加较小，至大约166nm。正如下列实施例将更加充分证明的那样，这些结果提示，具有高渗梯度的脂质体制剂、也就是外部重量克分子渗透浓度大于内部重量克分子渗透浓度(例如渗透梯度为146mOsm的制剂#1)，对冻/融损害较不敏感。
实施例2描述具有上述脂质组成的脂质体安慰制剂的制备，其外部含有5％(w/v)的蔗糖，内部不含蔗糖。随后将脂质体制剂用5％(w/v)蔗糖和不同量NaCl稀释，得到在外部水性介质中具有0.9％、0.6％和0.3％(w/v)NaCl的脂质体制剂。内部水性介质中的NaCl浓度为0.9％(w/v)。将每种脂质体制剂样本在-20℃下冷冻大约5天(大约118小时)，随后融化。测定粒径，结果如下表2所示。
表2
*平均粒径是对单一样本进行三次测量的标准偏差。
表2所示数据揭示，由冷冻后的粒径增加所判定的冻/融损害程度受到跨越脂质体脂质双分子层的渗透梯度的影响。外部介质含5％蔗糖和0.9％NaCl(渗透梯度＝146mOsm)的脂质体制剂对冻/融损害最不敏感，这一点可由三种脂质体制剂的粒径增加最小加以证明。具有相反渗透梯度的脂质体制剂、也就是外部介质含5％蔗糖和0.3％NaCl(渗透梯度＝-59mOsm)的制剂经过冷冻和融化之后粒径增加最大。
实施例3描述对24种脂质体制剂所进行的定性试验，以进一步评价渗透梯度对脂质体制剂对冻/融损害敏感度的重要性。本例中，制备了具有上述脂质组成(HSPC、胆固醇和mPEG-DSPE)的脂质体安慰制剂。内部脂质体介质是0.9％或1.8％(w/v)NaCl。外部水性介质含有(i)10毫摩尔(mM)组氨酸、(ii)0％、5％或10％(w/v)蔗糖和(iii)NaCl，浓度等于内部NaCl浓度乘以0.5、1、1.5或2.0。每种制剂的内部与外部介质如表3所述。表3
1nc＝与未冷冻的对照组相比外观没有显著改变；粒子＝存在肉眼可见的粒子；浑浊＝样本不如未冷冻的对照组那样透明将表3所示样本在-20℃下冷冻3小时，随后融化至室温。用肉眼观察每份样本冷冻损害的宏观证据，例如肉眼可见的粒子的存在，和悬液的澄明度。具有低渗透梯度的样本(表3中第1和13-14号样本，其中的外部重量克分子渗透浓度小于内部重量克分子渗透浓度)可以见到在冷冻和融化之后是不均匀的，含有肉眼可见的粒子。相反，具有高渗透梯度的样本(表3中第3、5-12和17-24号样本)可以见到类似于未冷冻的对照样本。接近等渗的样本(表3中第2、4和15-16号样本)具有中等外观，既不象低渗透样本那样存在很多粒子，但是也不象对照组那样澄明。值得注意的是接近等渗的样本(样本#16)内部与外部具有1.8％NaCl，其外观介于中间，说明对冷冻损害的防护作用不仅仅是简单的外部NaCl浓度增加的结果，而且也是跨越脂质体脂质双分子层的高渗透梯度的结果。
在所进行的另一项支持本发明的实验中，如实施例4所述，制备了含有顺铂的脂质体制剂。脂质体由HSPC、胆固醇和mPEG-DSPE组成，摩尔比分别为51/44/5。包埋在脂质体中的是顺铂的0.9％(w/v)NaCl溶液。外部的大批悬液介质由10mM组氨酸、浓度为0.9％、1.8％、2.7％或3.6％(w/v)的NaCl和浓度为5％、10％、15％或20％(w/v)的蔗糖组成。示范性制剂如表4所述。将脂质体样本在-20℃下冷冻6.8天(大约118小时)，然后在室温下静置融化。测定每份样本的平均脂质体粒径，作为冷冻损害程度的量度。结果如表4所示。表4
*平均粒径是对单一样本进行三次测量的标准偏差。
