专利名称：上皮细胞生长抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于诊断和治疗上皮细胞癌的上皮细胞生长抑制剂家族。
背景技术：
上皮细胞癌，例如前列腺癌、乳房癌、结肠癌、肺癌、胰癌、卵巢癌、脾癌、睾丸癌、胸腺癌等是以上皮细胞异常加速生长为特征的疾病。这种加速生长最初引起肿瘤形成。最后，肿瘤还会转移到不同的器官部位。尽管在各种癌症的诊断和治疗方面已有进展，但这些疾病仍然导致显著的死亡率。
早期检测可大大增强癌症的治疗。然而，早期检测疾病存在困难。例如，含有上皮组织的器官(如前列腺、卵巢和其它器官)不易触摸。没有频繁的筛检和合适的标记物，很难检测到这些器官中异常的肿瘤生长。现有的癌症诊断试验的很大缺点是假阳性和假阴性结果的比例很高，从而使现有试验的可靠性比所希望的低。出于这个原因，非常需要鉴定出新的诊断试剂和新的治疗剂来改善癌症(前列腺癌、乳房癌、结肠癌、肺癌、胰癌、卵巢癌、脾癌、睾丸癌、胸腺癌等)的诊断和治疗。
一种新的特异性乳房细胞生长抑制剂乳房抑制素(Mammastatin)最近已得到鉴定，并作了特性分析。该乳房抑制素可由下列各克隆表达MammA(PCT/US97/18026，ATCC#97451，1996年2月22日保藏)；MammB(PCT/US97/27147，ATCC#PTA-2091，2000年6月15日保藏)；和Mammc，在与本申请同日提交的待批PCT申请PCT/US00/16900中有所描述(ATCC#PTA-2090，2000年6月15日保藏)。
乳房抑制素由正常乳房细胞产生和分泌，可在正常个体的血样中检测到。在乳房癌患者中，该乳房细胞生长抑制剂(具体是乳房抑制素的活性磷酸化形式)的血浓度降低或没有。给予含有活性乳房抑制素(由正常人乳房癌细胞分泌)的蛋白能有效地减小肿瘤大小和数目，并能阻止晚期癌症患者的肿瘤生长。
与乳房抑制素相似的上皮细胞生长抑制剂已被发现、分离和特性鉴定。这些抑制剂在序列的5′端与乳房抑制素有部分序列相同性，而在分子的3′端具有很少或没有相同性。和乳房抑制素一样，新发现的上皮细胞生长抑制剂(ECGI)家族在正常上皮细胞组织中有差异表达，但在癌上皮细胞组织中不表达。另外，和乳房抑制素一样，新发现的上皮细胞生长抑制剂家族在正常个体的血样中可被检测到，但在上皮细胞癌患者血液中不能检测到(如下文实施例所示)。
发明概述目前已经在许多不同的上皮细胞中鉴定到上皮细胞生长抑制剂(ECGI)家族。这些ECGI在正常上皮细胞中呈差异性表达，但在上皮癌细胞中不表达。如下文实施例所示，已经在各种上皮细胞组织(包括前列腺、结肠、卵巢、肺、脾、睾丸、胸腺和其它上皮细胞组织)中发现了乳房抑制素样ECGI蛋白。
本发明的ECGI在正常上皮细胞中表达，但在癌上皮细胞中不表达。使编码乳房抑制素样ECGI蛋白的核酸序列与编码乳房抑制素的核酸序列杂交。ECGI蛋白也能与抗乳房抑制素抗体结合。前列腺细胞中编码ECGI的氨基酸序列(PRT-6，SEQ ID NO4)已被分离并作了特性鉴定(PRT-6，ATCC#PTA-2092，2000年6月15日保藏)，这在下文实施例中有所描述。
由于本发明的ECGI在正常上皮细胞中差异表达且在癌上皮细胞中不表达，因此可分析ECGI的存在或其含量，以此来诊断癌症和/或监测治疗效果。本发明的ECGI蛋白及编码该蛋白的核酸还提供了抑制上皮细胞生长、防止肿瘤形成和治疗癌症的有用治疗剂。
附图简述
图1A是显示所分析的特异性组织mRNA位置的mRNA测试面板示意图。
图1B是Northern印迹的计算机扫描图象，它显示了乳房抑制素核酸序列与图1A所示方案的各种组织的mRNA杂交。
图2是斑点印迹试验的计算机扫描图，它显示了用抗乳房抑制素抗体7G6检测对照、乳房抑制素标准蛋白、乳房癌患者血清样品、正常和癌性人前列腺细胞的条件(conditioned)培养液(的结果)。
图3是Western印迹试验的计算机扫描图象，它显示了用抗乳房抑制素抗体7G6检测正常人乳房细胞裂解液(A)、人前列腺癌LnCap细胞裂解液(B)、MCF7乳房癌细胞裂解液(C)和正常人前列腺细胞裂解液(D)的结果。
图4是Western印迹试验的计算机扫描图象，它显示了用抗乳房抑制素抗体7G6检测正常前列腺细胞(A)、LnCap前列腺癌细胞(B)、正常结肠细胞(C)和结肠癌细胞(D)的细胞裂解液的结果。
图5是Western印迹试验的计算机扫描图，它显示了用抗乳房抑制素抗体7G6检测人卵巢癌细胞(B)、正常人卵巢细胞(C)和正常人乳房细胞(D)的细胞裂解液的结果。泳道A为分子量标准品。
图6是斑点印迹试验的计算机扫描图象，它显示了用抗乳房抑制素抗体7G6检测健康成年男性(A，C，D)以及前列腺癌患者(B)的血清样品的结果。
图7是含有推定的前列腺ECGF DNA克隆的DNA凝胶的计算扫描图象。
图8是前列腺ECGI的图表示意及其与其它序列的结构关系。
发明详述本发明的蛋白本发明的“上皮细胞生长抑制剂(ECGI)蛋白”在本文中定义为由正常上皮细胞产生的具有抑制其生长活性的乳房抑制素样蛋白。本发明的活性抑制性ECGI蛋白在癌上皮细胞中较少或没有。本文公开的ECGI蛋白家族看来包括对各上皮组织有特异性、而对组织类型没有或有很小抑制活性的抑制剂。如下文所更详细描述的那样，预计每种ECGI蛋白含有生长抑制性结构域和组织特异性结构域。
本发明的ECGI蛋白表现出与乳房抑制素显著同源，后者是一种由正常人乳房细胞产生的乳房细胞生长抑制剂，其已被证实可用于诊断和治疗乳房癌(PCT/US97/18026)。ECGI蛋白可与一种或多种抗乳房抑制素抗体如7G6(Neomarkers，Freemont，CA)结合，编码它的核酸序列与编码乳房抑制素的核酸序列具有显著同源性。
下文实施例中报道的研究证实了ECGI蛋白在正常上皮细胞组织中差异表达，但在癌上皮细胞组织(包括乳房、前列腺、卵巢和结肠)中不表达。和乳房抑制素一样，本发明的ECGI蛋白看来在例如Western印迹中呈两个或三个条带一个主要条带和一个或两个较小的不太显著的条带。已经证明，乳房抑制素的这种表达模式是由于该蛋白质的磷酸化。当在两处磷酸化时，乳房抑制素的分子量大约为53千道尔顿。较小的乳房抑制素(49和44千道尔顿)对应于一个部位或没有部位被磷酸化。乳房抑制素蛋白的磷酸化与其抑制活性有关。
用抗乳房抑制素抗体7G6检测ECGI的Western印迹显示了各种上皮细胞组织产生的ECGI的大约大小。如下文实施例更完整的显示(例如参见图4-5)，前列腺细胞的ECGI在Western印迹中移动至大约55千道尔顿处，不太显著的、较小的条带在51和46千道尔顿处，提示其磷酸化形式与乳房抑制素所见相似。结肠细胞的ECGI迁移至约50KD处，不太显著的条带在大约47和43KD处。卵巢细胞的ECGI迁移至大约60KD处。
编码ECGI的核酸序列本发明的核酸序列在本文中定义为编码上述定义的ECGI蛋白的核酸序列。编码ECGI蛋白的核酸序列与编码乳房抑制素的核酸序列有显著的序列同源性，它们能在高度严谨的条件下与编码乳房抑制素的核酸序列杂交。
乳房抑制素样上皮细胞生长抑制剂优选在编码乳房抑制素的核酸序列的大约1000个毗连的核苷酸内具有基本上的相同性(至少有90％，较佳的有至少95％相同)。编码乳房抑制素的核酸包括MammA(PCT/US97/18026，ATCC#97451，1996年2月22日保藏)；MammB(PCT/US97/27147，ATCC#PTA-2091，2000年6月15日保藏)；和本文描述的MammC(ATCC#PTA-2090，2000年6月15日保藏)的DNA插入物。已知乳房抑制素克隆所测得的共有序列显示在下文序列对比表5以及SEQ IDNO1(MammA)；SEQ ID NO2(MammB)；SEQ ID NO3(MammC)中。前列腺ECGI核酸序列(SEQ ID NO4)显示在表1、2和5中。
ECGI可从特异性上皮细胞核酸文库扩增得到，例如采用内部乳房抑制素引物和/或在严谨条件下与乳房抑制素杂交。如下文所更详细描述的那样，与乳房抑制素杂交的核酸序列已经显示存在于许多上皮组织(包括中枢神经系统、心脏、小肠、大肠、阑尾、直肠、淋巴细胞、骨髓细胞、肺和气道、膀胱、子宫、前列腺、睾丸、卵巢、肝、胰、肾上腺、唾液腺和乳腺)中(见图1)。
从例如前列腺细胞中分离出的ECGI的核酸序列与乳房抑制素在分子5′端有95％以上的相同性，然而，在3′端有很少或没有序列相同性。预计与乳房抑制素有相同性的5′端含有该分子的生长抑制性结构域，而与乳房抑制素相同性很少的3′端含有组织特异性结构域。
诊断方法本发明还提供一种检测患者样品(包括组织、细胞和体液)中活性抑制性ECGI的体外试验。通过将患者样品中ECGI蛋白的存在及类型与正常或癌性人上皮细胞相关联，可诊断上皮细胞癌和晚期转移性疾病。分析患者血液或组织样品中的ECGI蛋白，例如分析ECGI蛋白的丰度和/或其分子量形式。如下所述，ECGI、尤其是较高分子量的磷酸化形式的缺少或丢失与表明晚期转移性疾病的特异性上皮细胞相关联。