如表4所示，当外部NaCl浓度增加至等渗浓度、即0.9％(w/v)NaCl以上时，经过单一冻/融周期之后的平均粒径增加较小。在蔗糖的每种浓度下，即5％、10％、15％和20％(w/v)，NaCl浓度越高，防护脂质体微囊免遭冻/融损害就越好。提供对冷冻损害的最佳防护作用的外部组成是5％(w/v)蔗糖和3.6％(w/v)NaCl，其中粒子的粒径没有统计学增加。
表4第四栏所示数据证明，即使在没有冷冻时，随着外部重量克分子渗透浓度增加，也可测量到平均粒径减少。这里的实验说明，粒径减少不是脂质体形状改变的结果。尽管在高渗透梯度的存在下，预期脂质体发生皱缩，不过由于水的逐出，脂质体形状的改变不应持续至用0.9％(w/v)NaCl稀释300倍之后，稀释之后通过动态光散射测量粒径。实验显示，用3.6％(w/v)NaCl或蒸馏水稀释高渗制剂，导致所测量的平均粒径与用0.9％(w/v)NaCl稀释的样本相同。这提示随着重量克分子渗透浓度的增加，测量到粒径减少，这主要是由于微囊聚集状态的改变。
表4所示的一个惊人结果是，增加外部蔗糖浓度并不显著减少经过冷冻和融化之后粒径生长的程度，特别是当外部NaCl浓度大于或等于1.8％(w/v)时。当外部NaCl浓度为2.7％或3.6时，数据提示较低的外部蔗糖浓度可能为这种特定的脂质体组合物提供最好的对冷冻损害的防护作用。为了进一步研究这一点，制备具有与实施例4所述相同组成的脂质体制剂，但是外部蔗糖浓度为1％、2％、3％、4％或5％(w/v)。将样本在-20℃下冷冻3.9天(大约94小时)，融化至室温，通过测量冷冻前后的平均粒径，判定冷冻损害的程度。结果如表5所示。表5
*平均粒径是对单一样本进行三次测量的标准偏差。
表5所示结果与表4所示结果是一致的，说明对这种特定的脂质体制剂来说，在高外部NaCl浓度下，对低温防护作用来说最佳的外部蔗糖浓度是相对低的。
上述实验主要集中于经过冷冻和随后的融化之后的粒径生长，这一点可由冻/融损害的程度加以证明。这里所述的其他实验涉及所包埋的治疗剂的损失，以评价冻/融损害的程度。该实验中，进一步分析了表5所示有些样本在冷冻前后的药物包封百分率。通过火焰原子吸收光谱测量所包埋的顺铂的百分率，如下列方法所述。结果如表6所述。
表6
*平均粒径是对单一样本进行三次测量的标准偏差。
顺铂的包封百分率与平均粒径生长之间的相互关系是明显的。例如，当存在粒径生长时，例如通过动态光散射(DLS)测量到增加，发现顺铂经过冷冻和随后的融化之后释放。
为了确保在冷冻期间不生成少量较大粒子，在650nm下进行浊度测量(如下列方法所述)。浊度测量一般比动态光散射对样本中的小批量大粒子更加敏感。如实施例4所述制备脂质体，但是外部蔗糖浓度保持恒定在3％(w/v)。外部NaCl浓度的范围如表7所述。将样本在-20℃下冷冻3.9天(大约93小时)，在室温下静置融化。然后通过DLS和浊度测定分析样本，并与对照，也就是从未冷冻的样本进行比较。结果如下表7所示。表7
*平均粒径是对单一样本进行三次测量的标准偏差。
通过浊度(冷冻与融化)与浊度(从未冷冻)之比测定一个冻/融周期所致浊度相对改变。比较表7的最后两栏，由于对冷冻与融化的防护作用，平均粒径生长与浊度相对改变之间的相互关系是明显的。数据提示，在大于约3％(w/v)NaCl的存在下，由跨越脂质体双分子层的渗透梯度的存在所提供的对冻/融损害的阻抗是良好的，特别是当外部蔗糖浓度为约1％至约10％之间，更优选为约1％至约5％之间，最优选为约2％至约4％之间。