用各种已知的分析工具和方法(包括免疫试验、杂交、PCR技术等)可分析ECGI。较佳的方法是用抗ECGI抗体通过免疫试验(包括ELISA、Western印迹和斑点印迹)来分析患者样品。优选采用重组ECGI标准品来提供标准曲线，以可靠地定量检测抑制剂的水平。在下文实施例中，列举了斑点印迹试验和Western印迹试验作为这些免疫试验的典型。在本发明的另一个较佳的实施方案中，用免疫组织化学法或通过培养患者肿瘤细胞并检测培养物的ECGI表达来分析组织样品(如肿瘤活检物)。
在一个特别佳的实施方案中，诊断上皮细胞癌的试验包括至少两种特异性抗体一种鉴定取样组织为上皮组织的抗体，如抗细胞角蛋白抗体，和一种抗ECGI特异性抗体。例如，利用免疫印迹形式，将怀疑含有前列腺癌细胞的前列腺组织匀浆，在SDS/PAGE凝胶上分离，转移到膜上，用抗角蛋白抗体和抗前列腺ECGI抗体检测。用与合适标记系统(如过氧化物酶或碱性磷酸酶)偶联的同种型特异性二抗来检测结合的抗体。然后用已知的比色技术或荧光技术使含有结合的第一和第二抗体的膜显影，并用已知方法定量测定。
在最佳的实施方案中，用抗ECGI抗体通过例如Western印迹来分析样品中ECGI的大小和/或磷酸化形式。高分子量ECGI蛋白形式的减少或缺失与晚期癌症相关联。
本发明的诊断试剂盒包括ECGI蛋白或编码ECGI的核酸序列(例如作为对照)。该诊断试剂盒任选地含有能与待检测或待定量测定的上皮细胞ECGI结合的一种或多种抗体。抗体能结合乳房抑制素样结构域(例如7G6)，或可以是组织特异性的ECGI抗体。或者，诊断试剂盒包括用来扩增和/或检测编码上皮细胞ECGI的核酸序列的一种或多种扩增引物或杂交探针(例如用于下文实施例的探针)。
治疗用途用于治疗用途的ECGI蛋白由上皮细胞培养物在无血清条件下或通过重组方法产生。较佳的，ECGI蛋白在酵母或较高等的真核细胞中产生，以实现该蛋白的磷酸化。重组蛋白由宿主细胞产生或通过合成方法产生。
功能性ECGI可通过已知的磷蛋白给药方法来给药，较佳的是注射给药，以提高血液中的抑制剂水平，增加抑制剂与所需上皮的相互作用。
该蛋白可用磷酸化蛋白质药物输送领域已知的方法输送给患者。通常，将该抑制剂与输送赋形剂混合，然后注射给药。
抑制剂的给药剂量可由本领域技术人员决定，它因治疗的类型和疾病严重程度而异。由于乳房抑制素在体外以10毫微克/毫升浓度能抑制大约50％乳房癌细胞生长，以20-25毫微克/毫升浓度能使乳房癌细胞生长停止，因此ECGI的有用治疗剂量范围为每日给予约2.5微克至250微克。较佳的是每日给予约125微克的剂量。给药的目的是使最终的体剂量在生理范围(例如15-50毫微克/毫升)或稍高的范围(例如25-75毫微克/毫升)内。对于临床使用，较佳的剂量范围是对转移性疾病的最初治疗为大约500毫微克/毫升，然后维持剂量约为50毫微克/毫升。在采用乳房抑制素的临床研究中，每日给药量约为50-750毫微克/毫升就足以诱导IV期乳房癌患者的缓解。
由于活性ECGI是磷酸化蛋白，预计需要多剂量的该抑制剂，以维持患者血液中ECGI的生长抑制水平的ECGI。另外，由于ECGI通常起细胞抑制剂作用而不是杀细胞剂作用，因此预计该抑制剂的最大效应需要经常维持上皮细胞癌患者的抑制剂水平。
在此较佳的应用中，ECGI以高剂量(大于50毫微克/毫升，较佳的约为50-500毫微克/毫升)给予，以诱导肿瘤退变。较低的维持剂量(小于50毫微克/毫升，较佳的为20-50毫微克/毫升)用来预防癌细胞生长。
将乳房抑制素给予IV期乳房癌患者的临床实验提示了维持血液中乳房抑制素生理水平的有用剂量。给药宜每日进行，但是可以是例如通过慢释点滴连续输液，或每2-3日注射一次。证据提示，连续给药可能诱导反馈抑制。因此，较佳的给药方案是给予日剂量的乳房抑制素，持续大约25-28天，然后2-5天内不给药。
诊断试验本发明检测人组织和血清中起作用的抑制剂的存在与否的试验可用来筛检上皮细胞癌患者，筛检具有发展成上皮细胞癌的高度危险的人群，检测上皮癌的早期发作，以及在治疗期间监测患者的抑制剂水平。例如，分析患者的血液ECGI可能会显示，与正常对照或患者以前的前列腺ECGI分布情况相比，高分子量的磷酸化的前列腺ECGI的含量降低。这种变化与前列腺癌的危险性增加、前列腺癌的早期发作以及晚期转移性前列腺癌相关。磷酸化的具有活性的55kD的前列腺ECGI的诊断试验宜是采用特异性抗ECGI抗体的Western印迹免疫试验或是ELISA。例如，血清筛检宜用免疫试验(如ELISA、Western印迹或斑点印迹试验)来进行。
对于最佳的结果，患者样品应在取样后短时间内(1周内)进行试验，保藏于4℃下(少于1年)，或长期冷冻保藏。最佳的是，将样品冷冻至进行试验。
实施例参考下列实施例将能更好地理解本发明，但本发明并不以任何方式局限于这些实施例。
实施例1ECGI的多组织表达在多组织表达阵列(Clonetech，Inc.#7775-1)上进行Northern印迹分析，以证实ECGI在各种上皮细胞组织中的表达。用含有pMammC3′区域的大约1800碱基对(SEQID NO3，大约核苷酸359-末端)的地高辛标记的乳房抑制素EcoR1片段作为探针。使DIG标记的乳房抑制素cDNA在10毫升easy HYB溶液(Roche)中与该阵列65℃杂交16小时，65℃洗涤，按照生产商说明书，与抗DIG抗体杂交，用CSPD显影。然后将印迹室温曝光Kodak X-OMAT膜30分钟。
多组织表达阵列的组织平面图显示在图1A中。乳房抑制素cDNA与该阵列的mRNA杂交显示在图1B中，该图显示了表达乳房抑制素样ECGI序列的上皮细胞组织的种类。与乳房抑制素cDNA杂交的特异性组织包括中枢神经系统、心脏、小肠、大肠、阑尾、直肠、淋巴细胞、骨髓细胞、肺和气道、膀胱、子宫、前列腺、睾丸、卵巢、肝、胰、肾上腺、唾液腺和乳腺。
实施例3正常的前列腺细胞和癌性前列腺细胞培育外科样品所得正常的前列腺细胞和从美国典型培养物保藏中心(ACTT)获得的癌性前列腺细胞LnCap，分析前列腺ECGI的产生。细胞在含有40μM钙、添加了5％Chelex处理过的马血清、10毫微克/毫升EGF、10微克/毫升胰岛素、100毫微克/毫升霍乱毒素和1微克/毫升氢化可的松的DMEM/F12培养液中培养4天。然后收集条件培养液样品并分析。
使患者样品获得的正常人乳房细胞在相同培养基中培育，采用分泌到培养液中的乳房抑制素作为对照。另外分析乳房癌患者获得的血清并用作对照。
收集液体样品，通过抽吸加载到斑点印迹装置上的硝化纤维素膜上。然后用抗乳房抑制素抗体7G6检测该膜，用碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠抗体检测抗体结合。用NBT/BCIP底物系统(Life Technologies)显色。结果显示在图2中。
抗乳房抑制素抗体能识别正常前列腺细胞产生而癌性前列腺细胞不能产生的一种蛋白质。这与该抗体能识别由正常乳房细胞产生而乳房癌细胞不能产生的乳房细胞生长抑制剂乳房抑制素相似。该数据结合实施例1中的数据，证明在其它上皮细胞组织中、尤其是前列腺细胞中产生了乳房抑制素样ECGI。
实施例3ECGI在前列腺、结肠和卵巢中的差异性表达前列腺如上述实施例2所述，培育正常前列腺细胞(Clonetech，Inc.)、LnCap前列腺癌细胞(ATCC)、MCF7乳房癌细胞(ATCC)和正常人乳房细胞(从医院组织获得)。培育至少48小时后，使细胞在加样缓冲液中裂解，用抗乳房抑制素抗体7G6作为探针，用Western印迹分析ECGI的存在。用正常人乳房细胞蛋白(NHMC)裂解液(1毫克/毫升)作为乳房抑制素对照(A)。数据显示在图3中。
正常前列腺细胞裂解液(D)含有能被抗乳房抑制素抗体识别的蛋白质，而前列腺癌细胞(LnCap)(B)和乳房癌细胞(MCF7)(C)没有该蛋白。前列腺细胞裂解液(D)中识别的蛋白质其大小与乳房抑制素(A)相似。结肠和前列腺如上述实施例2所述，培育正常前列腺细胞(Clonetech，Inc.)、LnCap前列腺癌细胞(ATCC)、Sw 948结肠癌细胞(ATCC)和正常结肠上皮细胞(从患者外科手术组织获得)。在加样缓冲液中制备细胞裂解液，用抗乳房抑制素抗体7G6作为探针，用Western印迹分析ECGI的表达。
如图4所示，正常前列腺(A)和正常结肠(C)上皮细胞表达了可被抗乳房抑制素抗体识别的一种蛋白质，而这些组织的癌细胞(B，D)不能表达该蛋白质。蛋白质的差异性表达与乳房组织中乳房抑制素所显示的相似。另外，正常前列腺和结肠组织Western印迹显示的条带图案与正常人乳房细胞产生的乳房抑制素所见的磷酸化图案相似。图中显示一条较大的主条带和两条较小较模糊的条带。该图案与乳房抑制素的磷酸化有关。