确切地说，在外部介质的存在下，防护了用在上述实验中的含有顺铂的脂质体组合物冻/融损害，外部介质含有约2.7％至约3.6％(w/v)之间的NaCl和约2％至约5％之间的蔗糖。
在另外一项实验中，含有不同量低温防护剂和盐的脂质体制剂暴露于不同的冻/融条件。如上所述，从HPSC、mPEG-DSPE和胆固醇制得脂质体。将顺铂的0.9％(w/v)NaCl溶液包埋在脂质体中，调节外部介质，使其含有3.3％(w/v)NaCl和3％(w/v)蔗糖。将样本制备一式三份，通过若干方法冷冻，包括(i)干冰/异丙醇浴约10分钟，然后在-70℃冰库内培育；(ii)干冰/异丙醇，然后在-20℃冰库内培育；(iii)直接贮存在-70℃冰库内；(iv)直接贮存在-35℃冰库内，和(v)直接贮存在-20℃冰库内。3.9天(大约94小时)后，融化所有样本。每组一式三份样本中，一份在室温水中融化，一份在室温空气中融化，一份在2-8℃冰箱内融化。通过DLS测量粒径，评价所有样本的冻/融损害。唯一表现可测量的粒径生长的样本是冷冻在-70℃下的样本，无论直接冷冻还是在引入干冰/异丙醇浴之后培育在-70℃冰库内。粒径生长取决于冷冻与融化条件，冷冻与融化速率越慢，所致冻/融损害越大，如下表8所示。
表8
1所有脂质体都具有919mOsm的渗透梯度(0.9％内部NaCl；3.3％外部NaCl+3％外部蔗糖+10mM外部组氨酸；假定顺铂大多数沉淀。)2缩写N.A.＝不适用；DI/IPA，-70＝干冰/异丙醇，然后置于-70℃冰库内；RT＝室温。
*平均粒径是对单一样本进行三次测量的标准偏差。
该实验提示，具有渗透梯度的脂质体组合物对至少-35℃的温度具有防护冻/融损害的作用。
上述实验已经证明，跨越脂质体双分子层的渗透梯度为脂质体组合物提供抗冻/融损害的防护作用。不过，渗透梯度在非冷冻条件下不影响脂质体组合物的稳定性也是必要的。为了评价具有渗透梯度的脂质体组合物的稳定性，将样本置于加速稳定性试验中。具体来说，如实施例4所述制备两批脂质体组合物。脂质体组合物含有HSPC、mPEG-DSPE和胆固醇，以及包埋的顺铂。外部水性悬液介质由3.3％(w/v)NaCl和3％(w/v)蔗糖组成。表9显示试验第1批与第2批和对照制剂的组分和浓度。
表9
将两个试验批次和对照制剂在不同温度(如表10所示)下贮存长达3.5个月。在此3.5月期间，按一定间隔取出样本进行DLS分析，以测定所包封的顺铂的百分率和平均粒径。结果总结在表10中。表10
*平均粒径是对单一样本进行三次测量的标准偏差。
表10尤其阐述将第1批在-20℃下冷冻一周，导致所包封的药物量下降6％。该样本中，冷冻2周，所包封的药物损失百分率为9％。如上所示，这些时间点的平均粒径仅有微小增加。所选择的包埋药物损失9％证明粒径几乎没有改变，这样的产品浸剂不应危及功效或患者的安全，因为大多数药物是包埋在脂质体中的。如上所示，第2批比第1批较少渗漏。
稳定性试验说明，其中外部脂质体重量克分子渗透浓度高于内部重量克分子渗透浓度的、具有跨越脂质双分子层的渗透梯度的脂质体组合物在产品运输期间提供另外的对意外冷冻损害的防护作用，对产品稳定性的影响可以忽略不计。