Western印迹分析(图4)显示出前列腺ECGI具有大约51千道尔顿的分子量；结肠ECGI显示具有大约50千道尔顿的分子量。卵巢如以上实施例2所述，培育OvCar-卵巢癌细胞(ATCC)、正常人卵巢细胞(患者外科手术组织)和正常人乳房细胞(患者外科手术组织)。培育至少48小时后，除去生长培养基，用盐水和SDS-PAGE加样缓冲液清洗细胞直至粘稠，制得直接的裂解液。收集裂解液，在10％SDS-PAGE上分离，电泳转移到硝化纤维素膜上，用7G6抗乳房抑制素抗体检测。数据显示在图5中，其中泳道A含有分子量标准品；B是OvCar卵巢癌细胞裂解液；C是正常人卵巢细胞裂解液；D是正常人乳房细胞裂解液。
图5证明该乳房抑制素样ECGI蛋白由正常人卵巢组织产生，并被抗乳房抑制素抗体识别。该蛋白在所分析的卵巢癌细胞中不表达。卵巢ECGI的分子量大约为60千道尔顿。
实施例4血液中前列腺ECGI的差异性检测分析了三位健康男性志愿者的血清样品中前列腺ECGI的存在，并将其与前列腺癌患者的血清比较。血清样品以400微升和200微升样品加样，一式两份。利用真空将样品吸到96孔斑点印迹装置中的硝化纤维素膜上。然后用抗乳房抑制素抗体7G6检测滤膜，用NBT/BCIP底物显色。数据显示在图6中。
正常人乳房细胞(NHMC)培养物产生的标准品条件培养液用来比较。一式两份的标准品含有400、200、100、50、25、12和6微升NHCM培养液。对健康成年男性(A，C，D)以及前列腺癌成年患者(B)的血清样品进行试验，采用400和200微升血清样品。正常血清(A，C，D)有明显的信号表明存在前列腺ECGI，而前列腺癌患者的血清显示只有微弱的信号。
实施例5前列腺ECGI的抑制活性将正常前列腺细胞(Clonetech，Inc.)、PC3和LnCap前列腺癌细胞(ATCC)以每毫升5.0×104细胞的密度接种于含10％胎牛血清的RPMI培养基的12孔板中。24小时后，在培养物中添加10％条件培养液。每个样品一式三份进行。平板于37℃、5％CO2下培育6天，培养期末，用溴棕三甲铵(Cetrimide)使细胞裂解，用Colter计数器计数。比较经处理的和未经处理的孔，计算抑制百分数，数据显示在下表中。雄激素不敏感的PC3细胞未被正常前列腺细胞培养液或正常前列腺细胞所得的条件培养液所抑制。相反，LnCap细胞被加入的生长培养液所抑制，正常前列腺获得的培养液的抑制程度一定程度上大于癌细胞获得的培养液。
实施例6前列腺ECGIDNA的分离和鉴定从正常前列腺细胞(患者外科手术组织)以及LnCap前列腺肿瘤细胞(ATCC)的mRNA产生核酸文库。
将正常前列腺细胞和前列腺癌细胞文库的核酸序列插入载体中，用来转化细菌。如上所述，通过在严谨条件下与地高辛标记的乳房抑制素核酸探针杂交，筛选出能表达正常的和癌性前列腺细胞核酸序列的细菌菌落。
选出阳性菌落，在LB肉汤中生长。纯化从阳性菌落获得的质粒，用ECO R1和Xho1消化，以释放出cDNA插入物。然后在1％琼脂糖凝胶(见图7A)上分离经消化的DNA，用地高辛标记的乳房抑制素片段作为探针，对分离的DNA进行Southern印迹分析。如图7所示，分离出两个前列腺ECGI克隆，每个克隆具有大约2kb的大小；一个克隆从正常前列腺组织文库(PRN2.1)中分离得到，一个从LnCap前列腺肿瘤细胞文库(PRT-6)分离得到。
对PRT-6作进一步特性鉴定，测定其核酸序列。如下表1所示，编码前列腺ECGI的核酸序列在分子5′端与乳房抑制素基本相同(大于90％)，而在分子的3′端有很少的或没有相同性。这些相似和不同的区域用图表显示在图8中。
实施例7前列腺ECGI DNA的分离和特性鉴定从正常前列腺细胞(从患者外科手术组织获得)以及LnCap前列腺肿瘤细胞(ATCC)的mRNA构建核酸文库。用文库cDNA来转化大肠杆菌，并接种进行菌落杂交。采用用下列外部PCR引物M200和M2200[SEQ ID NO5]M200GCGCCGGCCGGGCGCGACCCG[SEQ ID NO6]M2200GCAATCTCAGCGCACTGCTGC作PCR产生地高辛标记的乳房抑制素C片段来筛选菌落。
如上所述，表达前列腺ECGI克隆的细菌菌落在严谨杂交条件下能与标记的乳房抑制素探针杂交。
实施例8前列腺ECGI的同源性将前列腺ECGI序列对照GenBank中的核酸序列进行分析。28SmRNA和Hip55这两个分子的一部分显示出与前列腺ECGI序列中的结构域有一些相似性。
28SmRNA的同源性已被鉴定存在于许多重要的生长调节基因序列中(Hu等人，1999，PNAS961339-1344；Mauro等人，1997，PNAS 94422-427)。Hip55是一种能与造血先祖1型激酶(一种参与src信号转导通道的蛋白质)结合的蛋白质(Ensena等人，1999，J.Biol.Chem.27433945-50)。
利用Hip55的已知开放读框，推定出该前列腺克隆的推定氨基酸序列。如下表3所示，该翻译物包括几个内部中止密码子。
另外，利用Hip55 ORF，推定出MammB和MammC序列的推定氨基酸序列，如表4和5所示。
表1pMammC和前列腺ECGI
表2前列腺ECGI同源性
表3推定的前列腺ECGI氨基酸序列H E I P T V P T Y Y P A K P Q1GCACGAGATT CCCACTGTCC CTACCTACTA TCCAGCGAAA CCACAGCCAACGTGCTCTAA GGGTGACAGG GATGGATGAT AGGTCGCTTT GGTGTCGGTT· E R A W R N Q R G K K T L L S51GGGAACGGGC TTGGCGGAAT CAGCGGGGAA AGAAGACCCT GTTGAGCTTGCCCTTGCCCG AACCGCCTTA GTCGCCCCTT TCTTCTGGGA CAACTCGAACT L V W H G E E T * E V * N K W101ACTCTAGTCT GGCACGGTGA AGAGACATGA GAGGTGTAGA ATAAGTGGGATGAGATCAGA CCGTGCCACT TCTCTGTACT CTCCACATCT TATTCACCCT·A P G A P P V S P R G A R G G151GGCCCCCGGC GCCCCCCCGG TGTCCCCGCG AGGGGCCCGG GGCGGGGTCCCCGGGGGCCG CGGGGGGGCC ACAGGGGCGC TCCCCGGGCC CCGCCCCAGG· R P C G P P V K Y H Y S D R F201GCCGGCCCTG CGGGCCGCCG GTGAAATACC ACTACTCTGA TCGTTTTTTCCGGCCGGGAC GCCCGGCGGC CACTTTATGG TGATGAGACT AGCAAAAAAGT D P V R R G G E P R G A L A S251ACTGACCCGG TGAGGCGGGG GGGCGAGCCC CGAGGGGCTC TCGCTTCTGGTGACTGGGCC ACTCCGCCCC CCCGCTCGGG GCTCCCCGAG AGCGAAGACC·A K R P A A R R P G A T R S G301CGCCAAGCGC CCGGCCGCGC GCCGGCCGGG CGCGACCCGC TCCGGGGACAGCGGTTCGCG GGCCGGCGCG CGGCCGGCCC GCGCTGGGCG AGGCCCCTGT· A R W G V * L G R Y T C Q T V351GTGCCAGGTG GGGAGTTTGA CTGGGGCGGT ACACCTGTCA AACGGTAACGCACGGTCCAC CCCTCAAACT GACCCCGCCA TGTGGACAGT TTGCCATTGCQ V S * G E L R E D R N L P W S401CAGGTGTCCT AAGGCGAGCT CAGGGAGGAC AGAAACCTCC CGTGGAGCAGGTCCACAGGA TTCCGCTCGA GTCCCTCCTG TCTTTGGAGG GCACCTCGTC·R A K A R L I L I F S T N T D451AAGGGCAAAA GCTCGCTTGA TCTTGATTTT CAGTACGAAT ACAGACCGTGTTCCCGTTTT CGAGCGAACT AGAACTAAAA GTCATGCTTA TGTCTGGCAC· S G A S R S F * P F G F * A G501AAAGCGGGGC CTCACGATCC TTCTGACCTT TTGGGTTTTA AGCAGGAGGTTTTCGCCCCG GAGTGCTAGG AAGACTGGAA AACCCAAAAT TCGTCCTCCAV R K VT T G I T G L W R P S V551GTCAGAAAAG TTACCACAGG GATAACTGGC TTGTGGCGGC CAAGCGTTCACAGTCTTTTC AATGGTGTCC CTATTGACCG AACACCGCCG GTTCGCAAGT·S D V A F * S F D V G S