III、脂质体组分A、脂质上面所讨论的研究采用一种渗透梯度，也就是其中外部脂质体重量克分子渗透浓度高于内部重量克分子渗透浓度，可减少脂质体对冷冻损害的敏感性，这一点可以使用由氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇和mPEG-DSPE组成的脂质体来显示。不过，本领域技术人员将认识到，由各种脂质组合物组成的脂质体组合物都涵盖其中。脂质体主要由成微囊脂质组成，也就是在水中能够自发形成双分子层微囊的脂质体，例如磷脂。这种类型的成微囊脂质优选地具有两条烃链，通常为酰基链，和一个头基，是极性或非极性的。有各种合成的成微囊脂质和天然存在的成微囊脂质，包括磷脂，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇和神经鞘磷脂，其中两条烃链通常长约12-22个碳原子，并且具有不同的不饱和度。其酰基链具有不同不饱和度的上述脂质和磷脂是市售的，或者可以按照文献方法加以制备。关于脂质合成的参考文献包括(i)Mason等“异构体纯的饱和混合链磷脂酰胆碱的合成方法”《生物化学年报》113(1)96-101(1981)；(ii)Zalipsky，S.“端基官能化的聚乙二醇-脂质缀合物的合成，用于聚合物-接枝脂质体的制备”《生物缀合物化学》4(4)296-299(1993)。
脂质体还可以包括稳定地结合在脂质体脂质双分子层内的脂质，例如二酰基甘油、溶血磷脂、脂肪酸、糖脂、脑苷脂和固醇，例如胆固醇。
如果需要的话，脂质体还可以包括与亲水性聚合物衍生的成微囊脂质，例如美国专利No.5,013,556所述。在脂质体组合物中包括衍生的脂质会在脂质体周围形成亲水性聚合物链的表面包衣。与缺少这样一种包衣的脂质体相比，亲水性聚合物链的表面包衣有效增加脂质体的体内血液循环寿命。
适合与亲水性聚合物衍生的成微囊脂质包括上文列举的任意那些，确切地是磷脂，例如二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
适合与成微囊脂质衍生的亲水性聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯甲醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚羟丙基异丁烯酰胺、聚异丁烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚羟丙基异丁烯酸酯、聚羟乙基丙烯酸酯、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙二醇、聚天冬酰胺和亲水性肽序列。聚合物可以采用其均聚物、共聚物和嵌段或无规共聚物的形式。
优选的亲水性聚合物链是聚乙二醇(PEG)，PEG链的分子量优选为约500道尔顿至约10,000道尔顿，更优选为约1,000道尔顿至约5,000道尔顿。PEG的甲氧基或乙氧基盖帽(capped)的类似物也是优选的亲水性聚合物，市售的各种大小的聚合物，例如约120道尔顿至约20,000道尔顿。
与亲水性聚合物衍生的成微囊脂质的制备例如已经描述在美国专利No.5,395,619中。包括这类衍生的脂质的脂质体的制备也已经描述过，它们通常含有约1-20摩尔百分率的包括在脂质体组合物中的这样一种衍生的脂质。
B、包埋的试剂脂质体通常还包括包埋的试剂和/或药物，其中“包埋”打算包括在脂质体的水性内核和水性空间中试剂和/或药物的包封，另外试剂和/或药物还包埋在脂质体的脂质双分子层中。
用在本发明的脂质体组合物中的试剂和/或药物是各种各样的，例如包括治疗应用和诊断应用。