S Y H601TAGCGACGTC GCTTTTTGAT CCTTCGATGT CGGCTCTTCC TATCATTGTGATCGCTGCAG CGAAAAACTA GGAAGCTACA GCCGAGAAGG ATAGTAACAC· A E F T K R W I V H P L I G N651AAGCAGAATT CACCAAGCGT TGGATTGTTC ACCCACTAAT AGGGAACGTGTTCGTCTTAA GTGGTTCGCA ACCTAACAAG TGGGTGATTA TCCCTTGCACS W D * T V V R Q V S F T L L M701AGCTGGGATT AGACCGTCGT GAGACAGGTT AGTTTTACCC TACTGATGATTCGACCCTAA TCTGGCAGCA CTCTGTCCAA TCAAAATGGG ATGACTACTA·C C C H G N P A Q Y E R N R R751GTGTTGTTGC CATGGTAATC CTGCTCAGTA CGAGAGGAAC CGCAGGTTCACACAACAACG GTACCATTAG GACGAGTCAT GCTCTCCTTG GCGTCCAAGT· H L V Y V L G * G A N G A K L801GACATTTGGT GTATGTGCTT GGCTGAGGAG CCAATGGGGC GAAGCTACCA
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表4推定的MannC氨基酸序列I R H E H GE E T * E V * N K1 GAATTCGGCA CGAGCACGGT GAAGAGACAT GAGAGGTGTA GAATAAGTGGCTTAAGCCGT GCTCGTGCCA CTTCTCTGTA CTCTCCACAT CTTATTCACCE A P G A P P V S P R G A R G G51 GAGGCCCCCG GCGCCCCCCC GGTGTCCCCG CGAGGGGCCC GGGGCGGGGTCTCCGGGGGC CGCGGGGGGG CCACAGGGGC GCTCCCCGGG CCCCGCCCCA·R R P C G P P V K Y H Y S D R101CCGCCGGCCC TGCGGGCCGC CGGTGAAATA CCACTACTCT GATCGTTTTTGGCGGCCGGG ACGCCCGGCG GCCACTTTAT GGTGATGAGA CTAGCAAAAA· T D P V R R G G E P R G A L A151TCACTGACCC GGTGAGGCGG GGGGGCGAGC CCCGAGGGGC TCTCGCTTCTAGTGACTGGG CCACTCCGCC CCCCCGCTCG GGGCTCCCCG AGAGCGAAGAG A K R P A A R R P G A T R S G201GGCGCCAAGC GCCCGGCCGC GCGCCGGCCG GGCGCGACCC GCTCCGGGGACCGCGGTTCG CGGGCCGGCG CGCGGCCGGC CCGCGCTGGG CGAGGCCCCT·S A R W G V * L G R Y T C Q T251CAGTGCCAGG TGGGGAGTTT GACTGGGGCG GTACACCTGT CAAACGGTAAGTCACGGTCC ACCCCTCAAA CTGACCCCGC CATGTGGACA GTTTGCCATT· Q V S * G E L R E D R N L P W301CGCAGGTGTC CTAAGGCGAG CTCAGGGAGG ACAGAAACCT CCCGTGGAGCGCGTCCACAG GATTCCGCTC GAGTCCCTCC TGTCTTTGGA GGGCACCTCGR R A K A R L I L I F S T N T D351AGAAGGGCAA AAGCTCGCTT GATCTTGATT TTCAGTACGA ATACAGACCGTCTTCCCGTT TTCGAGCGAA CTAGAACTAA AAGTCATGCT TATGTCTGGC·E S G A S R S F * P F G F * A401TGAAAGCGGG GCCTCACGAT CCTTCTGACC TTTTGGGTTT TAAGCAGGAGACTTTCGCCC CGGAGTGCTA GGAAGACTGG AAAACCCAAA ATTCGTCCTC· V R K V T T G I T G L W R P S451GTGTCAGAAA AGTTACCACA GGGATAACTG GCTTGTGGCG GCCAAGCGTTCACAGTCTTT TCAATGGTGT CCCTATTGAC CGAACACCGC CGGTTCGCAAH S D V A F * S F D V G S S Y H501CATAGCGACG TCGCTTTTTG ATCCTTCGAT GTCGGCTCTT CCTATCATTGGTATCGCTGC AGCGAAAAAC TAGGAAGCTA CAGCCGAGAA GGATAGTAAC·E A E F T K R W I V H P L I G551TGAAGCAGAA TTCACCAAGC GTTGGATTGT TCACCCACTA ATAGGGAACGACTTCGTCTT AAGTGGTTCG CAACCTAACA AGTGGGTGAT TATCCCTTGC· S W V * T V V R Q V S F T L L601TGAGCTGGGT TTAGACCGTC GTGAGACAGG TTAGTTTTAC CCTACTGATGACTCGACCCA AATCTGGCAG CACTCTGTCC AATCAAAATG GGATGACTACM C C C H G N P A Q Y E R N R R651ATGTGTTGTT GCCATGGTAA TCCTGCTCAG TACGAGAGGA ACCGCAGGTTTACACAACAA CGGTACCATT AGGACGAGTC ATGCTCTCCT TGGCGTCCAA·R H L V Y V L G * G A N G A K701CAGACATTTG GTGTATGTGC TTGGCTGAGG AGCCAATGGG GCGAAGCTACGTCTGTAAAC CACATACACG AACCGACTCC TCGGTTACCC CGCTTCGATG· S V G L * L N A S K S E S R P751CATCTGTGGG ATTATGACTG AACGCCTCTA AGTCAGAATC CCGCCCAGGCGTAGACACCC TAATACTGAC TTGCGGAGAT TCAGTCTTAG GGCGGGTCCGG T I R Q R R G A S V G L G * P801GGAACGATAC GGCAGCGCCG CGGAGCCTCG GTTGGCCTCG GATAGCCGGTCCTTGCTATG CCGTCGCGGC GCCTCGGAGC CAACCGGAGC CTATCGGCCA
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表5比较MannA.MammB.MannC.前列腺
权利要求
1.一种乳房抑制素样上皮细胞生长抑制剂，该分子的至少三分之一与乳房抑制素有显著的序列相同性。
2.根据权利要求1所述的抑制剂，其中上皮细胞是中枢神经系统、心脏、小肠、大肠、阑尾、直肠、淋巴细胞、骨髓细胞、肺和气道、膀胱、子宫、前列腺、睾丸、卵巢、肝、胰、肾上腺、唾液腺和乳腺。
3.一种编码上皮细胞生长抑制剂的核酸序列，该抑制剂抑制非乳房上皮细胞的生长，其中该核酸序列可用乳房抑制素衍生获得的内部PCR引物从正常非乳房上皮细胞扩增得到。
4.根据权利要求3所述的核酸序列，其中上皮细胞是结肠、卵巢、前列腺、脾、睾丸或胸腺细胞。
5.一种检测上皮细胞癌的方法，该方法包括分析体液中是否存在权利要求1所述的蛋白质或权利要求3所述的核酸序列或其含量；和将所述蛋白质或所述核酸序列的减少或缺失与上皮细胞癌相关联。
6.一种治疗患者上皮细胞癌的方法，该方法包括给予患者权利要求1所述的蛋白质或权利要求3所述的核酸。
7.一种诊断试剂盒，它包含权利要求1所述的蛋白质和/或权利要求4所述的核酸序列；以及任选的特异性结合权利要求1所述的蛋白质的抗体。
全文摘要
上皮细胞生长抑制剂在正常和癌性上皮细胞中差异表达。可采用ECGI蛋白及编码该蛋白的核酸序列来诊断和治疗上皮细胞癌，例如前列腺、卵巢、结肠癌等。
文档编号A61K48/00GK1399680SQ00811779
公开日2003年2月26日 申请日期2000年6月19日 优先权日1999年6月18日
发明者P·R·小欧文 申请人:生物治疗股份有限公司