治疗剂和/或药物包括天然与合成的化合物，具有下列治疗活性抗关节炎、抗心律失常、抗细菌、抗胆碱能、抗凝血、抗利尿、解毒、抗癫痫、抗真菌、抗炎、抗代谢、抗偏头痛、抗肿瘤、抗寄生物、退热、抗癫痫发作、抗血清、抗痉挛、止痛、麻醉、β-阻滞、生物反应调节、骨代谢调节、心血管、利尿、酶、生育力增强、生长促进、止血、激素、激素抑制、高钙血症减轻、低钙血症减轻、低血糖减轻、高血糖减轻、免疫抑制、免疫增强、肌肉松弛、神经传递、拟副交感、拟交感的血浆增容、血浆膨胀、治疗精神病、溶解血栓和血管舒张。
在优选的实施方案中，所包埋的试剂是“细胞毒性药物”，也就是对靶细胞具有有害或毒性作用的药物。示范性细胞毒性试剂包括蒽环抗生素，例如阿霉素、柔红霉素、表柔比星和伊达比星，和它们的类似物，例如epirubidin和米托蒽醌；铂化合物，例如顺铂、卡铂、奥马铂、奥沙利铂、折尼铂、恩洛铂、洛铂、螺铂、((-)-(R)-2-氨基甲基吡咯烷(1，1-环丁烷二羧酸离子)铂)(DWA2114R)、(SP-4-3(R)-1，1-环丁烷二羧酸离子(2-)-(2-甲基-1，4-丁二胺-N，N’)铂)(CI-973)、奈达铂(254-S)和(双-乙酸离子-胺-二氯-环己胺-铂(IV))(JM-216)(Weiss等《药物》46(3)360-377(1993))；和长春花属生物碱，例如长春新碱、长春花碱、长春罗新、长春罗定、长春瑞滨(诺威本)和长春地辛。
另一类细胞毒性试剂是拓扑异构酶I抑制剂，例如喜树碱及其类似物，包括SN-38((+)-(4S)-4，11-二乙基-4，9-二羟基-1H-吡喃并[3’，4’6，7]-中氮茚并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮)；9-氨基喜树碱；9-硝基喜树碱；托泊替堪(hycamtin；9-二甲基-氨基甲基-10-羟基喜树碱)；伊立替康(CPT-11；7-乙基-10-[4-(1-哌啶子基)-1-哌啶子基]-羰基氧基-喜树碱)，它在体内水解为SN-38)；7-乙基喜树碱及其衍生物(Sawada等《化学与药学通报》41(2)310-313(1993))；7-氯甲基-10，11-亚甲-二氧基-喜树碱；和其他(SN-22，Kunimoto等《药物生物动力学杂志》10(3)148-151(1987)；DX-8951f和GG-211((7-(4-甲基哌嗪基-亚甲基)-10，11-亚乙二氧基-20(S)-喜树碱))(Rothenberg《肿瘤学年鉴》8(9)837-855(1997))，和7-(2-(N-异丙氨基)乙基)-(20S)-喜树碱(Chong KunDang公司，Seoul，韩国，CKD602)。
在本发明的优选实施方案中，组合物用于脂质体的防护，该脂质体包埋具有高离子强度的治疗剂和/或药物，例如上述顺铂及其有关类似物。
C、盐和低温防护剂脂质体组合物的外部悬液介质通常比内部脂质体介质具有更高的重量克分子渗透浓度。增加重量克分子渗透浓度主要是通过向外部介质中加入一种盐而提供的。任何水溶性盐都适合于此目的。例如，所涵盖的盐选自硝酸盐、钠盐、钾盐、铵盐和硫酸盐。在优选的实施方案中，盐是NaCl或KCl。
外部介质还包括低温防护剂，一般是如上所定义的，包括糖、甘油和聚乙二醇。糖可以是二糖或单糖，示范性糖包括海藻糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、葡聚糖和氨基苷类。
所有公开出版物、专利和专利文献均引用在此作为参考文献，如同分别引用作为参考文献。已经根据各种具体和优选的实施方案和技术对发明进行了描述。不过，应当认为可以在本发明的精神和范围内进行很多修改和改变。
下列实施例打算阐述而非限制发明。
材料DSPE购自Avanti Polar Lipids(伯明翰，AL)，甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE，mPEG MW 2000道尔顿)来自Sygena，Inc.(剑桥，MA)。胆固醇来自Slovay制药(Veenedaal，荷兰)。HSPC由Lipoid K.G.(Ludwigshafen，德国)制造。顺铂来自W.C.Heraeus GmbH(Hanau，德国)。
方法1、脂质体粒径利用Coulter N4MD型(Coulter Corp，迈阿密，FL)，通过动态光散射测定脂质体粒径。除非另有注解，将每种脂质体组合物用0.9％(w/v)NaCl稀释约300倍，再用不同角度(90°和30°)的光柱进行DSL测量。测量在20℃下重复进行三次。
2、顺铂的包封百分率通过凝胶排阻色谱法分离脂质体和游离药物，利用Perkin-Elmer3110型，通过火焰原子吸收光谱分析各部分的总Pt含量。
3、浊度将脂质体用0.9％(w/v)NaCl稀释5倍，再在室温下测量650nm下的光密度(OD650nm)，使用0.9％NaCl(w/v)作为空白。由冷冻与融化所导致的浊度相对改变被定义为OD650nm(冷冻与融化)与OD650nm(从未冷冻)之比。
实施例1在渗透梯度存在下的低温防护作用A、脂质体安慰制剂内部蔗糖向60-65℃无水乙醇中加入摩尔比为51/44/5的脂质HSPC、胆固醇和mPEG-DSPE，得到0.002摩尔脂质/每毫升乙醇，混合直至溶解，大约1小时。向0.9％(w/v)NaCl和5％(w/v)蔗糖的无菌水溶液中加入溶解后的脂质，得到总脂质浓度为大约126mg/ml。在渗析后样本稀释到总脂质体浓度大约为100nm。
B、脂质体安慰制剂无内部蔗糖向60-65℃无水乙醇中加入摩尔比为51/44/5的脂质HSPC、胆固醇和mPEG-DSPE，得到0.002摩尔脂质/每毫升乙醇，混合直至溶解，大约1小时。向0.9％(w/v)NaCl的无菌水溶液中加入溶解后的脂质，得到总脂质浓度为大约126mg/ml。
关于上述A和B两种制剂，使脂质体在60-65℃下水合，同时机械搅拌大约1小时，再在60-65℃下利用孔径为0.1微米的聚碳酸酯膜通过挤出作用形成直径大约为120nm的单层微囊。除去乙醇，通过透析调节外部水性介质至0.9％(w/v)NaCl和5％(w/v)蔗糖。
C、冷冻和融化条件将上述A和B中形成的脂质体悬液的3ml室温等份试样置于10ml透明玻璃血清小瓶中。将小瓶置于常规-20℃冰库内2.7天。然后从冰库中取出样本，置于室温下融化。
D、样本的分析通过动态光散射测定融化后每种制剂以及每种制剂的对照(对照表示样本没有冷冻)样本的脂质体粒径。结果如表1所示。
实施例2具有不同NaCl外部浓度的脂质体制剂脂质体是这样制备的，将摩尔比为51/44/5的脂质HSPC、胆固醇和mPEG-DSPE溶于60-65℃无水乙醇，得到0.002摩尔脂质/每毫升乙醇。向0.9％(w/v)NaCl中加入溶解后的脂质，得到总脂质浓度为大约126mg/ml。将脂质水溶液混合，形成脂质体。随后通过挤出作用减少脂质体的大小。透析后，使总脂质达到约100mM(在用5％蔗糖和0.9％、0.45％或0％NaCl稀释3倍之前，如下所述)。
通过透析作用，将外部大批介质用含有0.9％(w/v)NaCl和5％(w/v)蔗糖的介质置换。将制剂用5％(w/v)蔗糖和0.9％、0.45％或0％(w/v)NaCl水溶液稀释3倍，得到5％(w/v)蔗糖和0.9％、0.6％或0.3％(w/v)NaCl的外部介质。
将每种制剂的样本在-20℃下冷冻4.9天。将样本在室温下静置融化，然后通过动态光散射测定粒径。结果如表2所示。
实施例3表3的脂质体制剂如实施例1和2所述制备表3所述脂质体制剂，并作下列修改(i)关于一半样本，用于水合的含水相是0.9％NaCl，另一半是1.8％NaCl；和(ii)用组氨酸以及不同量的NaCl和蔗糖进行透析之后的稀释，使外部[NaCl]和[蔗糖]达到表3所示的值，并且含有0.5mM pyranine。pyranine是一种荧光探针，它不影响冻/融实验的结果。所有水合介质除了NaCl以外都含有0.5mM pyranine。
实施例4包埋有顺铂的脂质体在内衬特氟隆的压力容器内将无菌水加热至63-67℃，加入氯化钠(0.9％)。加入浓度为8.5mg/ml的顺铂，混合直至溶解，大约15-25分钟。向60-65℃的900ml无水乙醇中加入257.0g PEG-DSPE、719.4gHSPC和308.4g胆固醇(摩尔比为50.6/44.3/5.1)，混合直至溶解，大约2小时。向7670g药物溶液中加入溶解后的脂质，得到总脂质浓度为大约150mg/ml。
向温热(63-67℃)的药物溶液中迅速加入温热的脂质溶液，同时搅拌，形成大小不均的脂质体悬液。将悬液在63-67℃下混合一小时。水合混合物中的顺铂浓度为7.7mg/ml，在此阶段，大约30％的药物被包封在脂质体中。总溶液体积的10％是乙醇，总脂质浓度为150mg脂质/ml。
通过调节通过安放在内衬特氟隆的不锈钢容器内的聚碳酸酯滤筒的挤出作用，使脂质体形成所需的平均粒子直径。在6-8个小时的整个挤出过程中，脂质体悬液保持在63-65℃。
调整大小后，将脂质体悬液冷却至2-8℃过夜，然后温热至室温(20-25℃)，再通过1.2μm 142-mm Gelman Versapor滤器(尼龙66载体上的丙烯酸共聚物)过滤，以除去所沉淀的药物。
将NaCl溶于无菌水，制得0.9％(w/v)NaCl水溶液。将溶液的pH用2N HCl或NaOH调至大约5.5。将溶液通过0.22μm Durapore滤器过滤。
将脂质体悬液用NaCl溶液按大约1∶1(v/v)稀释，通过聚砜中空纤维超滤器渗滤。对NaCl溶液进行八体积置换，以除去乙醇和未包封的药物。加工流体温度保持在约20-30℃。总渗滤时间为大约4.5小时。
然后通过超滤作用将脂质体悬液浓缩至大约1.2mg顺铂/ml。通过HPLC分析渗滤过程后流体的顺铂含量。脂质体的内相为7.7mg/ml顺铂的0.9％ NaCl溶液，外相为含水0.9％NaCl。
将脂质体制剂的样本置于玻璃小瓶中，加入固体NaCl和蔗糖，得到外部NaCl浓度在0.9％-3.6％(w/v)之间，外部蔗糖浓度在约1％至约20％(w/v)之间，假定在加入固体之前，外部介质的体积占总体积的85％。将每份样本在-20℃下冷冻6.8天，然后在室温下静置融化。测定每份样本中脂质体的平均粒径，作为冷冻损害程度的量度。结果如表4所示。
尽管已经根据特定的实施方案对发明进行了描述，不过对本领域技术人员来说显而易见的是可以进行各种改变和修改而不背离发明。
权利要求
1.防护冻/融损害的脂质体组合物，包含脂质体的悬液，其中每粒脂质体含有具有一定内部重量克分子渗透浓度的被包埋的水性介质，该脂质体是悬浮在由水溶性盐和低温防护剂组成的外部介质中的，所述外部介质具有高于内部脂质体重量克分子渗透浓度的外部脂质体重量克分子渗透浓度，由此建立跨越每粒脂质体的内低/外高的渗透梯度。
2.权利要求1的组合物，其中该外部介质包括一种盐，选自由硝酸盐、钠盐、钾盐、铵盐和硫酸盐组成的组。
3.权利要求1的组合物，其中该低温防护剂是二糖。
4.权利要求1的组合物，其中该低温防护剂是单糖。
5.权利要求1的组合物，其中该低温防护剂选自由海藻糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、葡聚糖、甘油、聚乙二醇和氨基苷类组成的组。
6.权利要求2的组合物，其中该盐选自氯化钠(NaCl)和氯化钾(KCl)或其组合。
7.权利要求1的组合物，进一步包含包埋在该脂质体中的治疗剂。
8.权利要求7的组合物，其中该脂质体包括与亲水性聚合物链衍生的成微囊脂质。
9.权利要求8的组合物，其中该治疗剂是顺铂或顺铂类似物或其衍生物。
10.用于防护脂质体组合物冻/融损害的方法，包括制备脂质体的悬液，其中该悬液中的每粒脂质体包含具有一定内部重量克分子渗透浓度的被包埋的水性介质，该脂质体是悬浮在由水溶性盐和低温防护剂组成的外部介质中的，所述外部介质具有高于内部脂质体重量克分子渗透浓度的外部脂质体重量克分子渗透浓度，由此建立跨越每粒脂质体的内低/外高的渗透梯度。
11.权利要求10的方法，其中该外部介质包括一种盐，选自由硝酸盐、钠盐、钾盐、铵盐和硫酸盐组成的组。
12.权利要求10的方法，其中该低温防护剂是二糖。
13.权利要求10的方法，其中该低温防护剂是单糖。
14.权利要求10的方法，其中该低温防护剂选自由海藻糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、葡聚糖、甘油、聚乙二醇和氨基苷类组成的组。
15.权利要求11的方法，其中该盐选自氯化钠(NaCl)和氯化钾(KCl)或其组合。
16.用于防护含有金属配位化合物的脂质体组合物冻/融损害的方法，包括制备脂质体的悬液，其中该悬液中的每粒脂质体包含具有一定内部重量克分子渗透浓度的被包埋的水性介质和金属配位化合物，该脂质体是悬浮在由水溶性盐和低温防护剂组成的外部介质中的，所述外部介质具有高于内部脂质体重量克分子渗透浓度的外部脂质体重量克分子渗透浓度，由此建立跨越每粒脂质体的内低/外高的渗透梯度。
17.权利要求16的方法，其中该金属配位化合物是顺铂或顺铂类似物或其衍生物。
18.权利要求17的方法，其中该外部介质中的盐是NaCl，该低温防护剂是蔗糖。
19.用于改善冷冻脂质体悬液的方法，包括在该脂质体悬液中结合低温防护剂和水溶性盐，以有效建立跨越每粒脂质体的渗透梯度，该悬液介质具有高于脂质体内部的重量克分子渗透浓度。
20.权利要求19的方法，其中该渗透梯度至少是100mOsm。
全文摘要
描述了一种脂质体组合物,它提高了对冻/融损害的防护作用。脂质体组合物含有跨越脂质体脂质双分子层的渗透梯度,其中外部介质的重量克分子渗透浓度高于脂质体内部介质的重量克分子渗透浓度。通常,外部介质包括一种盐和一种低温防护剂,以增加重量克分子渗透浓度。
文档编号A61K47/24GK1361682SQ00810438
公开日2002年7月31日 申请日期2000年7月14日 优先权日1999年7月16日
发明者R·M·阿布拉, A·R·迪布尔 申请人:阿尔萨公司